תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

שיטה ניסיונית זו מאפשרת אחסון ארוך טווח של תאים בודדים לשימוש חוזר לבדיקות אפיגנומיות. זה גם מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים רבים וגורמי שעתוק באותו תא בודד. בשיטות הנוכחיות לניתוח אפיגנום של תא יחיד, לא ניתן לנתח מחדש את אותם תאים בודדים.

עם זאת, עם תאים בודדים לשימוש חוזר, אותם תאים בודדים ניתן לנתח מחדש פעמים רבות. טכניקה זו שימושית לאבחון ועיצוב של טיפול אפיגנטי, במיוחד כאשר תאי המטופל מוגבלים במספרם. שיטה זו מתאימה ביותר לחקר האפיגנום, ויסות ביטוי גנים ומערכות אחרות כל עוד קיימים נוגדנים ספציפיים לסימנים אפיגנטיים.

כאשר אתה מנסה לראשונה טכניקה זו, אנו ממליצים לך להתאמן על דגימות שאינן יקרות מדי, ואתה לאמת את הניסוי באמצעות ריצוף רדוד כגון MiSeq או iSeq 100. כדי להתחיל, במכסה מנוע זרימה למינרית נקייה, מערבבים מיליליטר אחד של תרחיף תאים ו-199 מיליליטר של מילימולר EDTA PBS המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א. לאחר הערבוב, להעביר 200 מיקרוליטר של השעיית התא לכל באר של צלחת 96 באר תחתית שטוחה.

הניחו את הכיסוי על צלחת 96 בארות וסרקו את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ סורק. לאחר מכן, הטו את הצלחת והמתינו מספר דקות עד שהתא הבודד שקע לקצה התחתון של הבאר. לאחר מכן מניחים את קצה פיפטה בפינה התחתונה ומעבירים את התא הבודד ואת המאגר לצינור PCR.

בדוק את הבאר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את ההעברה. אם תא בודד עדיין נמצא בבאר, הוסיפו 200 מיקרוליטר לבאר של PBS EDTA מילימולרי אחד המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א וחזרו על ההעברה. לאחר ההעברה, הניחו כיסוי על צלחת ה-PCR בעלת 96 הקידוחים וצנטריפוגו את הצלחת באמצעות רוטור נדנדה ללא הפסקה.

לאחר הצנטריפוגה, הניחו את הצלחת על סיפון רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים. לאחר מכן, גרור ושחרר את הקוד המשלים אחד לחלון התוכנה של הרובוט לטיפול בנוזלים והפעל את התוכנית כדי להסיר 195 מיקרוליטר של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד. מוסיפים 50 מיקרוליטר של 4% TEMED או שמן מינרלי ודוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

למחרת, להסיר את השמן המינרלי על ידי pipetting ולשטוף את התאים חמש פעמים עם 200 מיקרוליטר של TP מגנזיום שלילי חיץ . לאחר השטיפה האחרונה, להסיר את supernatant, להוסיף 15 מיקרוליטר של חיץ חישול, לדגור על קרח במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, מניחים את צינורות ה-PCR על מחזור תרמי ומחממים ב-94 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

לאחר מכן מעבירים את הצינורות לגוש מתכת מקורר קרח ודגרים במשך שתי דקות. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיקרוליטרים של מגנזיום גופרתי-נתרן כלורי, DNTP לערבב ולערבב על ידי מערבול במהירות מקסימלית. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של BST פולימראז פרגמנט גדול, מערבבים על ידי מערבולת, ודוגרים במשך ארבע שעות על שייקר.

לאחר הדגירה, הניחו את צינור ה-PCR על מחזור תרמי והפעילו תוכנית של ארבע שעות או לילה כמתואר בטקסט. לקשירת נוגדנים, הוסף 1.625 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי EDTA BSA לצינור. מערבבים על ידי מערבולות במהירות נמוכה ודגרים על הצינור על קרח במשך שעה.

לאחר מכן להוסיף 0.1 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדנים ולשלוט IgG מצומד עם בדיקת נוגדנים. לאחר הוספת הנוגדנים, לדגור את הצינורות על קרח עם רעד עדין. למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של חיץ TPM-T על קרח.

לאחר מכן הסירו את הסופרנאטנט ושטפו פעם אחת עם מאגר ליגאז T4 DNA. לאחר מכן, להוסיף 19 מיקרוליטר של פתרון מתאם קשירה לדגור במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף ליגאז DNA T4 מיקרוליטר אחד וערבב את הצינור על ידי מערבולות במהירות בינונית.

הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את תוכנית קשירת הקרבה. לאחר הריצה, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר מגנזיום שלילי EDTA חיובי BST ואחסנו את התאים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר מגנזיום שלילי EDTA שלילי BST, והוסיפו 20 מיקרוליטר של תערובת המכילה BST, DNTPs ומגנזיום גופרתי.

לאחר מכן מערבבים עם מערבל מערבולת ודגרים על הצינור במשך ארבע שעות על שייקר מסלולי. לאחר הדגירה, הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את תוכנית ההרחבה המלאה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, להגברה של תזוזה מרובה, הוסיפו 0.4 מיקרוליטר של פריימר אקראי של 100 מיקרומולרית שנייה, וערבבו על ידי מערבולת.

לאחר מכן, לדגור על הצינור במשך שעתיים על שייקר מסלול לפני הנחת הצינור על מחזור תרמי לחימום ב 94 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש דקות, הניחו את הצינורות בגוש מתכת מקורר קרח והוסיפו מיקרוליטר אחד של BST DNA פולימראז. מערבלים את הצינורות במהירות איטית.

לאחר מכן הניחו את הצינורות על מחזור תרמי כדי להפעיל את תוכנית הגברת התזוזה המרובה. לאחר התוכנית, להעביר כ 20 מיקרוליטר של supernatant לצינור PCR, ולאחסן אותו ב מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטר של 0.05% TWEEN 20 ו-0.1X TE לצינור PCR המכיל את התא הבודד הרב-פעמי, ודגרו על הצינור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, אספו את הסופרנאטנט ושלבו אותו עם הסופרנאטנט שנאסף קודם לכן. לאחר מכן, השרו את התא הבודד הרב-פעמי ואת מאגר TBS המכיל 50% גליצרול, EDTA של חמישה מילימולרי, 0.5% BSA ו-0.05% TWEEN 20, ולאחר מכן דגרו עליו במשך 30 דקות על שייקר מסלולי. לאחר הדגירה, יש לאחסן את התא הבודד הרב-פעמי בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

לבסוף, הוסף 40 מיקרוליטר של תערובת מאסטר שלילית של Exo, והנח את הצינור על מחזור תרמי כדי להפעיל את התוכנית כמתואר בכתב היד של הטקסט. K562 תאים בודדים לשימוש חוזר נוצרו באמצעות פרוטוקול זה. תאים בודדים הוטמעו בשכבה החיצונית של חרוז הפוליאקרילאמיד והודמיינו באמצעות צבע אינטרקלטור להכתמת DNA.

מוצרי DNA לפני ואחרי עיכול BciVI מוצגים כאן. עיכול אנזים ההגבלה יצר את 19 עד 20, 31 עד 32, 49 ויותר מ-49 שברי זוגות בסיסים. יתר על כן, ספריית ה- DNA שנבנתה נותחה על ידי אלקטרופורזה נימית עבור המוצרים הרצויים.

תוצאות הריצוף הצביעו על כך שהקריאות הממופות הייחודיות מליזין 27 אנטי-היסטון H3 אצטילאט וליזין 27 טרימתילציה אנטי-היסטון H3 היו רבות יותר באופן משמעותי מאשר מקבוצת הביקורת IgG. אותות ריצוף REpi הוערכו על ידי השוואת נתוני ריצוף REpi עם נתוני ריצוף ChIP בכמות גדולה. בממוצע, כ-91% מהאותות של היסטון H3 אצטילאט ליזין 27 מריצוף REpi חפפו לליזין 27 אצטילאט היסטון H-3 הגיעו לשיאם בריצוף ChIP בתפזורת.

הדיוק של ריצוף REpi עבור סימן ההיסטון הלא פעיל, היסטון H3 טרימתילציה ליזין 27 היה 52%הרגישות של ריצוף REpi נותחה כדי למדוד כמה שיאים של ריצוף ChIP בתפזורת זוהו על ידי ריצוף REpi קריאות משוכפלות. הרגישות של ריצוף REpi הייתה 55.30% בהיסטון H3 אצטילאט ליזין 27 ו-50.94% בהיסטון H3 טרימתילציה ליזין 27. אנא הקפד להשתמש בריאגנטים נטולי DNS.

כמו כן, כל הפעולות הכוללות את מוליכי צינור הפתיחה או מוליכי מגיב צריכות להתבצע במכסה מנוע נקי. תוצרי דנ"א של הליך זה מרוצפים ולאחר מכן ממופים לגנום כדי לגלות אילו שינויים בהיסטון קיימים, באילו אזורים של הגנום בתאים בודדים. טכנולוגיה זו אפשרה לנתח סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד וסללה את הדרך לניתוח מולטיומיקה בכל תא בודד.