Name: בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: למדו לבודד ולאפיין תאי מערכת חיסון מזכוכית זרחית עכבר באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי ואיכותי של אוכלוסיות תאים ייחודיות במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למכון פסטר Animalerie Centrale ולחברי מתקן CB-UTechS על עזרתם. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מכון פסטר.

<ol><li>Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota-brain+axis+in+behaviour+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).</li>
<li>Deczkowska, A., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neuro-immune+communication+in+neurodegeneration%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).</li>
<li>Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+compartmentalization+for+brain+surveillance+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection.</a> Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).</li>
<li>Erny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+microbiota+constantly+control+maturation+and+function+of+microglia+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).</li>
<li>Mrdjen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+mapping+of+central+nervous+system+immune+cells+reveals+distinct+myeloid+subsets+in+health%2C+aging%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease.</a> Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).</li>
<li>Korin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single-cell+characterization+of+the+brain%27s+immune+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">single-cell characterization of the brain's immune compartment.</a> Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).</li>
<li>van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: Biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li>
<li>Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone%3A+Go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).</li>
<li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li>
<li>Mazucanti, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+insulin+produced+by+the+choroids+plexis+is+regulated+by+serotonergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling.</a> JCI Insight. 4 (23), (2019).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li>
<li>Deczkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2C+restrains+microglial+inflammatory+response+and+is+lost+in+brain+ageing+in+an+IFN-I-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li>
<li>Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%3A+From+development+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging.</a> Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).</li>
<li>da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li>
<li>Schwarze, E. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+%28Kolmer%27s%29+epiplexus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The origin of (Kolmer's) epiplexus cells.</a> Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-specific+immunity+at+the+choroid+plexus+shifts+toward+destructive+Th2+inflammation+in+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).</li>
<li>Kunis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-%CE%B3-dependent+activation+of+the+brain%27s+choroid+plexus+for+CNS+immune+surveillance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair.</a> Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age%3A+From+origin+to+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fate+and+dynamics+of+macrophages+at+central+nervous+system+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces.</a> Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).</li>
<li>Fung, I. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+group+2+innate+lymphoid+cells+alleviates+aging-associated+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5, 4111(2019).</li>
<li>Shechter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+beneficial+M2+macrophages+to+injured+spinal+cord+is+orchestrated+by+remote+brain+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus.</a> Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+brain+and+choroid+plexus+cell+types+in+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19.</a> Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immune+checkpoint+blockade+reduces+pathology+and+improves+memory+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+immune+tolerance+by+targeting+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+mitigates+Alzheimer%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology.</a> Nature Communications. 6, 7967(2015).</li>
<li>Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-%CE%B1%2F%CE%B2+CD4+%E2%88%92+CD8+%E2%88%92+double+negative+T+cells+arise+from+CD8+%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).</li>
<li>Schafflick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+CNS+border+compartment+leukocytes+reveals+that+B+cells+and+their+progenitors+reside+in+non-diseased+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges.</a> Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNGR-1%2B+dendritic+cells+are+located+in+meningeal+membrane+and+choroid+plexus+of+the+noninjured+brain%5BTitle%5D)+AND+%22GLIA%22%5BJournal%5D)">DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain.</a> GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).</li>
<li>Kabashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+evaluation+of+mast+cell+and+basophil+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation.</a> Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מחקרים שמטרתם להבין את התרומות החיסוניות להומיאוסטזיס המוח ולמחלות התמקדו בעיקר בתאים המתגוררים בתוך הפרנצ'ימה במוח, והזניחו גבולות המוח כגון CP, שהם בכל זאת תורמים חיוניים לתפקוד המוח2,3. הניתוח של אוכלוסיות תאי החיסון ב- CP הוא מאתגר בשל גודל קטן של CP, מספרים נמוכים של תאי מערכת החיסון המקומיים, וגישה מסובכת לרקמה זו. ציטומטריית זרימה המבוצעת על סך תאי החיסון במוח (CD45+) אינה מאפשרת אפיון של אוכלוסיות החיסון הנדירות המתגוררות ב- CP. כדי לאפיין את ה...

