ראיון: Antigen Presentation Glycolipid ידי CD1d ואת הפוטנציאל הטיפולי של הפעלת התא NKT

שלום, שמי מיטשל קרוננברג ואני מהמכון לאלרגיה ואימונולוגיה בלה חויה (La Jolla Institute for Allergy and Immunology). אני למעשה הנשיא והמנהל המדעי, אך יש לי מעבדת מחקר פעילה מאוד, ועל זה נדבר, כמובן, היא על אחת הטכנולוגיות שברשותנו, שהן טטרמרים של CD 1D. מרבית העבודה במעבדה שלי עוסקת בתאי T מגיבים ל-CD 1D.

תאים אלו הם ייחודיים מכיוון שהם מזהים גליקוליפידים ולא פפטידים. ענף נוסף במעבדה שלי עוסק בנושא שונה לחלוטין, מערכת החיסון הרירית והוויסות שלה. מולקולות CD1 הן מולקולות מציגות אנטיגן, ופירוש הדבר הוא שהן נקשרות לאנטיגנים, למקטעי חלבונים או למולקולות אחרות ומציגות אותם לזיהוי על ידי תאי T.

כעת, קיימים למעשה שני סוגים שונים של מולקולות מציגות אנטיגן. ישנן מולקולות המחזיקות או מציגות פפטידים, וישנן מולקולות המחזיקות ליפידים וגליקוליפידים. ומולקולות ה-CD one מחזיקות ליפידים וגליקוליפידים.

זהו תפקידם, והם מחזיקים או מציגים את הליפידים והגליקוליפידים הללו לתאי T. קיימים למעשה ארבעה סוגים שונים של מולקולות CD1: CD1A, B, C ו-D. למעשה, אנו מתמקדים ב-CD1D, ו-CD1D הוא ככל הנראה הנחקר ביותר, בין השאר בשל קיומם של מודלים בעכברים. CD1D מציג גליקוליפידים לסוג מסוים של תאי T הנקראים תאי natural killer T, תאי דם לבנים יוצאי דופן בעלי מאפיינים של התגובה החיסונית המולדת והנרכשת.

הגליקוליפידים המוצגים יכולים להיות גליקוליפידים עצמיים, אם כי אלו אינם מאופיינים היטב בשלב זה, או שהם יכולים להיות גליקוליפידים מיקרוביאליים. והגליקוליפידים שאנו יודעים שמוצגים מגיעים משני מקורות. אחד הוא מה שנקרא חיידקי FMS, שהם כנראה החיידקים הנפוצים ביותר בביוספירה.

הן חיות באוקיינוס, הן חיות בצמחים, והן חיות בקרקע. עם זאת, הן אינן גורמות למספר רב של אנשים לחלות. אני מניח שאנו רגילים מאוד לחיות לצד חיידקים אלו.

והקטגוריה השנייה שאנו מכירים, סוג שונה של גליקוליפיד הנקרא גליקוליפידים המכילים dyl glycerol. אלו נמצאים ב-Borrelia burgdorferi, הגורמת למחלת הלייים, וככל הנראה בפתוגנים רבים אחרים. אנו רק מגלים כעת אילו סוגים שונים של חיידקים מחזיקים בגליקוליפידים אלו.

אם כך, יש לנו את מה שנקרא ליפידים גליקוסנגליים מ-SMS וליפידים די-גליסרולים מ-Borrelia, וככל הנראה מרבים אחרים שהם פתוגניים באמת. ליפידים אלו נטענים על מולקולות CD 1D בתאי דנדריטיים, בעיקר, אם כי אלו יכולים להיות גם לימפוציטים B, תאי ER בכבד, ואולי סוגי תאים אחרים. מולקולות CD 1D אלו עוברות דרך ליזוזומים ואנדוזומים שבהם הן ככל הנראה נקשרות לליפידים הללו, ואז הן נושאות את הליפיד אל פני השטח של התא לצורך זיהוי על ידי תאי T, כולל תאי ה-natural Killer T שהזכרתי קודם לכן.

אחד הדברים שקורים כאשר נחשפים לחיידק המכיל גליקוליפידים הוא שתאי ה-NK T מופעלים במהירות רבה. תאי T קונבנציונליים, כלומר תאי T המגיבים לפפטידים, יידרשו בדרך כלל שלושה או ארבעה ימים כדי להוביל לתגובה חיסונית טובה, במיוחד אם הם אינם בעלי ניסיון קודם בחשיפה לאנטיגן.

