סטנדרטיזציה ותחזוקה של תרבויות כבד כבד קנים ומעיים תלת-ממדיות לשימוש במחקר ביו-רפואי

הפרוטוקולים לתרבות של כבד כלבים ואורגנוידים במעיים חשובים לתקנון טכנולוגיה חדשנית זו. טכניקה זו מאפשרת את ההקמה האמינה והניתנת לשחזור של תרבות האורגנוידים כולל בידוד האורגנויד, תחזוקה, קציר, ו biobanking הבאים של דגימות. אורגנוידים של כלבים יכולים לספק מודל מצוין ליישומים רבים המשתרעים על פני ביולוגיה, פיתוח מחלות זיהומיות, בדיקות וגילוי תרופות, וגם רפואת העברה.

כדי להתחיל, להכין חמישה צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של פתרון 1X שלם chelating פתרון, צינור אחד עם שלושה מיליליטרים של פתרון 1X שלמות כלאט, צינור ריק אחד, צינור אחד, צינור אחד עם חמישה מיליליטרים של פתרון 1X שלמות כלאט, ושני מיליליטר של סרום בקר עוברי. ביום הבידוד, הניחו צלחת פטרי סטרילית, אזמל, דלי קרח ותערובת חומרים מזינים DMEM מתקדמת קרה F12 בארון הבטיחות הביולוגית. מניחים את המספר הנדרש של צלחת תרבית תאים 24-well בחממת דו תחמוצת הפחמן כדי להתחמם מראש.

מניחים מטריצת ממברנה חוץ-תאית על קרח להפשרה. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. העבר מדיה מלאה עם גורמי גדילה מהמקפיא לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס תוך הימנעות מחשיפה ישירה לאור.

לנער דגימות רקמה בצינור התחבורה במשך 30 שניות. הסר supernatant מוגזם מבלי להשליך כל רקמה על ידי צנרת איטית ליד פני הנוזל עד 0.5 מיליליטר נשאר בצינור. מעבירים רקמות ונשארים סופר-טבעיים לצלחת פטרי סטרילית.

בעזרת אזמל חד פעמי, חותכים ומרככים את הרקמה לחתיכות קטנות יותר הדומות למחית במשך כחמש דקות. פיפטה הרקמה הטחונה עם נוזל מצלחת פטרי לצינור פתרון הכלאט המלא הראשון, ולאחר מכן להוסיף שני מיליליטרים של תערובת מזין DMEM מתקדמת F12 לצלחת פטרי. לשטוף את הרקמה הנותרת ולהעביר את צינור פתרון chelating המלא הראשון.

מערבולת 1X להשלים את צינור פתרון chelating כחמש פעמים במשך חמש שניות. אפשר ביופסיות להתיישב בתחתית הצינור במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant עד חמישה מיליליטר נשאר. העבר את פתרון הכלטינג המלא פי 1 מהצינור החדש לצינור הדגימה.

חזור על השלב הקודם עבור שני הצינורות הבאים. ובשתי השטיפות האחרונות, להסיר את supernatant עד שלושה מיליליטר שנותרו בצינור. מעבירים את הביופסיות ואת פתרון הכליטציה המלא פי 1 מצינור הדגימה לבאר אחת של צלחת שש בארות.

הוסף שלושה מיליליטרים של 1X פתרון chelating מלא לצינור מדגם. מערבבים בעדינות כדי לאסוף את כל הרקמה שנותרה ולהעביר לאותה באר של הצלחת. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של חומצה אתילן דיאמין טטראצטית 0.5 טטראצטית בבאר ומניחים את צלחת שש הבארות על רוקר 20 מעלות 24 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס.

לדגור על דגימות הכבד במשך 10 דקות ואת דגימות המעיים במשך שעה אחת על נדנדה נעה. העבירו את הצלחת בעלת שש הבארות בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית והעבירו את הרקמה הטחונה והנוזל לצינור המכיל פתרון כלאט מלא פי 1 עם סרום בקר עוברי. אפשר לרקמות להתיישב ולהעביר את supernatant עם 0.2 מיליליטר של החלק העליון של הרקמה לצינור ריק.

לסובב את הצינור המכיל את המדגם ב 700 XG במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. תאי גזע הם עכשיו גלולה יחד עם הרקמה הטחונה. הסר ולהשליך את supernatant בזהירות כדי לא להפריע את הכדור.

Resuspend את הכדור ב- DMEM F12 מתקדם. לסובב את הצינור שוב ולשאוף את supernatant מבלי להפריע לכדור. הוסף את הנפח המחושב של מטריצת ממברנה חוץ-תאית סולובילית לצינור הדגימה.

היזהר בעת הסרת מדיה כדי לא לאבד את גלולה התא. בעת הוספת מטריצת ממברנה חוץ תאית, פיפטה לאט לא ליצור בועות מוגזמות בהשעיית האורגנויד. שמור את המדגם עם מטריצת הממברנה החוץ תאית solubilized על קרח ולזרוע את ההשעיה באמצע הבארות, כך מטריצת קרום חוץ תאי solubilized יוצר מבנה דמוי כיפה.

להעביר את הצלחת לאינקובטור ולאפשר מטריצת קרום חוץ תאי solubilized להתמצק במשך 30 דקות. ערבבו מעכבי ROCK ובטא GSK3 במדיה מלאה עם גורמי גדילה והוסיפו 500 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור.

פרוטוקול אורגנויד כלבים מייצר בדרך כלל כ 50, 000 עד 150, 000 תאי מעיים או כבד לבאר. לאחר בידוד תאי גזע, אורגנוידים של כלבים כבדיים מתחילים את מחזור החיים שלהם כספרואידים מתרחבים, ואחרי שבעה ימים, הם הופכים לאורגנואידים ניצנים ומבדלים. הנפח, שטח הפנים, אזור האליפסה הדו-ממדית וההיקף של הספרואידים חושבו.

אזור אליפסה דו-ממדי והיקפו שימשו להערכת בריאותה של תרבות האורגנויד. הערכת הביטוי של הסמנים באופן חצי כמותי הראתה כי הספרואידים מבטאים באופן מועדף את סמן כולנגיוציט KRT7 הנע בין אחד ל -26% ביטוי סמן תא הגזע LGR5 נע בין 0.17 ל 0.78%, בעוד סמני hepatocyte באו לידי ביטוי במידה נמוכה יותר ב 0.05 עד 0.34% עבור תיבת מזלג 1A ו 0.03 עד 0.28% עבור ציטוכרום-P450. דגירה של 12 דקות עם פרוטאז דמוי טריפסין לא מנעה צמיחה אורגנויד.

עם זאת, הצמיחה של organoids הושפע לרעה באמצעות דגירה של 24 דקות. שרידותם של אורגנוידים כבדים של כלבים בסביבה שלילית נותחה כדי לקבוע את נפח המדיה האורגנוידית ואת מטריצת המרתף הדרושה לצמיחה והישרדות מוצלחות של אורגנוידים כבדיים. שיעור ההישרדות של organoids נע בין 12.9 ימים ל 18 ימים.

טכניקות בסיסיות של תרביות תאים וגישות אספטיות הן התנאים המוקדמים החיוניים לבידוד ותחזוקה נאותים של אורגנויד.