שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

נוגדנים קיימים המנטרלים את AAV מהווים מחסום לקידום טיפולי הגנים של AAV. בדיקה זו היא כלי סינון לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV. היתרון העיקרי הוא שזה חסכוני, יעיל בזמן, קל להתקנה, ודורש מיומנויות טכניות מינימליות, ציוד מעבדה, ריאגנטים.

התחל ציפוי תאי HT1080 ביום הראשון על ידי דילול התאים לריכוז של 1 x 10 לתאים החמישיים למיליליטר במדיה מלאה DMEM שחוממה מראש. ואז זרעו 100 מיקרוליטרים של תאים לבאר לצלחות שטוחות וברורות עם 96 תחתית שטוחות לריכוז של 1 x 10 עד התאים הרביעיים לבאר. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לילה במשך 16 עד 22 שעות.

ביום השני, ליצור דילול סדרתי של דגימות סרום של עניין 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge באמצעות DMEM מלא שחומם מראש. לכל צינור עם דגימות סרום מדוללות, הוסף 66 מיקרוליטרים של 7.5x10 לששת הגנום הנגיפי לכל פתרון עבודה של וירוס מיקרוליטר. מערבבים את דילול סרום הנגיף על ידי צנרת ולאחר מכן למקם את הצינורות המכילים את תערובות סרום הנגיף באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות כדי לאפשר נטרול פוטנציאלי להתרחש.

לאחר 30 דקות, פיפטה 100 מיקרוליטרים של תערובת סרום הנגיף לכל באר על צלחת 96-well המכיל 1x10 עד התא הרביעי לבאר, ולאחר מכן לעטוף את הצלחת בנייר כסף למקם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% דו תחמוצת הפחמן לילה במשך 16 עד 24 שעות. ביום השלישי, שאפו את התקשורת מהבארות של צלחת 96 הבאר באמצעות ואקום ברדס אדים מבלי לשבש את התאים הדבוקים ולהוסיף 50 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde לכל באר. לאחר עטיפת הצלחת בנייר כסף, להשאיר אותו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

מאוחר יותר, לשטוף ולשאוף את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של PBS בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה השנייה, פיפטה 200 מיקרוליטרים של PBS שחומם מראש לתוך כל באר ולעטוף את הצלחת בנייר כסף ואחריו דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי denature פעילות פוספטאז אלקטורי אנדוגני, לאחר דגירה ב 50 microliters של BCIP / NBT מומס טרי לתוך כל באר לדגור על הלוחות העטופים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עד 24 שעות. מאוחר יותר, צלם תמונות של כל באר באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 4 במצלמת מיקרוסקופ אור, מה שמבטיח שימוש עקבי באותה חשיפה, איזון לבן והגדרות אור עבור כל הבדיקות.

כדי לנתח את התמונה ב- ImageJ, בחר את הקובץ ולחץ על פתח. לתמונות הצבעוניות, המר לקנה מידה אפור על-ידי בחירת הכרטיסיות תמונה, סוג ו- 8 סיביות לפי הסדר. לאחר מכן עברו לכרטיסיה 'תמונה' ובחרו 'התאם' ו'סף' כדי לשנות את הסף עד שכל האזורים הצבעוניים יצבעו ויצבעו באדום, אך הרקע לא.

לחץ על נתח והגדר מדידות וסמן את תיבות הסימון עבור אזור, שבר אזור, הגבל לסף והצג תווית לפני OK.To לקבוע את קריאת האות של באר נתונה, לחץ על נתח ומדוד כך שעמודת אזור האחוזים של החלון המוקפץ תציג את קריאת האות. המחקר קבע את המינון הנגיפי האופטימלי על ידי הוספת הגן הכתב AAV6-hPLAP בתאים במגוון ריכוזים של הגנום הנגיפי. ריבוי של זיהום של 15, 000 העניק 36% צבע צלחת ונבחר כמינון ויראלי אופטימלי.

הניתוח הייצוגי מציג את הקשר בין צבע למכפלים של זיהום. הריכוז הגבוה ביותר שנבדק שלא השפיע על המתאם הליניארי בין צבע לריכוז ויראלי הושג. המחקר של נטרול פעילות על נוגדן מונוקלונלי נגד AAV6 נגד וירוס adeno-עמית או AAV6 ב log 10 דילול הראה 50% עיכוב של טרנסדוקציה AAV6 או TI50 בריכוז של 10 ננוגרם למיליליטר.

בנטרול הנוגדנים או בדיקת NAb, מידת נטרול ה-AAV השתנתה באוכלוסיית הדגמים הנאיבית עם ערכי TI50 titre הנעים בין 1/2 ל-1/80. תוצאות הבדיקה הצביעו על כך שעכבת AAV TI50 ערכי titre לפני ניהול AAV נעה בין 1/4 ל 1/80. לאחר ניהול AAV, TI50 titre גדל בין 1/2000 ו גדול מ 1/32, 000, מדגים ניגוד ברור בערכי titre בין ממשל טרום ואחרי AAV.

בעת צילום תמונות של הבארות, חשוב להשתמש באופן עקבי באותן הגדרות מיקרוסקופ לאורך כל הבדיקה וגם לוודא כי התמונות נלקחות ישירות במרכז הבארות.