ניתוח בתפוקה גבוהה של מרווה לא פוטוכימית בגידולים באמצעות פלואורומטריית כלורופיל מווסתת משרעת פולסים

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי השונות הגנטית בהרווה לא פוטוכימית הזמינה בלוחות של מגוון גנטי או באוכלוסיות רבייה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל לסנן מספר רב של גנוטיפים לשונות במרווה לא פוטוכימית תוך יום אחד. הפרוטוקול מוצג עבור גליצין מקסימום או סויה, אך ניתן להתאים אותו לניתוח מרחבי צמחים אחרים שמהם ניתן לאסוף דיסקי הרמה.

עבור מישהו שמבצע את הפרוטוקול בפעם הראשונה, המפתח הוא טיפול בדיסק ההרמה כדי למנוע נזק או רוויית ספוגים יתר על המידה במים. כדי להתחיל, לדגום את הצמחים באתר השדה 30 יום לאחר הנביטה. מלאו 1/3 רמה של מים מזוקקים בכל הבארות של צלחת של 24 בארות.

סמן את המכסה ואת צד הצלחת עם השכפולים שיש לדגום. החזיקו את העלה הצעיר ביותר בעל הרחבה מלאה שנמצא בחלק העליון של הצמח כנגד פקק גומי. לחץ על בור שעם הומבולדט מספר שתיים דרך העלה וסובב כדי לחתוך דיסק, תוך הימנעות מאמצע הצלע.

אסוף ברצף חמישה דיסקים מאותו עלה עבור שכפולים טכניים. דוחפים את דיסקיות העלים אל מחוץ לבור השעם לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות באמצעות צמר גפן, וחוזרים על כך עבור צמח אחר בעל אותו גנוטיפ. בדקו שכל דיסקי העלים צפים במים.

אם לא, הזיזו בעדינות דיסקיות עלים הנדבקות לצד באר לתנוחה צפה עם ספוגית צמר גפן. עבור לדגימת דיסקים מהעלילה הבאה. מניחים את המכסה והאותם עם סרט גמיש שקוף למחצה.

לאחר השלמת הדגימה בכל הצלחת בת 24 הבארות. אחסנו את הצלחת מאור שמש ישיר בשקית, בקופסה או בצידנית ריקה. בחלל מעבדה נקי, הקישו על המכסה של הצלחת האטומה כדי לעקור דיסקיות עלים שנדבקו למכסה במהלך ההובלה.

פתח את הסרט והסר את המכסה. מעבירים דיסקית עלים מהמיקום הראשון של צלחת 24 הבארות לצלחת טרייה בת 96 בארות כאשר דיסק העלה פונה שטוח כלפי מטה בתחתית הבאר. חותכים מסנן אספירטור באף לשניים.

טובלים את המסנן שנוצר באמצע הדרך במים ומקשקשים על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים. הכנס את המסנן לתוך הבאר עם דיסק העלה כדי לשמור על הלחות. קחו דיסק עלה שני מהמיקום הראשון של צלחת 24 הקידוחים והניחו אותה עם הפנים כלפי מטה במיקום הזמין הבא של צלחת 96 הקידוחים.

טובלים את החצי הנותר של מסנן האף המיוצר במים ומדביקים אותו על מגבת נייר לפני שמכניסים אותו לבאר עם דיסק העלה השני. הדבק את הפינה השמאלית העליונה כדי לסייע בהכוונת הצלחת בחושך לצורך הדמיה. אטמו צלחות עם סרט גמיש שקוף למחצה ועטפו את הצלחת בנייר אלומיניום.

כתוב את מזהי העלילה ואת מזהה הצלחת על רדיד האלומיניום. הניחו צלחות בקופסה או בארון חשוכים למשך 30 דקות לפחות להרפיית שני השלבים הראשונים של מרווה לא פוטוכימית. השתמש בפרק זמן דגירה כהה ממושך של שעה לפני ההדמיה אם שלבים ארוכי טווח של מרווה לא פוטוכימית מעניינים.

הכינו צלחת דמה נוספת למיקוד במהלך הניתוח על ידי הנחת דיסק עלה בכל פינה של צלחת טרייה בת 96 בארות ואחת במרכז. אבטחו את דיסקיות העלים עם מסנני האף כפי שנעשו עם הצלחות הקודמות, אטמו את הצלחת ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר וב-50% לחות יחסית. הפעל את הדימוי ופתח את תוכנת ההדמיה.

לחץ על הגדרות ואחריו פרוטוקול כדי לפתוח חלון להזנת שלבים בפרוטוקול הניסוי של PAM. הגדר את המפרטים הטכניים של המכונה המסופקת בכתב היד. הגדר את התוכנית להתחיל עם פולס רווי כדי למדוד את היעילות הקוונטית המרבית של פוטוסינתזה מותאמת לכהה על ידי הזנת 20 שניות לתוך הקופסה שנקראת After a delay of.

לחץ על התיבה החל דופק והזן 1 בתיבה שכותרתה מספר זה של פעמים. הגדר את הדופק PPFD ל- 6, 152, אורך הדופק ל- 800 אלפיות השנייה, וסמן את התיבה קח F prime ו- FM תמונות ראשוניות עם כל הפולסים. בדוק הוספה לאחר כדי להוסיף שלב שני לפרוטוקול.

