Name: שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למד שיטה איתנה לייצור ספירואידים רב-תאיים בפורמט רב-באריות לסקרינינג בעל תוכן גבוה. השיטה מאפשרת ניתוח מורפולוגי מפורט של תאים בודדים ושל המבנה הכולל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בתמיכתו של מענק מחקר תשתית מקרן המדע אירלנד (SFI) (16/RI/3745) ל- JCS. העבודה במעבדה להקרנת תאים של UCD נתמכת על ידי המכללה למדעים של UCD. ASC ממומן על ידי מועצת המחקר האירית (IRC) ממשלת אירלנד מלגת תואר שני (GOIPG/2019/68). המחברים מודים גם לכל חברי המעבדה על הקלט והדיונים המועילים שלהם. הגרפיקה באיור 1 נוצרה ב-BioRender.

1. תרבות התא
<ol><li>הכנת מדיה<ol>
<li>הכן מדיית תרבית תאים ספציפית בהתאם לסוג קו התא. ודא שכל המדיה לתחזוקת התא מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS). הערה: שורות תאים שונות משתמשות במדיה שונה. תאי קרצינומה במעי הגס HT-29 (ATCC HTB-38) גדלים ב- McCoys 5A + 10% FBS. תאי קרצינומה hepG2 hepatocellular (ATCC HB-8065) גדלים במדיום חיוני מינימלי + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. תאי קרצינומה סימפונולוגית H358 סימפונות (ATCC CRL-5807) גדלים ב-RPMI 1640 בינוני + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. כל המדיה המכילה L-גלוטמין ו- FBS נקראים מדיה מלאה. כאשר ציפוי תאים לגדול כמו spheroids, מדיום פנול אדום חינם עם 10% FBS נדרש כדי למנוע צביעה של חומר המרתף ECM, אשר בתורו יכול לגרום חפצים במהלך תהליך ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תאי תת-תרבות<ol>
<li>כאשר תאים הם כ 80% יחד, לשטוף בקצרה עם 2 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25% (w / v) טריפסין / 0.53 mM EDTA). לשאוף את טריפסין-EDTA, להוסיף 3 מ"ל של טרי-EDTA ודגור במשך 3-5 דקות ב 37 °C (37 °F).</li>
		<li>כאשר תאים מנותקים מצלחת תרבית התא, מוסיפים 7 מ"ל של מדיום מלא טרי.</li>
		<li>פיפטה 1 מ"ל של השעיית תאים לתוך צלחת חדשה של תרבית תאים 10 ס"מ ולהוסיף 9 מ"ל של מדיום שלם טרי לתת דילול של 1:10 של תאים.</li>
		<li>תרבית את התאים ב 37 °C (5° C) באינקובטור לח עם 5% CO2.</li>
		<li>תת תרבות התאים כל 3-5 ימים, בהתאם לקו התא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. דור של כדוריות
<ol><li>מעיל 96-היטב צלחות עם חומר מרתף ECM<ol>
<li>להפשיר חומר מרתף ECM על קרח לילה.</li>
		<li>לדלל את חומר המרתף ECM במדיום נטול סרום נטול פנול קר ללא רדום באמצעות טיפים מצוננים מראש שנשמרו בטמפרטורה של -20 °C (60 °F). הערה: הריכוז הסופי של חומר מרתף ECM תלוי בקו התא המשמש. עבור תאי HT-29 ו- H358, השתמש ב- 4 mg·mL-1 של חומר מרתף ECM. עבור תאי HepG2, השתמש 4 mg·mL-1 של חומר מרתף ECM גורם גדילה מופחת.</li>
		<li>פיפטה 15 μL של חומר מרתף ECM / פתרון בינוני לתוך צלחת הדמיה 96-well. הערה: עבור ייצור כדורי בקנה מידה גדול, שלב זה יכול להתבצע עם פיפטה 8 ערוצים וראש צינור 96 ערוצים, כל עוד הטיפים והמאגר המכילים את חומר המרתף ECM מקוררים.</li>
		<li>צנטריפוגה הצלחת במשך 20 דקות ב 91 x g ב 4 °C (4 °F).</li>
		<li>לדגור על הצלחת במשך לא יותר מ 30 דקות ב 37 °C (50 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>תת-תרבות ותאי ספירה<ol>
<li>במהלך תקופת הדגירה של הצלחת, דגירה התאים עם טריפסין-EDTA ו resuspend אותם במדיום שלם המכיל 10% FBS.</li>
		<li>פיפטה 10 μL של השעיית התא לתוך תא ספירת המוציטומטר. לספור את מספר התאים ב 4 רבעים של התא.</li>
		<li>חשב את מספר התאים בתוך ההשעיה התאית על-ידי קביעת המספר הממוצע של תאים בתוך 4 הרביעים. הערה: ניתן לספור תאים גם באמצעות התקני ספירת תאים אוטומטיים.</li>
		<li>צנטריפוגה התאים ב 135 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>ברגע שהתאים הם גלולה, לשאוף את supernatant resuspend התאים במדיום מלא ללא פנול אדום כדי לקבל ריכוז של 1 x 106 תאים לכל mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תאי זרעים לתוך לוחות מצופים חומר מרתף ECM<ol>
<li>לדלל את התאים במדיום מלא ללא פנול אדום. הערה: צפיפות התאים שנזרעו תלויה בקו התאים שבו נעשה שימוש. עבור תאי HT-29 ו- HepG2, 3 x 104 תאים נזרעים לבאר; עבור תאי H358, 4 x 104 תאים נזרעים לבאר.</li>
		<li>זרע את התאים בנפח כולל של 35 μL לבאר. הקפד להוסיף אותם טיפה בתנועה מעגלית. הערה: עבור ייצור כדורי בקנה מידה גדול, שלב זה יכול להתבצע עם פיפטה 8 ערוצים, כל עוד ניתן להשיג את התנועה המעגלית pipetting.</li>
		<li>לדגור על התאים במשך 1 שעות ב 37 °C (37 °F) באינקובטור לח עם 5% CO2.</li>
		<li>הכן פתרון של חומר מרתף ECM במדיום מלא ללא פנול אדום, אשר התוצאה בריכוז סופי של 2% חומר מרתף ECM בבאר. כדי להשיג זאת, להוסיף 1.2 μL של חומר מרתף ECM ל 23.8 μL של פנול אדום חינם בינוני מלא לכל באר, וכתוצאה מכך נפח סופי של 60 μL לבאר.</li>
		<li>לדגור על התאים ב 37 °C (5 ° C ) באינקובטור לח עם 5% CO2.</li>
		<li>למחרת, להחליף את המדיום עם 100 μL של פנול טרי אדום חינם מדיום מלא.</li>
		<li>החלף את המדיום בכל יום שני עם 100 μL של פנול טרי אדום חינם בינוני מלא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. כתמי אימונופלואורסצנטיות של כדוריות
הערה: פרוטוקול זה מותאם מ נירנברג ואח ', 202015. התאמות אלה מבוססות בעיקר על העובדה כי spheroids המתוארים בפרוטוקול זה הם קטנים יותר מאלה המשמשים Nürnberg et al. work15 , וככזה, להקל על זמני דגירה קצרים יותר. לדוגמה, זמני חסימה מופחתים מ 2 שעות ל 1 שעות. בנוסף, כמו הפרוטוקול מיועד לייצור תפוקה גבוהה של spheroids, כל שלבי העיבוד מתבצעים בבאר שבה spheroids הם תרבותיים, כלומר, העברת spheroids בודדים לתוך צינורות אינו נדרש.