במילים אחרות, במצב זה הם נאיביים. לעומת זאת, תאי NK T יכולים להיות מופעלים בתוך מספר שעות והם יתחילו לייצר ציטוקינים כמו gamma interferon, החשוב לסילוק חיידקים בפרק זמן קצר מאוד. ובדרך זו, הם דומים להיבטים של תגובת החיסון המולדת מהמודל.

מלימוד של אנטיגנים מודליים, אנו יודעים ש-CD 1D מגיע לאנדוזומים מאוחרים וליסוזומים, מדורים תוך-תאיים חומציים מאוד שבהם אנטיגנים גליקוליפידיים נטענים לתוך CD 1, ולמעשה קיימים חלבוני העברה מיוחדים בתוך תאי מציגת האנטיגן, כגון תאים דנדריטיים, המסייעים להטמעת הליפידים במולקולת CD 1D. במקרה של חיידקי fona, חיידקי borre ואחרים, אנו מתעסקים בחיידקים חוץ-תאיים. לכן, האנטיגנים הליפידיים חייבים להיות מובעלים באופן כלשהו לתוך התא, ככל הנראה לתוך ליסוזום, ושם להיטען לתוך מולקולת ה-CD 1.

ולאחר מכן מתרחשת הפעלה מיידית של תאי ה-NKT, וכל זה חייב להתרחש בתוך מספר שעות בסינוסואידים, בכבד, בטחול, ואולי במח עצם ובאתרים אחרים שבהם נמצאים תאי NKT. המבנה הטטראמרי הוא באמת המפתח להגדרה חד-משמעית של תאי Natural Killer T אלה, בעלי התכונות המולדות המבדילות אותם מתאי T אחרים. הסמנים האחרים הזמינים הם למעשה עמומים מדי, אך הטטראמרים מאפשרים לזהות את התאים על בסיס הספציפיות של הקולטן לאנטיגן, שזהו העובדה המרכזית המגדירה אותם; ייצור הטטראמרים התחיל כבר לפני זמן רב.

השיטה הומצאה על ידי Mark Davis ו-John Alman, והרעיון היה שקולטן תאי ה-T הוא בעל זיקה נמוכה, ואם רוצים להגדיר תאים או לזהות תאים על בסיס הספציפיות שלהם, הפפטידים שהם מזהים או הקומפלקסים של פפטידים ומולקולות מציגות אנטיגן אינם בעלי זיקה מספקת, או חוזק קישור מספיק, כדי לאפשר זיהוי של התא. לכן, מה ש-Mark Davis ו-John Allman המציאו היה את טכנולוגיית הטטראמרים, דרך ליצירת טטראמרים שבמקרים מסוימים הם OCRs של המולקולה המציגה אנטיגן בתוספת המולקולה שהם מציגים, מה שבעצם מגביר את הזיקה או את האפיניות של האינטראקציה. כך ניתן לראות את התא הספציפי לפפטיד של שפעת ומולקולה מציגה אנטיגן מסוימת, או כל אנטיגן אחר שמעניין אתכם.

טכנולוגיה חשובה מאוד מכיוון שהיא מאפשרת לך, למשל, לראות עד כמה יעיל עשוי להיות משטר חיסונים. מה שעשינו החל מסוף שנות התשעים, במקור במאמר שפורסם בשנת 2000 וכבר צוטט כ-500 פעמים עד כה, הוא פשוט להחיל את הטכנולוגיה הזו על ליפידים.

יצרנו מולקולות CD1 מסיסות ובאמצעות שיטות שאסביר מיד, הצלחנו להפוך אותן לטטראמרים, כלומר, להרכיב אותן יחד עם גליקוליפידים ספציפיים, ובדרך זו יכולנו להשתמש בהם כריאגנטים לבדיקת קולטני T-cell ספציפיים. במילים אחרות, אלו שיזהו את הגליקוליפיד שמעניין אותנו יחד עם CD1D. ניתן להשתמש בטטראמרים בכל סיטואציה שבה רוצים לנתח את מספר תאי ה-NKT, את מצב ההפעלה שלהם ואת תפקודם.