הזן 30 שניות לתוך התיבה שכותרתה לאחר עיכוב של. לאחר מכן, בחר באפשרות שנה אקטיני והזן 50 בתיבה שכותרתה Actinic PPFD כדי להגדיר את עוצמת האור לתא ל- 50 PPFD. לחץ על הוסף לאחר מכן כדי להוסיף שלב חדש לפרוטוקול והזן 150 שניות לתיבה שכותרתה לאחר עיכוב של.

בחר החל דופק והזן 4 בתיבה שכותרתה מספר זה של פעמים כדי להחיל פולסים מדידה כל 150 שניות ארבע פעמים ברציפות בעוד שהאור האקטיני מוחזק ב- 50 PPFD. התאם את ההשהיה ועוצמת האור עבור כל שלב בהתאם לערכים המופיעים בכתב היד לפני שמירת הפרוטוקול כקובץ pcl במיקום הרצוי. כבו את האור והניחו את צלחת הדמה עם הפנים כלפי מטה על במת הדגימה, כך שהמשטח האדאקסיאלי של העלה מצביע כלפי מעלה לכיוון הגלאי ושהספוג פונה כלפי מטה לכיוון הפלטפורמה.

הגדר את גובה הבמה לדוגמה כך שדיסקיות העלים יהיו 140 מילימטרים מעל בסיס המכשיר. לחץ על סמל החיבור/הניתוק למצלמת הצילום ומצלמת החומרה כדי להפעיל את המצלמה. לחצו על סמל הפוקוס הפלואורסצנטי, המיוצג על ידי סמל חץ דו-צדדי בצבע אדום עם שני קווים ירוקים בבסיס, והתאימו את העדשה והחשיפה כדי למקד את הצלחת.

לחץ שוב על סמל ההתמקדות הפלואורסצנטית כדי לכבות את האור המהבהב. בעבודה בחושך, החליפו את צלחת הדמה בצלחת לניתוח. מקם אותו עם הפנים כלפי מטה עם הקלטת מבחוץ המשמשת להכוונת הפינה השמאלית העליונה ולחץ על סמל מצלמת תמונת המפה.

התאם את חשיפת התמונה על-ידי פתיחה או סגירה של מפתח הצמצם עד שהפס בחלון הקופץ ימוקם באזור הירוק. לחץ על לחצן נסה שוב לאחר כל כוונון של מפתח הצמצם עד שהחשיפה תותאם כראוי והמכשיר יצלם תמונה. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר החל בידוד תמונה כדי לחסום אותות רקע.

אזור העלה הממוקד יוצג באפור והרקע בכחול. בחר את האזור או הפיקסלים המעניינים כדי לכלול רק את דיסקי העלה על-ידי התאמת רמת ההיסטוגרמה והגמא מהתפריט 'שנה תמונה' על-ידי לחיצה ימנית על התמונה. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר מחק חיתוכים גבוהים ונמוכים כדי למחוק את האזורים המסומנים בכחול בהיר.

לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר מחק תועים כדי להסיר את כל הפיקסלים שאינם נוגעים בשלושת הפיקסלים האחרים האחרונים. כל האזורים בתמונה המופיעים כאיים מבודדים ינותחו בנפרד וייכללו בפלט הנתונים הסופי. לחץ על סמל פרוטוקול ההפעלה כדי להפעיל את התוכנית.

טיימר יופיע בתחתית המסך ומודיע לך כמה זמן נותר לפרוטוקול לפעול. המתן עד לסיום הפרוטוקול. לחץ על קובץ ושמור כדי לשמור את הנתונים כקובץ igr.

סגור את החלון על-ידי לחיצה על הצלב האדום בפינה השמאלית העליונה של החלון לפני הפעלת לוחית דגימה נוספת. כדי לייצא את נתוני הפלואורסצנציה של כלורופיל, פתח את קובץ ה- igr בתוכנת ההדמיה ולחץ על קובץ ואחריו ייצוא לתיקיה כדי ליצור תיקיה חדשה עם כל הקבצים הדרושים. מדידה טיפוסית של מרווה לא פוטוכימית בפולי סויה שגודלו בשדה הראתה כי לאחר הבזק רווי ראשוני לקביעת Fv/Fm כאשר דיסקיות העלים נחשפו לאור נמוך של 50 מיקרומולים למטר לשנייה, המרווה הלא פוטוכימית הייתה פחות מאחת.

יתר על כן, עם המעבר לאור גבוה של 2, 000 מיקרומולים למטר לשנייה, מרווה לא פוטוכימית עלתה עד לערך המרבי של ארבעה לאחר 15 דקות. מדידה כושלת הראתה עלייה מזערית במרווה שאינה פוטוכימית עם המעבר לאור גבוה. הכוונת לוחות בתוך התמונה ותוכנית מוגדרת בבירור לדגימה וציפוי של דיסקי עלים חיונית כדי להבטיח שהנתונים מקושרים לגנוטיפ הנכון.

פרוטוקול זה יכול לכמת את ההשפעה של משתנים סביבתיים כגון בצורת ונשירה על מרווה לא פוטוכימית או להעריך מרווה לא פוטוכימית ברמות חופה שונות כדי לחדד מודלים של יבולים.