<ol><li>הכן את כל הפתרונות והמאגרים הדרושים לתיקון והכתמה<ol>
<li>הכן תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) על ידי הוספת טבלית PBS אחת לכל 200 מ"ל של מים. תסגור אוטומטית את ה-פי.בי.אס.</li>
		<li>הכן paraformaldehyde (PFA) בעקבות שלבים 3.1.3-3.1.4.</li>
		<li>השתמש מערבל מחומם כדי לחמם 400 מ"ל של PBS עד 60-70 °C (60 °F) במכסה המנוע אדים. מוסיפים 15 גרם של PFA תוך כדי ערבוב. לאחר PFA התמוסס, להוסיף 50 μL של 1 M CaCl2 ו 50 μL של 1 M MgCl2.</li>
		<li>הוסף 100 מ"ל של PBS כדי ליצור נפח סופי של 500 מ"ל. השתמש ב- NaOH כדי להשוות את רמת ה-PFA ל-pH 7.4. סנן את ה-PFA באמצעות מסנני ואקום סטריליים (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר), aliquot, ואחסן בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).</li>
		<li>הכן פתרון מלאי גליצין 1 M על ידי הוספת 3.75 גרם של גליצין ל 50 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F).</li>
		<li>הכן 5 מ"ל של מאגר פרמביליזציה על ידי הוספת 100 μL של טריטון X-100, 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו 1.5 מ"ל של 1 M גליצין ל 2.4 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך לא יותר משבועיים.</li>
		<li>הכן 5 מ"ל של חוצץ חסימה על ידי הוספת 100 μL של טריטון X-100, 0.5 מ"ל של DMSO ו 0.05 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA) ל 4.9 מ"ל של PBS. Aliquot חוצץ חסימה לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (60 °F).</li>
		<li>הכן 5 מ"ל של מאגר דגירה נוגדנים על ידי הוספת 10 μL של פוליסורבט 20, 0.05 גרם של BSA, ו 250 μL של DMSO ל 4.74 מ"ל של PBS. Aliquot את חיץ הדגירה נוגדנים לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותו ב -20 °C (60 °F). הערה: בפרוטוקול המתואר כאן, כדוריות מורכבות רק ב -60 הבארות הפנימיות של צלחת של 96 בארות, אם כי ניתן להכין אותן בכל 96 הבארות של הצלחת. הסיבה להכנת כדוריות רק ב -60 הבארות הפנימיות היא שכמה עדשות אובייקטיביות צמצם מספריות גבוהות אינן מסוגלות פיזית לדמיין את כל הבאר של הבארות החיצוניות בשל 'החצאית' בסוגי לוחות מסוימים. הכרכים לעיל מספיקים להכנת 60 בארות המכילות כדוריות.</li>
	</ol></li>
	<li>לתקן ולחדירות את הספרואידים<ol>
<li>הסר בזהירות את המדיום מהספרואידים, והבטיח כי שכבת החומר במרתף ECM לא תופרע.</li>
		<li>לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.</li>
		<li>לתקן את spheroids עם 70 μL של 3% PFA עבור 1 h ב 37 °C (50 °F).</li>
		<li>לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.</li>
		<li>להרוות עם 70 μL של 0.5 M תמיסת גליצין במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).</li>
		<li>Permeabilize spheroids באמצעות 70 μL של מאגר permeabilization במשך 30 דקות ב RT.</li>
		<li>לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.</li>
		<li>לדגור על spheroids ב 70 μL של חיץ חסימה במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F). הערה: לאחר שהספרואידים תוקנו, ניתן לבצע את כל שלבי העיבוד הבאים באמצעות פיפטה של 8 ערוצים, או ראש צנרת של 96 בארות, אם הם זמינים. זה מגביר את המהירות של הכנת spheroid לפני הדמיה.</li>
	</ol></li>
	<li>כדוריות חיסוניות המשתמשות בנוגדנים ראשוניים ומשניים<ol>
<li>לדלל את הנוגדן העיקרי לדילול מתאים במאגר הדגירה של הנוגדנים ולהוסיף 70 μL לכל באר. לדגור את הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים בן לילה. הערה: הדילול תלוי בנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש. בדוגמה המוצגת כאן, ליזוזומים מחוסנים בנוגדני עכבר נגד LAMP1 באמצעות דילול של 1:500.</li>
		<li>למחרת, לשטוף את spheroids 5 פעמים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.</li>
		<li>לדלל את הנוגדן המשני בדילול של 1:500, פלואורסצנטית מצומדת phalloidin ב 1:500, ו Hoechst 33342 (ממלאי 1 מ"ג מ"ג-1 ) ב 1:5000 במאגר הדגירה נוגדנים ולהוסיף 70 μL לכל באר. דגירה בין לילה. הערה: דילול הנוגדנים תלוי בנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש. מומלץ להשתמש בנוגדנים משניים בעלי סיפוח צולב גבוה, המראים יכולת צילום גבוהה ובהירות גבוהה.</li>
		<li>למחרת, לשטוף את spheroids 5 פעמים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם. הערה: ניתן לאחסן לוחות עד שבועיים ב- RT לפני ההדמיה, כל עוד הספרואידים נשארים מכוסים ב- PBS.</li>
	</ol></li>
</ol>4. רכישה וניתוח תמונה של כדוריות
<ol><li>רכישת תמונה<ol>
<li>הכנס את הלוח בן 96 הבארות המכיל כדוריות למיקרוסקופ הקרנה בעל תוכן גבוה קונפוקלי.</li>
		<li>בחר את הלייזרים המתאימים כדי לרגש את הפלואורופורים המשמשים.</li>
		<li>לרכוש את הערוצים ברצף כדי למנוע דיבורים צולבים.</li>
		<li>דמיין את הספרואידים באמצעות מטרות מתאימות. הערה: מומלץ להשתמש ביעדי טבילה במים אם הם זמינים. לדוגמה, מטרה של 20x/1.0 NA יכולה לדמות באר שלמה ב- ~ 77 שדות תצוגה. מטרה 63x/1.15 NA יכולה לדמות באר שלמה בכ-826 שדות ראייה.</li>
		<li>תמונה ~ 30-40 פרוסות, בהתאם לעומק של spheroid, עם כל פרוסה נלקח במרווח של 1.5 מיקרומטר מן הקודם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח תמונה<ol>
<li>לניתוח מורפולוגי של כדוריות, בצע את השלבים 4.2.2-4.2.6.</li>