ובמעבדה שלנו, הדבר עשוי לנבוע מכל אחד ממספר פרויקטים שונים. לדוגמה, אם ברצונכם לבחון האם מוטציה מסוימת ומסלול איתות משפיעים על התפתחות תאי NK T, אנו יכולים לעשות זאת באמצעות הטטרמרים שלנו ולבדוק את מספר תאי ה-NKT. בנוסף, ישנם סמנים אחרים, חלבוני שטח תא אחרים שניתן לבחון כדי לעזור לנו להעריך אם תאי ה-NKT בשלים או אם הם הופעלו; באמצעות הטטרמרים, לאחר גירוי אנטיגני, אנו יכולים לבחון לא רק אם הם הופעלו, אלא גם אילו ציטוקינים הם מייצרים.

כך נוכל לשלב צביעת טטראמרים עם, למשל, צביעת ציטוקינים תוך-תאית ולשאול איזה אחוז מתאי ה-NKT מייצרים interferon gamma, איזה אחוז מייצרים IL four, ואיזה אחוז מייצרים את שניהם באמצעות ציטומטריה זרימתית רב-פרמטרית; אנו יכולים לשאול מגוון שאלות לגבי ייצור ציטוקינים ישירות ex vivo על ידי תאים אלה. כמו כן, נוכל לבצע ניסויים נוספים. לדוגמה, ניתן להשתמש בטטראמרים כדי לטהר תאי NK T לצורך תרבית in vitro כדי לבחון כיצד הם מקיימים אינטראקציה עם סוגי תאים אחרים, או אפילו לצורך העברה לבעל חיים מקבל, למשל כזה שחסר תאי NK T מסיבות גנטיות.

אנו מעוניינים לשחזר את התפקוד הזה. אנו יכולים לעשות זאת ולחקור היכן התאים מתמקמים וכיצד הם מתפקדים. לבסוף, אני יודע שבמקרה של תאי NKT אנושיים, חוקרים השתמשו למעשה בטטראמרים כדי להרחיב שורות תאים in vitro, במטרה לגדל תאים למטרות אנליטיות ואולי אף למטרות טיפוליות.

ובכן, אנו משתמשים במערכת ביטוי של נגיף Bao ליצירת טטראמרים של CD 1D. התהליך מתחיל עם מבנה DNA נפוץ המכיל פרומוטור וביטוי של ה-BID two microglobulin והשרשרת הכבדה של CD 1D. מולקולת CD one זו היא הטרודימר של שני פוליפפטידים.

אם כן, יש לנו מערכת ביטוי זו בעלת שני מקדמים (promoters), ואנו מדביקים תרביות של תאי רקמה של חרקים עם נגיפי vao שתוכננו בכמות מדויקת (titrated) כפי שהוסבר בערוץ שלנו. לאחר מכן, אנו מדביקים את התאים ואוספים מתוך תוצר התרבית את החלבון המבטא על ידי התאים. השרשרת הכבדה של CD 1D הונדסה במיוחד עבור ייצור טטראמרים.

ישנם שני דברים, או למעשה שלושה דברים שעליי לומר, שאנו מבצעים. אחד מהם הוא הסרת החלק הטרנס-ממברנלי. כלומר, אנו מבטאים חלבון מסיס.

שנית, הוספנו תג hexa-his כדי שהחלבון ניתן יהיה לטיהור באמצעות כרומטוגרפיה של יוני מתכת. ושלישית, יש לנו מה שנקרא אתר biotinylation אנזימטי. וזהו החידוש.

זה היה חשוב מאוד כאשר Davis ו-Alman המציאו לראשונה את הטכנולוגיה להפקת טטראמרים. לכן, לאחר שאנו אוספים את החלבון, הוא מטוהר באמצעות כרומטוגרפיית עמוד ניקל שם. לעיתים אנו מבצעים כרומטוגרפיית הֶחְלָפָה של גודל (size exclusion chromatography) לאחר מכן.

לאחר מכן ניתן לבצע ביוטינילאציה אנזימטית לחלבון, וברגע שהוא עבר ביוטינילאציה אנזימטית, דגירה עם strep ab תביא להיווצרות טטראמרים. עם זאת, ניתן לדגור את חלבון ה-CD1 המסיס שהופק למשך לילה בערך בתמיסה של גליקוליפיד רלוונטי. חשוב מאוד שהגליקוליפיד לא יהיה מומס ב-DMSO, המשמש בדרך כלל כמדלל או כממס עבור גליקוליפידים, מכיוון ש-CD1 רגיש מאוד לחומר זה.

