פרוטוקול מבוסס מיקרודיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין
16 בדצמבר 2021
פרוטוקול חזק מוצג כאן לבידוד גרגירי נוירומלנין מרקמות אנושיות שלאחר המוות nigra pars compacta באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. פרוטוקול מתוקן וממוטב זה ממזער באופן מסיבי את הזמן הנדרש לאיסוף הדגימה, מפחית את כמות הדגימה הנדרשת ומשפר את הזיהוי והכימות של חלבונים על ידי ניתוח LC-MS/MS.
השילוב שלנו של מיקרו-דיסקציה בלייזר וספקטרומטריית מסה מאפשר לחקור שינויים שנפתרו מרחבית ברמה הפרוטאומית בכל סוג של רקמה. במקרה שלנו, גרגירי נוירומלנין. הפרוטוקול שלנו מאפשר ניתוח פרוטאומי המבוסס על חומר מדגם מוגבל.
וזה בדרך כלל אתגר גדול בעבודה עם רקמת מוח לאחר המוות. מכיוון שניתן לבודד תאים בודדים כדי להשוות בין מצבים בריאים למחלות ברמה הפרוטאומית. זה עשוי לשפר את ההבנה שלנו לגבי מנגנוני מחלה.
כדי להתחיל, הנח את שקופית קרום הרקמה במחזיק השקופיות על שלב הרובו כאשר הרקמה פונה כלפי מעלה. כדי לרכוש סריקת סקירה כללית של סעיף הרקמות. השתמש בפונקציית הסריקה, בחר את אזור העניין מהפינה השמאלית העליונה ומהפינה הימנית התחתונה.
לאחר מכן בחר סרוק את כל ה- ROIs כדי לבצע את הסריקה. עבור הבחירה האוטומטית של גרגירי נוירומלנין בשדה הראייה הנוכחי. בחר ניתוח שדה תצוגה.
לאחר מכן בחרו באפשרות 'הפוך תוצאה' וקבעו את הסף לערוצי RGB. כך שרק גרגירי נוירומלנין מודגשים באדום בחלון התצוגה המקדימה. עכשיו לחץ על בסדר, כדי להשתמש בהגדרות המותאמות לשדה הראייה.
התאם את הגדרות הלייזר באמצעות אזור בשקופית המכוסה על-ידי הממברנה בלבד. מלא את מכסה צינור איסוף הדגימה ב -50 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים. והכניסו את הכובע לאספן של הרובו.
באמצעות ממשק התוכנה, מקם את ה-robo mover מעל שלב הרובו השני כדי להתחיל באיסוף הדגימות. הפעל את הלייזר. שלוט בהגדרות האנרגיה והמיקוד במהלך תהליך הלייזר והתאם את ההגדרות במידת הצורך.
הקפידו על בידוד וקטפולטציה נאותים של החפצים המבודדים לתוך מכסה צינור איסוף הדגימות עבור לפחות 10 האובייקטים הראשונים. לאחר השלמת הדגימה, נווט את ה- robo mover למיקום ההתחלה שלו והסר את צינור איסוף הדגימה. לאחר סיבוב הדגימות על ידי צנטרציה.
יבשו את הדגימות במשך שעה וחצי ברכז ואקום. לאחר ביצוע עיכול טריפטי כמתואר בטקסט. הכן את הדגימה לניתוח HPLC-MS על ידי המסת 200 עד 400 ננוגרם של פפטידי דגימה בנפח מוגדר של 0.1% TFA.
בפתחי בקבוקוני זכוכית ספקטרומטריים בעלי מסה אינרטית. אם קביעת הריכוז אינה ישימה בשל כמות מדגם נמוכה. ודא טעינת דגימה זהה על-ידי השוואת זרם היונים הכולל.
כדי להתחיל בניתוח נתונים גולמיים פרוטאומיים. לחץ על טען לטעינת הקבצים הגולמיים לתוכנה. לחץ על סט ניסוי כדי להקצות את שמות הדוגמאות.
כדי להגדיר פרמטרים ספציפיים לקבוצה. הוסף את השינויים על ידי בחירה ב-NQ, חמצון M וקרבמידומתילציה N-term כשינויים משתנים. ולאחר מכן להוסיף קרבמידומתילציה C כשינוי קבוע.
בחר טריפסין כאנזים עיכול בכרטיסיית העיכול. בכרטיסייה כימות ללא תוויות, הוסף את האפשרות LFQ ואם יש לעבד יותר מ -10 קבצים, בחר באפשרות LFQ מהירה כדי לקצר את זמן העיבוד. הבטחה שכל שאר הפרמטרים הספציפיים לקבוצה יישארו בהגדרות היצרן.