		<li>פלח את הספרואידים על סמך כתמי הפאלאואידין המצומדים בפלואורסצנטיות.</li>
		<li>לפזר את הגרעינים על סמך הכתם Hoechst 33342.</li>
		<li>פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי שאריות Hoechst 33342 כתם שנמצא ציטופלסמה התא.</li>
		<li>חשב תכונות מורפולוגיות שונות של הספרואידים, כולל נפח, שטח פנים, כדוריות, ומספר הגרעינים לכל ספרואיד. הערה: מידע זה מופק באמצעות אלגוריתמים שונים המובנים בתוכנת ניתוח התמונה לפי בחירה.</li>
		<li>עבד תמונות עוד יותר כדי להסיר כדוריות קטנות מ 75,000 מיקרומטר3 גדול יותר מ 900,000 מיקרומטר3. הערה: ערכים אלה הם הצעות לאפשר הסרה של הרכבות תאים קטנות מאוד הרכבות גדולות שאולי התעוררו כתוצאה של היתוך של כדוריות מרובות. כדוריות ניתן גם לסווג לשיעורי גודל שונים בשלב זה.</li>
		<li>כדי לנתח תאים בודדים בתוך כדוריות, בצע את השלבים 4.2.8-4.2.12.</li>
		<li>פלח את הספרואידים על סמך כתמי הפאלאואידין המצומדים בפלואורסצנטיות.</li>
		<li>לפזר את הגרעינים על סמך הכתם Hoechst 33342.</li>
		<li>פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי שאריות Hoechst 33342 כתם שנמצא ציטופלסמה התא.</li>
		<li>פלח את הליזוזומים על סמך כתמי הנוגדנים המשניים.</li>
		<li>חשב תכונות מורפולוגיות שונות של התאים בתוך כל ספרואיד, כולל מספר הליזוזומים לכל תא, נפח התא ואזור הפנים של התא. הערה: מידע זה מופק באמצעות אלגוריתמים שונים המובנים בתוכנת ניתוח התמונה לפי בחירה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li>
<li>Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+liver+models%3A+state+of+the+art+and+their+application+for+hepatotoxicity+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation.</a> Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).</li>
<li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li>
<li>Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+aspects+and+pharmacological+applications+of+three-dimensional+cancer+cell+cultures+and+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids.</a> Life Sciences. 254, 117784(2020).</li>
<li>Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state-of-the-art+3D+tissue+models+and+their+compatibility+with+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).</li>
<li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+gold+nanorods%27+interaction+with+large+3D+pancreatic-stromal+tumor+spheroids+by+multimodal+imaging%3A+Fluorescence%2C+photoacoustic%2C+and+photothermal+microscopies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3362(2020).</li>
<li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy-based+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy-based high-content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li>
<li>Mysior, M. M., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell3%3A+A+new+vision+for+study+of+the+endomembrane+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells.</a> Bioscience Reports. , (2021).</li>
<li>Nürnberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+optical+clearing+of+3D-cell+cultures%3A+Simplicity+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).</li>
<li>Cutrona, M. B., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-throughput+automated+confocal+microscopy+platform+for+quantitative+phenotyping+of+nanoparticle+uptake+and+transport+in+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids.</a> Small. 15 (37), 1902033(2019).</li>
<li>Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+nanoparticle-induced+toxicity+readouts+with+single+cell+resolution+in+HepG2+multicellular+tumour+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids.</a> Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).</li>
<li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).</li>
<li>Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+mesenchymal+stem+cell+3D+spheroids+using+low-binding+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates.</a> Bio-protocol. 8 (16), (2018).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Eismann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+3D+light-sheet+screening+with+high+spatiotemporal+resolution+reveals+mitotic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 245043(2020).</li>
<li>Alsehli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+pipeline+for+high-throughput+screening+and+profiling+of+spheroids+using+simple+live+image+analysis+of+frame+to+frame+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations.</a> Methods. 190, 33-43 (2021).</li>
<li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).</li>
<li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> eLife. 9, 52904(2020).</li>
<li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+%28PDEs%29+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li>
<li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants%2C+xenografts+and+organoids%3A+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li>
<li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים הקשורים לעבודה זו.