בדרך כלל אנו משתמשים בבאפר המכיל כמות קטנה של tween ו-PBS. באפר זה יעיל מאוד להמסה של מרבית הגליקוליפידים שלנו. לצורך הטענה ל-CD 1D, שנראה כי מתרחשת באופן ספונטני, אנו משתמשים בסטראפטאווידין ממספר יצרנים שונים.

והוא הוצמד לצבעי pe, fico, eryn או PC phycocyanin, נראה שכל אחד מהם עובד היטב ומספק לנו צביעה טובה מאוד. לסיכום, למעשה הפרוצדורה אינה שונה במיוחד מהפרוצדורות המאופיינות היטב להכנת טטרמרים של MHC Class one, למעט העובדה שאיננו משתמשים בביטוי בקטריאלי, אלא בביטוי באמצעות וירוס של בקטריה, וכמובן שיש לנו אנטיגנים ליפידיים במקום פפטידים. נקודה אחת שעליי להדגיש היא שבבני אדם ישנם תאי NK T והם בעלי אותה ספציפיות כמו תאי NK T של עכבר.

אם כן, הספציפיות קיימת כבר לפחות 60 מיליון שנים מאז שנפרדנו מהמכרסמים, ולמעשה, אנו מייצרים טטראמרים של CD 1D אנושיים באמצעות אותן טכניקות שניתן לראות בסרטון שהופק כאן. עם זאת, למעשה, תאי NK T אנושיים עובדים היטב עם טטראמרים של עכברים ולהיפך. לכן, איננו מייצרים טטראמרים אנושיים בתדירות גבוהה פשוט מכיוון שאנו יכולים להשתמש בטטראמרים של העכברים עבור עבודה עם דגימות אנושיות.

קיימים דגמי עכברים רבים שבהם הוכח שתאי NK T מהווים גורמים מכריעים בתוצאה של התגובה החיסונית. טווח זה כולל את התגובה לסרטנים, ויסות של מחלות אוטואימוניות, סילוק של גורמים זיהומיים, ואפילו התפתחות של פלאקים סקלרוטיים. זהו תהליך דלקתי כרוני המתרחש בעורקים.

ישנן מספר שאלות לגבי חשיבותן של תאים אלו בבני אדם, שבהם הם פחות נפוצים; היו דיווחים רבים המצביעים על כך שהם משתנים במצבים של מחלות אוטואימוניות, וישנם גם דיווחים כי הם מרובים מאוד בריאותיהם של חולי אסתמה. למרות שדיווחים אלה, כולל דיווח אחד ב-England Journal of Medicine, שנויים במחלוקת, קיימים מספר מחקרים בבני אדם המצביעים על כך שתאים אלו עשויים להיות חשובים.

במונחים של ניסויים קליניים, גרייה של תאי NKT נבחנה בארבעה ניסויים של שלב 1 עבור חולי סרטן בשלבים מתקדמים. קיימות מספר ראיות ליעילות, כמובן שמדובר באנשים חולים מאוד, והמחקרים נמשכים במספר סוגים שונים של סרטנים. ישנם גורמים המעוניינים להשתמש בטיפול תאי NKT גם במחלות אוטואימוניות, אם כי תחום זה טרם התפתח באופן משמעותי.

טטראמרים עשויים למלא תפקיד במחקרים אלו בעיקר בהקשר של ניתוח המתרחש לתאי ה-NKT לאחר הטיפול באגוניסט. לפיכך, הרעיון הוא בדרך כלל להשתמש באגוניסטים גליקוליפידיים או במקרים מסוימים אף באנטגוניסטים גליקוליפידיים, אשר פותחים על ידי קבוצות אחרות, בהתאם לתגובה ולמצב. ולאחר מכן להעריך מה קורה, או מה קרה לתאי ה-NKT, פעולה שביצועה נעשה בדרך כלל באמצעות טטראמרים.

שימוש פוטנציאלי נוסף יהיה בהרחבה in vitro של תאי NKT אנושיים. זה בהחלט בר ביצוע ואפשרי לגדל מספרים גדולים של תאי NKT אנושיים in vitro, למשל, על ידי גרייה אנטיגנית, שניתן לבצע באמצעות טטראמרים או באמצעות תאים בעלי הגליקוליפידים המתאימים. ובנוסף לשימוש בטטראמר או בתאים, יש להוסיף ציטוקין.