המשך לכרטיסייה פרמטרים כלליים והוסף את קובץ FASTA הנגזר מ- uniprot. בכרטיסייה רצפים. שנה את כלל המזהה בהתאם.
והוסף את מזהה הטקסונומיה 9606 עבור הומו ספיינס. לכימות חלבונים בחרו פפטידים ייחודיים וסכיני גילוח. לאחר מכן הוסף את אפשרות iBAQ כמדד לכימות חלבונים בכרטיסיית הכימות ללא תוויות.
ודא שכל שאר הפרמטרים הגלובליים נשארים בהגדרות היצרן ולחץ על התחל. לאחר שהניתוח בוצע בהצלחה לאחזר את קבוצות החלבון. פלט txt.
טען את קבוצות החלבון. קובץ txt בתוכנת הניתוח. הוסף את ערכי iBAQ כעמודות ראשיות ומיין את כל העמודות האחרות לפי סוגן.
סנן פיתיונות ומזהמים על-ידי סינון שורות בהתבסס על העמודה הקטגוריאלית וסינון תוצאות בהתבסס על ערכים חוקיים. ייצא את הפלט בפורמט txt לעיבוד נוסף. ולהעריך את התוצאות לגבי שאלת המחקר.
במחקר הנוכחי, 1, 898 קבוצות חלבונים זוהו ב- NMGs ו- 1, 565 זוהו ברקמת SN שמסביב מתוכם 1, 384 זוהו בשני אזורי הרקמות. לפיכך 514 ו -181 קבוצות חלבונים זוהו באופן בלעדי ברקמות NMG ו- SN בהתאמה. במדידות DDA המייצגות.
ערכי iBAQ מעט גבוהים יותר ב- NMGs בהשוואה ל- SN הצביעו על שפע גבוה יותר של החלבון cytoplasmic dynien-1, שרשרת כבדה 1 ב- NMGs. תצפית זו יכולה להיות מאומתת בניסויי PRM עבור הפפטיד ESPEVLLTLDILK. שבו זוהה שפע גבוה יותר ב- NMGs.
מבוסס על אזור השיא ברמת MS1 ו- MS2. הצעד החשוב ביותר הוא ללא ספק בידוד של NMGs, כמו שאר הפרוטוקול מבוסס על שלב זה כדי להתבצע כראוי. לאחר הליך LMD, ניתן להשתמש בדגימות ובתהליך נוסף עבור כל סוג של טכניקת אומיקה כגון גנומיקה, תעתיק, פרוטאומיקה או ליפידומטיקה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול חסון לבידוד גרנולות נוירומלאנין מרקמות post-mortem של ה-substantia nigra pars compacta אנושית באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר. הגישה האופטימלית מקצרה משמעותית את זמן איסוף הדגימות ואת הכמות הנדרשת, ובמקביל משפרת את זיהוי החלבונים והכמות שלהם באמצעות אנליזת LC-MS/MS.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- פרוטאומיקה
- ניתוח מוח לאחר המוות
רקע
- בידוד של גרנולות נוירומלנין לצורך אנליזה היווה אתגר היסטורי.
- שיטות מסורתיות דורשות דגימות גדולות יותר וזמני איסוף ממושכים.
- מיקרודיסקציה בלייזר מאפשרת בידוד מדויק ברמה של תא בודד.
- פרוטוקול זה נועד לשפר את ההבנה של מנגנוני מחלה במצבים נוירולוגיים.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של בידוד גרנולות נוירומלאנין לצורך אנליזה פרוטאומיקה.
- לצמצום דרישות הדגימה והפחתת זמן האיסוף מרקמות לאחר המוות (post-mortem).
- לשיפור הגילוי של חלבונים הקשורים למצבי בריאות ומחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש במיקרודיסקציה לייזר כדי לבודד גרנולות של נוירומלנין מרקמת מוח אנושית.
- המודל כלל רקמה של substantia nigra לאחר המוות.
- שולב תהליך עבודה מפורט של LC-MS/MS לצורך זיהוי חלבונים.
- הודגש המעורבות של שלבים קריטיים כגון בחירה אוטומטית וכיוונון הגדרות הלייזר.
- הניתוח הפרוטאומי כלל תיקוף מול שיטות מבוססות לכימות חלבונים.
תוצאות עיקריות
- 1,898 קבוצות חלבונים זוהו בגרנולות נוירומלנין, עם דפוסי ביטוי מובחנים בהשוואה לרקמה הסובבת.