הגישה המתוארת כאן מפרטת פלטפורמה ליצירת כמה מאות כדוריות לבאר באופן המתאים ל- HCS ו- HCA. בהשוואה לשיטות פופולריות אחרות, כגון שימוש בלוחות ULA שטוחים עם תחתית ועגולה, המאפשרים היווצרות של ספרואיד אחד בלבד לכל well18,19, שיטה זו מספקת את ההזדמנות להפקת מידע ברזולוציה גבוהה ממספר גדול של כדוריות בתבנית הקרנה. ראוי לציין כי שיטה זו הודגמה בשלושה קווי תאים שונים, המייצגים סוגי גידולים שונים, תוך הדגשת התאמתה הרחבה לחקר מגוון תהליכים תאיים במודלים שונים. למרות sphero...

באופן מסורתי, בדיקות מבוססות תאים בוצעו ב-monolayers הגדלים על מצע מוצק, אשר למעשה יכול להיחשב כסביבה דו-ממדית (דו-ממדית). עם זאת, זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי מודלים תרבית תאים 2D חסר רלוונטיות פיזיולוגית בהקשרים מסוימים ולא יכול לשכפל רבים של אינטראקציות מורכבות המתרחשות בין תאים1. שיטות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של תרבית תאים הופכות במהירות לפופולריות בקרב החוקרים, ומודלים של תאים תלת-ממדיים מראים פוטנציאל גבוה לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים בהם נתקלים התאים בסביבת הרקמה2. ישנם מספר סוגים שונים של מכלולי תאים תלת-ממדיים שהועסקו, אך שני הסוגים הנפוצים ביותר הם כדוריות ואורגנוידים. ניתן לגדל כדורים מקווי תאים רבים ושונים, והם יכולים לאמץ צורות וגדלים שונים בהתאם לסוג התא המשמש ולשיטת ההרכבה שלהם3. יתר על כן, spheroids יכול גם להיקרא spheroids גידול רב תאי (MCTS) כאשר הם גדלים מקווי תאים סרטניים, ומודלים אלה מצאו שימוש מיוחד עבור משלוח תרופות הפריה-קלינית במבחנה ומחקרי רעילות4,5. Organoids, לעומת זאת, שואפים לחקות טוב יותר את הרקמות והאיברים בגוף שלנו והוא יכול לאמץ סידורים מורפולוגיים מורכבים יותר. הייצור של organoids כרוך בשימוש בתאי גזע בוגרים או תאי גזע pluripotent, אשר ניתן לתכנת מחדש לתוך התאים המתאימים כדי להידמות לרקמה או איבר העניין. הם משמשים בעיקר כדי לחקור את התפתחות האיברים וכדי מודל מחלות ואינטראקציות מארח-פתוגן6.
יש מגוון של שיטות שונות המשמשות ליצירת הרכבות תאים תלת-ממדיות. שיטות מבוססות פיגומים מספקות מצע או תמיכה שבהם תאים יכולים להיצמד או לגדול בתוכם. פיגומים אלה יכולים להיות צורות שונות והוא יכול להיעשות ממגוון רחב של חומרים שונים. הנפוצים ביותר הם רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) והידרו-ג'לים, והם נועדו להידמות לסביבה החוץ-תאית הטבעית של התאים ובכך להקל על אינטראקציות פיזיולוגיות4,7. חומר מרתף ECM הופק מגידול סרקומה עכבר אנגלברט-הולם-נחיל והוכח שהוא מכיל תערובת עשירה של רכיבי ECM, כולל למינין, קולגן מסוג IV ופרלקן8. עם זאת, למרות הרכב היתרון שלה, ישנם שני אתגרים עיקריים עם השימוש בו, כלומר שונות אצווה לאצווה שלה וכי יש לו שני מצבים מצרפיים שונים מתחת ומעל 10 °C8,9. לעומת זאת, הידרוג'לים יש את היתרון של להיות גמיש ביחס לרכיבים שלהם קשיחות, והם יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים את הרכבה ספציפית 3D התא הרצוי 7,10. שיטות מבוססות פיגומים חיוניות לצמיחת אורגנויד אך משמשות גם באופן נרחב עבור כדוריות. שיטות נטולות פיגומים, הפועלות על ידי מניעת הצמדת תאים לפני השטח שעליהם הם גדלים, תואמות בדרך כלל רק להרכבה כדורית. דוגמאות כוללות לוחות קובץ מצורף אולטרה-נמוך (ULA), עם תחתית שטוחה או U-bottom, המאפשרים צבירה של התאים לתוך spheroids, או שימוש בתסיסה מתמשכת של התאים בבקבוקי ספינר / סיבוב10.
השימוש במכלולי תאים תלת-ממדיים כדי לחקור מגוון רחב של אירועים ביולוגיים צובר במהירות פופולריות; עם זאת, זה חיוני כי השיטה שנבחרה עבור התרבות שלהם מתאימה ותואמת עם התוכניות לניתוח במורד הזרם שלהם. לדוגמה, השימוש בלוחות ULA יוצר כדוריות של עקביות גבוהה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת לייצור של ספרואיד יחיד לבאר, ובכך להגביל את התפוקה. שיקול מסוים נדרש כאשר הדמיית פלואורסצנטיות של המבנה 3D מתוכנן. המצע או הצלחת שעליהם גדל ההרכבה צריכים להיות תואמים אופטית, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את ההשפעות של פיזור אור שנגרם על ידי פיגומים שאולי נעשה בהם שימוש11. בעיה מסוימת זו הופכת חריפה יותר ככל שהצמצם המספרי של עדשות המטרה של המיקרוסקופ עולה.