מאז גילוי מחסום הדם - מוח על ידי פול ארליך בסוף המאה ה -19, המוח נחשב כמעט מופרד מהאיברים האחרים ומחזור הדם. עם זאת, בעשור האחרון חלה הופעתה של התפיסה שתפקוד המוח מעוצב על ידי גורמים ביולוגיים שונים, כגון מיקרוביוטה במעיים ותאי חיסון מערכתיים ואותות1,2,3,4. במקביל, גבולות מוח אחרים כגון קרום המוח וזכוכית קרום המוח (CP) זוהו כממשקים של דיבורים צולבים חיסוניים-מוחיים פעילים ולא כרקמות מחסום אינרטיות5,6,7,8.
ה-CP מהווים את מחסום הנוזל השדרתי בדם, אחד הגבולות המפרידים בין המוח לפריפריה. הם ממוקמים בכל אחד מארבעת החדרים של המוח, כלומר, השלישי, הרביעי, ושניהם חדרים לרוחב, והם סמוכים לאזורים המעורבים neurogenesis כגון האזור subventricular ואזור תת-עורי של ההיפוקמפוס3. מבחינה מבנית, CP מורכבים מרשת של נימי דם fenestrated מוקף על ידי monolayer של תאי אפיתל, אשר מחוברים על ידי צמתים הדוקים ודבקים9,10. תפקידים פיזיולוגיים עיקריים של אפיתל CP כרוכים בייצור של נוזל השדרתי, אשר שוטף את המוח מטבוליטים פסולת ואגרגטים חלבון, ואת הייצור ואת המעבר מבוקר דם למוח של מולקולות איתות שונות כולל הורמונים וגורמים נוירוטרופיים11,12,13. מולקולות מופרשות מפעילות המוח בצורת CP, כלומר, על ידי ויסות נוירוגנזה ותפקוד מיקרוגליאלי14,15,16,17,17,18,19, מה שהופך את CP קריטי עבור הומאוסטזיס במוח. CP עוסקת גם בפעילויות חיסוניות שונות; בעוד שסוג התא החיסוני העיקרי בפרנצ'ימה במוח בתנאים לא פתולוגיים הוא מיקרוגליה, המגוון של אוכלוסיות תאי החיסון של CP רחב כמו באיברים היקפיים3,7, מה שמצביע על כך שערוצים שונים של ויסות ואיתות חיסוני פועלים ב- CP.
הרווח בין תאי האנדותל והאפיתל, CP stroma, מאוכלס בעיקר על ידי מקרופאגים הקשורים לגבול (BAM), המבטאים ציטוקינים פרו דלקתיים ומולקולות הקשורות להצגת אנטיגן בתגובה לאותות דלקתיים3. תת-סוג נוסף של מקרופאגים, תאי האפילקסוס של קולמר, נמצאים על פני השטח האפיליים של אפיתל CP20. CP stroma הוא גם נישה עבור תאים דנדריטיים, תאי B, תאי פיטום, בזופילים, נויטרופילים, תאי לימפה מולדים, ותאי T שהם בעיקר תאי זיכרון T מפעילים המסוגלים לזהות אנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית7,21,22,22,23,24. בנוסף, ההרכב והפעילות של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון ב- CP משתנים על הפרעה מערכתית או מוחית, למשל, במהלך הזדקנות 10,14,15,15,21,25, הפרעה מיקרוביוטה7, מתח26, ומחלה27,28. ראוי לציין, שינויים אלה הוצעו בעקיפין לעצב את תפקוד המוח, כלומר, שינוי של תאי CP CD4 + T לכיוון דלקת Th2 מתרחשת בהזדקנות המוח ומפעיל איתות חיסוני מן CP שעשוי לעצב ירידה קוגניטיבית הקשורה להזדקנות14,15,21,25,25,29 . הארת המאפיינים של תאי החיסון של CP תהיה אפוא חיונית כדי להבין טוב יותר את תפקודם הרגולטורי על פיזיולוגיה והפרשת אפיתל CP ובכך לפענח את השפעתם העקיפה על תפקוד המוח בתנאים בריאים ומחלות.
CP הם מבנים קטנים המכילים רק כמה תאים חיסוניים. הבידוד שלהם דורש microdissection לאחר שלב ראשוני של זלוף; תאי מערכת החיסון במחזור הדם היו מהווים מזהמים עיקריים. פרוטוקול זה נועד לאפיין את תת-קבוצות תאי המיאלואיד וה- T של CP באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מזהה כ -90% מאוכלוסיות תאי החיסון המרכיבים CP עכבר בתנאים לא דלקתיים, בהתאם לעבודות שפורסמו לאחרונה באמצעות שיטות אחרות לנתח הטרוגניות CP חיסונית7,10,28. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לאפיין שינויים בתא התא החיסוני של CP עם מחלות ופרדיגמות ניסיוניות אחרות ב vivo.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>אלבומין, בקר</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>160069</td><td>חסימת מגיב</td></tr><tr><td>APC נגד עכבר CX3CR1</td><td>BioLegend</td><td>149008</td><td>זרימה ציטומטריה נוגדן</td></tr><tr><td>APC נגד עכבר TCRb</td><td>BioLegend</td><td>109212</td><td>זרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>נוגדן APC-Cy7 נגד עכבר CD4</td><td>BioLegend</td><td>100414</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>APC-Cy7 נגד עכבר IA-IE</td><td>BioLegend</td><td>107628</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 מנתח תאים</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>מנתח ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>BV711 אנטי עכבר Ly6C</td><td>BioLegend</td><td>128037</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>אנזים ל להפריד רקמת CP</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>סמן חי/מת</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>מספריים</td></tr><tr><td>עדינים</td> של כלאטור <td>יון FST</td><td>14058-11</td><td>כלי דיסקציה</td></tr><tr><td>FITC נגד עכבר CD45</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td>זרימה ציטומטריה נוגדן</td></tr><tr><td>בקר זרימה עירוי</td><td>מוטבע CareFusion</td><td>RG-3-C</td><td>זלוף דם inset</td></tr><tr><td>FlowJo תוכנה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>ניתוח תוכנה</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>כלי דיסקציה</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>נוגד קרישה</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>קטמין, חומר הרדמה</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-42</td><td>חרוזי בקרה למימוש פיצוי</td></tr><tr><td>PBS-/-</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>מאגר</td></tr><tr><td>PBS+/+</td> <td>Gibco</td><td>14040-091</td><td>מאגר</td></tr><tr><td>PE נגד עכבר CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100708</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>PE נגד עכבר F4/80</td><td>BioLegend</td><td>123110</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>PE-Dazzle 594 נגד עכבר CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101256</td><td>ציטומטריית זרימה נוגדן</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td></td><td>Xylazine,</td></tr><tr><td>מלקחיים דקים</td> להרדמה <td>Dumoxel Biology</td><td>11242-40</td><td>כלי דיסקציה</td></tr><tr><td>וטרינרי</td><td>Ceva</td><td></td><td>Buprenorphin, משכך כאבים</td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