- ממצאים ראויים לציון כוללים ערכי iBAQ גבוהים יותר בגרנולות נוירומלנין עבור חלבונים ספציפיים.
- השיטה מקלה על השוואה בין מצבים בריאים למצבי מחלה ברמה הפרוטאומיקה.
- מחקר זה מדגיש ממצאים קריטיים בנוגע להרכב החלבונים בבריאות ובפתולוגיה של המוח.
מסקנות
- המחקר מדגים גישה יעילה ומפושטת לבידוד גרנולות נוירומלנין, המשפרת את הניתוחים הפרוטאומיים.
- לשיטה המיועלת יש השלכות משמעותיות להבנת מנגנוני המחלה בהפרעות נוירולוגיות.
- יישומים נוספים עשויים להוביל להתקדמויות במסגרות קליניות ומחקריות המתמקדות בפתולוגיות הקשורות לנוירומלנין.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרו-דיסקציה בלייזר (Laser microdissection) מאפשרת ניתוח פרוטאומי ברזולוציה מרחבית של גרגירי נוירומלאנין מרקמות מוגבלות של מוח אנושי לאחר המוות, ובכך פותרת צוואר בקבוק מרכזי במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתונים פרוטאומיים רלוונטיים למחלה מנוירונים דופמינרגיים שנפגעו במחלת פרקינסון. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה בין מצבים בריאים לחולים ברמת החלבון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד גרנולות נוירומלנין לצורך פרופיל פרוטאומי ברקמות הרלוונטיות למחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: מפחית את כמות הרקמה הנדרשת באמצעות איסוף אוטומטי ולא מוטה של גרנולות, ובכך מקל על ניתוח של דגימות יקרות לאחר המוות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי זיהוי חלבונים המועשרים באופן בלעדי בגרנולות נוירומלנין בהשוואה לרקמת ה-substantia nigra שמסביבן.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של אומיקה (omics) במצב של תהליכים עוקבים, על ידי הפקת בידודים של גרנולות בדרגת טוהר גבוהה התואמות ל-LC-MS/MS.
- ערך תפעולי: מענייה על סוגיית הסטנדרטיזציה והשחזור של הבדיקה באמצעות ספי ትבחירה אוטומטיים והגדרות לייזר עקביות עבור בידוד גרנולות.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות על ידי אספקת פלטים פרוטאומיים כמותיים (iBAQ, LFQ) ממדורים עצביים רלוונטיים למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי קישור פרוטאומיקה של גרנולות נוירומלנין למצבים ניורודגנרטיביים כגון מחלת פרקינסון ודמנציה עם גופי לוי.
- ערך תפעולי: מתאר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשוואה פרוטאומיקה בין מצבים בריאים למצבי מחלה.
- ערך מדעי: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חזויה על ידי זיהוי חלבונים בעלי שפע שונה (למשל, cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) כביומארקרים תרגומיים פוטנציאליים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור מטרות מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, באמצעות אספקת נתונים פרוטאומיים ברזולוציה מרחבית מאוכלוסיות נוירונליות המושפעות מהמחלה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להשוואה פרוטאומיקה של גרנולות נוירומלאנין ושל רקמת ה-substantia nigra שמסביבן.
- סריקה: מתאר את המוכנות של הבדיקה באמצעות בחירה אוטומטית של גרנולות ואיסוף דגימות הניתן לשחזור לצורך ניתוח LC-MS/MS בהמשך.
- אנליטיקה: מדגיש את המדידות של כימות ללא תיוג (LFQ) ו-iBAQ המאפשרות לצוויות להשוות את שפע החלבונים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לפרופיל פרוטאומי של רקמה אנושית הרלוונטית לפתולוגיה של מחלת פרקינסון.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת שניתן להשתמש בה שוב עבור יישומי אומיקה (גנומיקה, טרנסקריפטומיקה, ליפידומיקה) מעבר לפרוטאומיקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במחקר של ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות תהליכי עבודה אוטומטיים של מיקרודיסקציה בלייזר.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על חתימות פרוטאומיות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בתפעול של מיקרו-דיסקציה בלייזר ובפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.
- הצרכים בתחומי המכשור והתשתית האנליטית כוללים מערכות מיקרו-דיסקציה בלייזר UV ופלטפורמות LC-MS/MS.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין-צוותית עבור ספי סף לבחירת גרנולות ופרוטוקולים להכנת דגימות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, כולל אופטימיזציה של הגדרות הלייזר עבור סוגי רקמות שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות בזמינות של רקמות לאחר המוות והשפעות פוטנציאליות של דגרדציה של חלבונים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