אך תחת תנאים אלה, ניתן להרבות מספרים גדולים של תאי NK T אנושיים. ודבר נוסף הוא שלפחות קבוצה אחת בבוסטון מעוניינת בסוג זה של טיפול, בניגוד לטיפול המבוסס על גליקוליפידים. חלק נוסף מהמעבדה שלי עוסק בחקר של חסינות רירית.

מרבית האימונולוגים התמקדו בלימפוציטים או בתאי דם לבנים בקשרי הלימפה ובטחול. ועם זאת, ייתכן שרובם של תאים אלו נמצאים למעשה ברירית המעי, אתר שבו יש לנו ככל הנראה בין 10¹⁰ ל-10¹⁴ ו-10¹⁰ ל-10¹⁵ חיידקים. לפיכך, אנו סטריליים במידה רבה מנקודת מבט מיקרוביאלית, אך לא במעיים שלנו.

כמו כן, במעי קיים אוסף גדול מאוד של תאי דם לבנים. לתאים אלו תכונות ייחודיות והם למעשה אינם נחקרים מספיק. לכן, אנו עורכים מספר חקירות של מדע בסיסי בנוגע לתאים אלו.

אך אנו חוקרים גם תהליך של מה שהייתי מכנה דה-רגולציה חיסונית (immune dysregulation) במעי, המובילה למחלות מעי דלקתיות; אלו הן ביסודן מחלות ממקור חיסוני של המעי הדק או המעי הגס, והן נקראות מחלת קרוהן או קולוריטיס כיבית. ולמרות שאנו עורכים חלק מהמחקר בבני אדם, מרבית עבודתנו מתבצעת במודלים של עכברים. יש לנו מה שנראה לי כמודלים טובים מאוד של עכברים לדה-רגולציה של מערכת החיסון הרירית, המובילה לתסמינים דמויי מחלת קרוהן.

אנו חוקרים את התהליך הזה וכן דרכים להתערב בו, במטרה סופית לפתח טיפולים טובים יותר עבור מטופלים הסובלים ממחלות תיווך חיסוניות אלו. לסיכום, נוכל לחשוב מעט על הכיוון אליו פונה האימונולוגיה במהלך 10 השנים הבאות בערך, וזה באמת קשה לראות 10 שנים קדימה. מפתיע ככל שזה עשוי להישמע.

אני באמת חושב שמערכת החיסון הרירית היא אחד התחומים המרכזיים שטרם נחקרו מספיק באימונולוגיה. למרות שיותר ויותר אנשים, וקבוצות מחקר בולטות יותר ויותר, מגלים עניין במחקרים של אימונולוגיה רירית. אני חושב שתחום נוסף שתהיה לו השפעה אדירה הוא הגנטיקה, ובמיוחד גנטיקה אנושית; ככל שנתקדם אל עבר רצף של 1,000 גנומים אנושיים, יהיה זה באמת אפשרי לבצע מחקרים על פרטים בודדים ולהעריך כיצד שונות ב-DNA משפיעה על התגובה החיסונית.

נכון לעכשיו, מרבית המחקרים הטובים ביותר של מסלולים בסיסיים כוללים מכרסמים. מכרסמים, ובמיוחד עכברים, הם קריטיים למחקרים שלנו. אך אני סבור שבעתיד, כאשר נבחן תופעות אוטואימוניות מורכבות או תהליכים אחרים שעשויים להתרחש בבני אדם, נוכל לעשות זאת על בסיס פולימורפיזמים גנטיים אנושיים.

נוכל להעריך את הפולימורפיזמים ולאחר מכן להשתמש במידע זה כדי לנסות לחזות כיצד הדבר ישפיע על התגובות החיסוניות, ובסופו של דבר להתקדם לעבר מה שאני, וגם אחרים, מכנים טיפולים חיסוניים מותאמים אישית, או במובן רחב יותר, רפואה מותאמת אישית. לפיכך, לגנטיקה תהיה השפעה עצומה. כבר עומדים לרשותנו כלים מצוינים בגנטיקה של עכברים.

אנו יכולים לבצע השתקה (knock out) של כל גן שנרצה. אנו יכולים להשתיק את הביטוי של גנים בסוגי תאים ספציפיים. אנו יכולים לעשות דברים מדהימים.

אך אני סבור שבעתיד ננסה להבין את התגובה החיסונית ואת החסינות מנקודת המבט של תגובות אנושיות.