המוח כבר לא נחשב לאיבר המתפקד בבידוד; צבירת ראיות מצביעה על כך ששינויים במערכת החיסון ההיקפית יכולים לעצב בעקיפין את תפקוד המוח. בממשק שבין המוח למחזור הדם המערכתי, מקלעות הכורואידים (CP), המהווים את מחסום הנוזל השדרתי בדם, הודגשו כאתר מפתח של תקשורת פריפריה-למוח. CP מייצר את הנוזל השדרתי, גורמים נוירוטרופיים ומולקולות איתות שיכולות לעצב הומאוסטזיס במוח. CP הם גם נישה חיסונית פעילה. בניגוד לפרנצ'ימה במוח, המאוכלסת בעיקר על ידי מיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים, ההטרוגניות של תאי החיסון של CP משחזרת את המגוון שנמצא באיברים היקפיים אחרים. המגוון והפעילות של תאי החיסון של CP משתנים עם ההזדקנות, הלחץ והמחלות ומווסתים את פעילות האפיתל של CP, ובכך מעצבים בעקיפין את תפקוד המוח. מטרת פרוטוקול זה היא לבודד את CP מורין ולזהות כ -90% מתת-קבוצות החיסון העיקריות המאכלסות אותם. שיטה זו היא כלי לאפיון תאי מערכת החיסון של CP ולהבנת תפקידם בניהול תקשורת בין הפריפריה למוח. הפרוטוקול המוצע עשוי לסייע בפענוח האופן שבו תאי מערכת החיסון של CP מווסתים בעקיפין את תפקוד המוח בבריאות ובמצבי מחלה שונים.

ניתוחי ציטומטריית הזרימה המוצגים כאן חשפו בהצלחה את תתי-הערכות העיקריות של תאי המיאלואיד וה-T (איור 1 ואיור 2, בהתאמה), ואת המספר הכולל היחסי שלהן לעכבר באופן רב לשחזור (איור 3).
ניתוח ציטומטריית הזרימה של תאי מיאלואידים הראה כי CP מאוכלסים על ידי CD11b + CX3CR1 + F4/80high BAM, המייצגים כמעט 80% מתאי החיסון CD45 + ב- CP. BAM אלה חולקו לשתי אוכלוסיות ...

מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...

פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לטיפול בשאלות על תפקידם של מקלעות choroid ותאי חיסון היקפיים בוויסות המוח בהקשרים שונים במודלים עכבר. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח כמותי ואיכותי מעמיק של אוכלוסיות תאי החיסון הייחודיות בקליעות הכורואידיות של עכברים. ניתוח של מקלעות choroid יכול להיות קשה בהתחלה בשל גודלם הקטן וצבע שקוף.אנו ממליצים לתרגל תחילה על בעלי חיים שאינם מנוטרלים. כדי להתחיל, למקם את המוח מנותח מן C57 שחור שישה עכבר גב צד למעלה בצלחת פטרי ומניחים את המנה מתחת למטרות של לולאות משקפת. תוך שמירה על המוח במקום באמצעות מלקחיים, הכנס את שני הקצוות של זוג מלקחיים אחרים למטה דרך קו האמצע בין ההמיספרות.באמצעות המלקחיים, למשוך את קליפת המוח עם callosum והיפוקמפוס מן המחיצה, חשיפת החדר לרוחב וחלק החדר השלישי. זהה את מקלעת הכורואידים לרוחב כהינומה ארוכה המצפה את החדר לרוחב ומתלקח בשני קצותיו. לאחר מכן באמצעות שני קצוות של מלקחיים דקים, לאסוף את מקלעת choroid לרוחב.היזהר לאסוף את החלק האחורי המשולש מוסתר על ידי הקיפול האחורי של ההיפוקמפוס. לאחר מכן, משוך את קליפת המוח עם קורפוס קאלוזום והיפוקמפוס של חצי הכדור הנגדי הרחק מהמחיצה כדי לחשוף את כל החדר השלישי ואת החדר הצדדי ההפוך. באמצעות מלקחיים עדינים, לאסוף את מקלעת choroid השלישי מזוהה כמבנה קצר עם היבט משטח פרטני.ואז לאסוף את מקלעת choroid לרוחב האחר. לאחר מכן, הכנס את שני הקצוות של המלקחיים למטה בין המוח הקטן לבין המוח האמצעי וניתק את המוח הקטן מן הפונס ואת medulla כדי לחשוף את החדר הרביעי. לאחר מכן זהה את מקלעת הכורואיד הרביעית כמבנה כדורי ארוך עם היבט משטח פרטני המרפד את החדר הרביעי מהקצה הימני לרוחב לקצה השמאלי בין המוח הקטן למדולה.באמצעות מלקחיים עדינים, לאסוף את מקלעת choroid הרביעי. לאחר הדגירה של כל מקלעות הכורואידים שנאספו עם קולגנאז 4, פיפטה עדינה למעלה ולמטה סביב 10 פעמים כדי לסיים את הניתוק. לאחר מכן מלאו את הצינור ל-1.5 מיליליטר עם מאגר MACS כדי לעצור את פעילות הקולגנאז הרביעי.לאחר מכן, צנטריפוגה התאים להשליך את supernatant לפני שטיפת התאים עם 1.5 מיליליטר של מאגר MACS. לאחר הוספת חרוזי פיצוי מתאימים ופתרונות נוגדנים, לדגור על הדגימות על קרח במשך 30 עד 45 דקות, להגן עליהם מפני חשיפה לאור. לאחר מכן מלא את הצינורות עם 1.5 מיליליטר של מאגר MACS וצנטריפוגה התאים וחרוזי פיצוי.לאחר שימוש חוזר בתאים וחרוזי פיצוי ב 500 מיקרוליטרים של מאגר MACS, לסנן את התאים באמצעות מסננת 70 מיקרון. לאחר הפעלת cytometer הזרימה ואת התוכנה, בחר אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור בצד ושער עבור תאים המבוססים על גודל. לאחר מכן צור שער בת עבור תאים בודדים עם אזור פיזור קדימה לעומת גובה פיזור קדימה.לאחר מכן, צור שער בת עבור תאים חיים עם DAPI לעומת אזור פיזור קדימה כדי לא לכלול את התאים החיוביים של DAPI. לאחר מכן צור שער בת עבור תאי מערכת החיסון החיוביים CD45 עם CD45 לעומת אזור פיזור קדימה. כעת, צור שער בת מהתאים החיוביים CD45 ובחר F480 לעומת CD11b כדי לזהות את ה- CD11b חיובי F480 חיובי ואת האוכלוסיות השליליות החיוביות של CD11b F480.לאחר מכן צור שער בת עבור תאים חיוביים מסוג CD11b F480 ובחר CX3CR1 לעומת IA-IE כדי לזהות הן את המקרופאגים החיוביים של CX3CR1 הקשורים לגבול IA-IE והן את המקרופאגים השליליים החיוביים של IA-IE של CX3CR1. לאחר מכן, צור שער בת עבור CD11b חיובי F480 חיובי CX3CR1 חיובי CX3CR1 מקרופאגים שליליים IA-IE ובחר F480 לעומת CD11b כדי לזהות הן CD11b גבוה F480 בינוני CX3CR1 חיובי CX3CR1 חיובי IA-IE של מקרופאגים אפילקסוס שליליים של קולמר ו CD11b חיובי F480 F480 גבוה CX3CR1 חיובי IA-IE מאקרופגים הקשורים לגבול. ואז מהאוכלוסייה השלילית F480 החיובית CD11b, שער עבור Ly6C לעומת IA-IE.