ניתן לטעון שאחת הסיבות העיקריות לבחירה לעבוד עם מודל תא תלת-ממדי היא לחלץ נתוני הדמיה נפחית לא רק על ההרכבה כולה אלא גם על התאים הבודדים שבתוכה. מודלים של MCTS, בפרט, מתחילים להיות חזקים מאוד להעמקת ההבנה שלנו כיצד טיפוליות עוברות מבחוץ לתאים מרכזיים (כפי שהם יצטרכו בגידול)12, ולכן רכישת ידע מתאים בודדים בשכבות שונות היא חיונית. טכנולוגיית ההדמיה המחלצת מידע כמותי מתאים בודדים נקראת ניתוח תוכן גבוה (HCA) והיא גישה רבת עוצמה בהקשר של סינון13. עד כה, HCA יושם כמעט אך ורק על תרבויות monolayer, אבל יש הבנה הולכת וגוברת כי גישה זו יש את הכוח להיות מיושם על תרבויות 3D המאפשר מגוון רחב של פונקציות ותהליכים הסלולר להיחקר14. זה יהיה היתרון הברור כי מספר גדול של הרכבות 3D ניתן לנתח, פוטנציאל מתן נתונים ברמת התא מכל מבנה. עם זאת, יש להתגבר על אתגרים הקשורים להדמיה של הרכבות תאים עבות פוטנציאליות, כמו גם את ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו.
במאמר זה מוצגת שיטה חזקה המבוססת על פיגומים לייצור בקנה מידה גדול של MCTS בפורמט של 96 בארות. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות מכלולי תאים תלת-ממדיים בכל באר. דוגמאות מוצגות עבור שלושה סוגי תאים שונים, המייצגים מודלים של גידול מוצק של הכבד, הריאות והמעי הגס. הספרואידים הנוצרים יכולים להיות במגוון גדלים, ולכן HCA משמש לבחירת מבנים בגודל ו/או מורפולוגיה מסוימים. תכונה זו מספקת את היתרון הנוסף כי כל פנוטיפים שנצפו ניתן להשוות על פני כדוריות בגדלים שונים, אבל כל מטופלים באותו אופן באותה באר. גישה זו תואמת הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך מספקת נתונים כמותיים ברמת התא והן ברמת התא התת-תאית מאותן מכלולים תאיים. שיטה זו של ייצור כדורי יש יתרון נוסף על פני שיטות המייצרות ספרואיד יחיד לכל באר, כי המספרים הגדולים של spheroids המיוצר בכל באר פוטנציאל לספק ביומסה מספקת עבור ניתוחים אחרים במורד הזרם, כגון תמלול ופרופיל פרוטאום.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10050070</td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, תרבית רקמות מטופלת, שחורה, 96-בארות עם מכסה</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>צלחות אלה שינו את שמות הלוחות ל-Phenoplates</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מוצא דרום אמריקה, מומת בחום</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, תמיסת L-גלוטמין Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>, 200 מ"מ</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10647032</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס, ללא פנול אדום, ללא LDEV, 10 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>356237</td><td>ניתן למצוא נוסחת מטריג'ל זו גם עם אותו מספר קטלוגי ב- BD Biosciences</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>ניתן למצוא את נוסחת המטריג'ל הזו גם עם אותו מספר קטלוגי במדיום</td></tr><tr><td>5A של Corning McCoy</td><td>Gibco</td><td>26600023</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A מדיום עם L גלוטמין וסודיום ביקרבונט, ללא פנול אדום</td><td>Hyclone</td><td>10358633</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>21090022</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM), ללא גלוטמין, ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>51200046</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נוגדן חד שבטי נגד LAMP1 (תרכיז)</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>H4A3-a</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת נויבאואר</td><td>הירשמן</td><td>8100203</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה Nunclon עם מכסה, פוליסטירן, 92 מ"מ x 17 מ"מ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Opera Phoenix HCS ותוכנת Harmony HCA</td><td>Perkin Elmer</td><td>HCSHH14000000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>פוליסורבט 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>יחידות מסנן ואקום סטריליות Stericup</td><td>Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

סינון תוכן גבוה (HCS) וניתוח תוכן גבוה (HCA) הן טכנולוגיות המספקות לחוקרים את היכולת לחלץ מדידות פנוטיפיות כמותיות בקנה מידה גדול מתאים. גישה זו הוכיחה את עצמה כבעלת עוצמה להעמקת הבנתנו במגוון רחב של אירועים בסיסיים ויישומיים בביולוגיה של התא. עד כה, רוב היישומים עבור טכנולוגיה זו הסתמכו על השימוש בתאים הגדלים monolayers, אם כי הוא הבין יותר ויותר כי מודלים כאלה אינם מסכמים רבים של אינטראקציות ותהליכים המתרחשים ברקמות. ככזה, חלה הופעתה בהתפתחות ושימוש במכלולי תאים תלת מימדיים (3D), כגון כדוריות ואורגנוידים. למרות שמודלים תלת-ממדיים אלה חזקים במיוחד בהקשר של ביולוגיה של סרטן ומחקרי אספקת תרופות, הייצור והניתוח שלהם באופן ניתן לשחזור המתאים ל- HCS ו- HCA מציבים מספר אתגרים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה ליצירת כדוריות גידול רב-תאיות (MCTS), ומדגים כי ניתן להחיל אותה על שלושה קווי תאים שונים באופן התואם את HCS ו- HCA. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות כדוריות לבאר, ומספקת את היתרון הספציפי שכאשר משתמשים בו במשטר סינון, ניתן להשיג נתונים מכמה מאות מבנים לבאר, כולם מטופלים באופן זהה. דוגמאות מסופקות גם, המפרטות כיצד לעבד את הספרואידים להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה וכיצד HCA יכול לחלץ תכונות כמותיות הן ברמת הספרואיד והן מתאים בודדים בתוך כל ספרואיד. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מיושם כדי לענות על מגוון רחב של שאלות חשובות בביולוגיה של התא.