בחר הן אוכלוסיה שלילית חיובית של IA-IE Ly6C והן תאים חיוביים שליליים של IA-IE Ly6C המתאימים בעיקר למונוציטים או לנויטרופילים. לבסוף, צור שער בת עבור CD11b חיובי F480 שלילי IA-IE שלילי IA-IE חיובי Ly6C אוכלוסייה שלילית ובחר CD11b לעומת CX3CR1. לאחר מכן זהה הן אוכלוסיות שליליות CX3CR1 גבוהות של CD11b והן אוכלוסיות שליליות חיוביות של CD11b CX3CR1.עבור Gating תאי T, לאחר אי הכללת התאים החיוביים של DAPI כמתואר לעיל, צור שער בת עבור תאי מערכת החיסון החיוביים CD45 עם CD45 לעומת FSC-A, ולאחר מכן צור שער בת מהתאים החיוביים CD45 ובחר TCR beta לעומת CD11b. אל תכלול את תאי המיאלואיד החיוביים CD11b ובחר באוכלוסיית תאי T-Cell T שלילית של CD11b. לבסוף, צור שער בת עבור האוכלוסייה השלילית CD11b חיובית של TCR beta ובחר CD4 לעומת CD8a.זהה הן תאי T שליליים והן תאי T חיוביים ל- CD8 ו- CD4 חיובי CD8 ותאי T שליליים CD4 חיוביים ל- CD8. ניתוחי ציטומטריית הזרימה שהודגמו כאן חשפו בהצלחה תת-קבוצות עיקריות של תאי מיאלואיד ו-T ומספרם הכולל היחסי לעכבר באופן רב לשחזור. ניתוח ציטומטריה זרימה של התאים המיאלואידיים מראה כי מקלעת choroid מאוכלסת על ידי CD11b חיובי CX3CR1 F480 חיובי F480 מקרופאגים הקשורים לגבול גבוה, המייצג 80% של CD45 תאי מערכת החיסון החיובית בקליעת choroid.זוהתה גם האוכלוסייה השלילית החיובית של ה-IA-IE של מקרופאגים האפילקסוס של קולמר. בקרב תאי החיסון השליליים F480 החיוביים של CD11b, התאפיינו שתי אוכלוסיות שונות של תאי IA-IE שליליים של Ly6C וסביר להניח שיתאימו לתאים דנדריטיים. אסטרטגיית הניתוח וההתהוות של תאי T הדגישה את נוכחותה של האוכלוסייה הקטנה של CD45 חיובי CD11b תאי בטא חיוביים TCR שליליים.ביניהם, על 30-50 CD8 CD8 שלילי CD4 חיובי CD4 CD4 חיובי CD4 תאי T שליליים לכל עכבר אכלס את מקלעת choroid בתנאים פיזיולוגיים. חשוב לשלוט על איכות הזלוף מאז כל זיהום דם עלול לטשטש את ההרכב החיסוני של מקלעת choroid. שיטה זו יכולה להיות מלווה על-ידי מיון של אוכלוסיות תאים נבחרות לניתוח נוסף כגון רצף RNA בצובר או תא יחיד.

isolation-characterization-immune-cells-from-micro-dissected-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את הליך בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכברים. הליך זה משמש במחקר נוירואימונולוגיה כדי להבין כיצד תאי מערכת החיסון במקלעת הכורואידים משפיעים על בריאות המוח ומחלות נוירולוגיות שונות.

בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכבר

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

מקלעת הכורואיד (CP), רקמה שלא נחקרה מספיק במדעי המוח, ממלאת תפקיד מפתח בבריאות ובמחלות של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקת מיקרודיסקציה לבידוד CP ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקבל מבט כולל על המבנה התאי שלו.

מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק הר שלם הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

למדו לבודד ולאפיין תאי מערכת חיסון מזכוכית זרחית עכבר באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי ואיכותי של אוכלוסיות תאים ייחודיות במוח.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

גלה סרטונים נוספים