בפרוטוקול זה, מפורטת שיטה חזקה לייצור הרכבות תרבית תאים תלת-ממדית בצורה של כדוריות, תוך שימוש בסוגי תאים שונים כדי לייצג רקמות גידול שונות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות כדוריות לבאר, המאפשרת ביצוע בדיקות מבוססות תאים באופן בעל תוכן גבוה (איור 1). גישה זו שימשה בעבר כדי ללמוד ספיגת חלקיקים ב HT-29 spheroids16 ורעילות הנגרמת על ידי חלקיקים ב HepG2 spheroids17. השיטה מסתמכת על ייצור חלוקה דקה ואחידה של חומר פיגומים על פני תחתית הבאר של צלחת איכות אופ...

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לייצר כמה מאות כדוריות גידוליות רב-תאיות בכל באר של צלחת רב-באר המתאימה למיקרוסקופיה אוטומטית. ניתן לסווג את הספרואיד המיוצר למחלקות בגדלים שונים, וניתן לחלץ מידע תת-תאי מכל תא. הטכניקה מייצרת סרומים מספיקים שניתן להשתמש בהם במחקרי סינון ישיר והפרעות RNA.מדלל חומר מרתף ECM במדיום אדום פנול קר ללא סום באמצעות טיפים צונן מראש נשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס. אני מתערב על 15 מיקרוליטרים של חומר המרתף ECM ופתרון בינוני לתוך צלחת הדמיה 96 היטב. צנטריפוגה הצלחת במשך 20 דקות ב 91 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.לדגור על הצלחת במשך לא יותר מ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף נסיעות ו- EDTA לתאים. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בסוף הדגירה, אנו משעים את התאים במדיום שלם המכיל 10% FBS.פיפטה 10 מיקרוליטרים של השעיית התא, לתוך תא ספירת המוציטומטר. ספור את מספר התאים בארבעה רבעים של התא. Centra צופה בתאים ב 135 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.אחד התאים האלה הם גלולה, לשאוף את supernatant מחדש resuspend התאים במדיום מלא אדום פנול כדי להשיג ריכוז של 10 עד שישה תאים למיליליטר. לדלל את התאים במדיום מלא מלא אדום פנול אדום פנול. ראה את התאים טיפה בתנועה מעגלית בנפח כולל של 35 מיקרוליטרים לבאר.לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. ב 1.2 מיקרוליטרים של חומר מרתף ECM ל 23.8 microliters של פנול אדום חינם בינוני מלא לכל באר, וכתוצאה מכך נפח סופי של 60 מיקרוליטרים לבאר. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת, להחליף את המדיום עם 100 microliters של פנול אדום טרי חינם בינוני מלא. הכנס את צלחת הבאר 96 המכילה כדוריות, למיקרוסקופ סינון תוכן גבוה קונפוקל. בחר את הלייזרים המתאימים כדי לרגש את הרצפות המשמשות.לרכוש את הערוצים ברצף כדי למנוע crosstalk, תמונה spheroids באמצעות מטרות מתאימות. כדי לנתח את המורפולוגיה של כדוריות, פלח את הספרואידים המבוססים על פלואורסצנטיות מצומדות FLoid וכתמים. לפזר את הגרעינים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות.פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי כישוף שיורית שלוש, שלוש, ארבע, שתיים, כתם שנמצא בציטופלסמה התא. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של הספרואידים כולל נפח, שטח פנים, כדוריות ומספר הגרעינים לפי הספרואידים שלו. לרוס יש תמונות נוספות להסרת כדוריות הקטנות מ-75 מיקרומטר מעוקב ומיקרומטר מעוקב גדול מ-900,000 מ"ק.כדי לנתח תא בודד בתוך כדוריות, פלח את הספרואידים בהתבסס על כתמי הספרואידים המצומדים בפלואורסצנטיות. לפזר את הגרעינים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי כישוף שיורית שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתי כתם שנמצא בציטופלסמה התא.פלח את הליזוזומים על סמך כתמי הנוגדנים המשניים. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של התאים בתוך כל ספרואיד, כולל מספר הליזוזומים לכל תא, נפח התא ושטח הפנים של התא. האיור מציג סקירות טובות של שלושה סוגים שונים של כדוריות, כולל תמונות במישורים קונפוקליים שונים.תצוגה נפחית של כל הספרואידים מוצגת גם היא. האיור מציג את תהליך פילוח ה- pH, לוח A מציג את כל הספרואידים בתצוגת נפח. לוח B מציג את הפילוח שנקבע של הציטופלסמה, הגרעינים והליזוזומים בתוך כל התאים של ספרואידים בודדים.הציטופלסמה והגרעינים מחולקים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות. וליזוזומים מפולחים על סמך הכתמת נוגדן אנטי מעבדה אחת. חלוניות C מציגות את אותו מקטע כמו לוח B, אך בתצוגה של שלושה רגילים.ניתן לבצע מדידות מורפולוגיות שונות ברמת הספרואידים. מדידות אלה כוללות חישוב של מספר הגרעינים לכל ספרואידים, כמו גם אלה פליסיטי, נפח, ושטח הפנים של pH. הנפח הטיפוסי של כל תא בשלושת סוגי הספרואידים.כמו גם את מספר הליזוזומים לכל תא מוצגים באיור זה. מיטוב צפיפות הישיבה ההתחלתית של התא בתחילת דור SP הוא צעד קריטי. האיור מראה כי הוספת תאים רבים מדי עדיין מאפשרת היווצרות כדוריות.עם זאת, זה יכול לגרום היתוך אם spheroids. Spheroids לייצר באופן זה יכול להיות נתון לניתוח תמלול ופרוטאומי. טכניקה זו משמשת לניתוח כמותי של ספיגת משלוח סמים חלקיקי ננו כאלה ולהעריך את הרעילות שלהם לתאים בודדים בספרואידים.

a-robust-method-for-large-scale-production-spheroids-for-high-content

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי.

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

אנו מציגים יישום תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה כדי למדוד את גודלו של הספרואידים גידול תלת ממדים צילמו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. יישום זה מספק דרך מהירה ויעילה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות טיפוליות בהספרואידים, אשר מועיל לחוקרים המעוניינים להשתמש הספרואידים במסכים בסמים.

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

מוצג פרוטוקול להדפסה רובוטית של ספרואידים של תאים סרטניים בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה באמצעות מערכת דו-פאזית מימית.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה לייצור ספרואידים רקמתיים בקנה מידה גדול וחסכוניים באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד.

יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד

ספרואידים של גידולים הופכים להיות מנוצלים יותר ויותר כדי להעריך אינטראקציות בין תאים למיקרו-סביבה של הגידול ואת התגובה לטיפול. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חזקה אך פשוטה להדמיה בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול תלת-ממדיות באמצעות ניקוי אופטי מהיר.

ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לבניית ספרואידים תלת מימדיים של גידולים. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לתצפית ספרואידית וניתוח למידה עמוקה מבוססת תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

למד שיטה איתנה לייצור ספירואידים רב-תאיים בפורמט רב-באריות לסקרינינג בעל תוכן גבוה. השיטה מאפשרת ניתוח מורפולוגי מפורט של תאים בודדים ושל המבנה הכולל.

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

גלה סרטונים נוספים