Name: הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למדו שיטה להערכת חמצון מצע אנרגיה בתאים באמצעות מעקב אחר פליטת CO2 מסומן. השיטה מותאמת לסוגי תאים שונים ומסייעת בחקר הפרעות מטבוליות וגמישות מטבולית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה בחלקה על ידי מענק NIH R01 AR060456 (FL). אנו מודים לד"ר מייקל רובינסון ואליזבת קריזמן (בית החולים לילדים של פילדלפיה) על עזרתם הנדיבה במונה ההברקה.

השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) דורש אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד. RAMs המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בריאות ובטיחות קרינה סביבתית (EHRS) באוניברסיטת פנסילבניה. השימוש בבעלי חיים דורש אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד הביתי. המחקר הבא אושר על ידי IACUC בבית החולים לילדים בפילדלפיה.
1. הכנת פתרונות מלאי ל-14מצעים עם תווית C
<ol><li>הכינו תמיסת מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA) של 4 מ"מ על ידי ערבוב של 11 גרם BSA ו-33.1 מ"ל של מי מלח עם מאגר פוספט (DPBS) של Dulbecco וניעורו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך כ-3 שעות עד להמסת BSA במלואה. מחממים את תמיסת המלאי של BSA באמבט מים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
	<li>50 μCi יבש באוויר 14C-oleate (50 μCi/μmol באתנול) בבקבוקון עם המכסה כבוי במשך 8 שעות במכסה מנוע עבודה ייעודי של זיכרון RAM. מוסיפים 312.5 μL של H2O ולאחר מכן 3.5 מ"ג (11.5 מיקרומול) של נתרן oleate. מערבבים היטב.</li>
	<li>מחממים את התמיסה המתקבלת ל-70 מעלות צלזיוס באמבטיית מים. הוסף 0.9375 מ"ל של תמיסת המניות BSA שתוכננה מראש כדי להניב תמיסת מלאי אולט חם של 10 mM (המכילה יחס של 1:11.5 של 14C-oleate לאולט ללא תווית). Aliquot את פתרון המלאי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.</li>
	<li>יש להשתמש ב-14C-גלוקוז וב-14C-גלוטמין מיד לאחר ההפשרה.</li>
</ol>2. הכנת תווך המכיל 14מצעים המסומנים ב-C
הערה: כדי להבטיח ריכוזים אמינים של מצעי אנרגיה במדיה, יש להשתמש במדיה מותאמת אישית עם מצעים טריים שנוספו זמן קצר לפני השימוש. כאן נעשה שימוש במדיום חיוני מינימלי מותאם אישית (MEMα) ללא גלוקוז, פירובט, גלוטמין, פנול אדום או נתרן ביקרבונט. עם זאת, יש לקבוע תווך אופטימלי עבור כל סוג תא.
<ol><li>שחזרו 8.67 גרם של האבקה הבינונית ב-1 ליטר של מים מטוהרים. הוסף 2.2 גרם של נתרן ביקרבונט כדי להשיג pH של 7.4 ולסנן את התמיסה באמצעות סינון ואקום 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>הוסיפו מרכיבים טריים כדי להשיג את המדיום השלם (cMEMα) עם ריכוזים סופיים של 5.5 mM גלוקוז, 2 mM גלוטמין, 1 mM פירובט ו-10% סרום בקר עוברי (FBS). תוספים נוספים ל-cMEMα עם 100 mM L-קרניטין ו-10 מיקרומטר HEPES כדי להקל על חמצון חומצות השומן.</li>
	<li>מיד לפני השימוש, הוסיפו 14מצעים עם תווית C ל-cMEMα שהוכן לאחרונה כדי ליצור מדיה חמה. כדי להפוך את המדיום החם של האולאט, הוסף את תמיסת האולאט החם של 10 מ"מ ל-cMEMα לריכוז סופי של 100 μM oleate (דילול 1:100, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL). הערה: מלאי האולאט החם של 10 mM המכיל יחס של 1:11.5 של אולט חם:קר (ראה שלב 1.3) משמש להשגת רמה פיזיולוגית של 100 μM סה"כ אולאט במדיה תוך מזעור כמות החומר הרדיואקטיבי.</li>
	<li>הפוך 10 mM מלאי oleate ללא תווית על ידי הוספת 24.36 מ"ג של נתרן oleate ל 2 מ"ל של H2O באמבט מים ב 70 °C ב 70 ° C במשך ~ 20 דקות עד מומס לחלוטין לפני ערבוב במהירות עם 6 מ"ל של 4 mM BSA תמיסת מלאי מתוכנן מראש ל 70 ° C. מעבירים לאמבטיית מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ומסננים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.</li>
	<li>כדי להפוך את הגלוקוז לבינוני חם, הוסיפו 14C-גלוקוז לריכוז סופי של 1.333 μM (1:4,125 דילול, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL). כדי להפוך את הגלוטמין לבינוני חם, הוסיפו 14C-גלוטמין לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר (1:1,000 דילול, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).</li>
	<li>השלימו את מדיום הגלוקוז והגלוטמין החם בתמיסת מלאי של 10 מ"מ של אולאט ללא תווית משלב 2.4 כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 μM oleate, זהה לזה שבמדיום החם של האולאט.</li>
</ol>3. הכנת תאים
הערה: פראוסטאובלסטים קלבריים ומקרופאגים של מח עצם משמשים כדוגמאות כאן. המשתמשים צריכים להכין את סוג התא שלהם לפי הפרוטוקולים המתאימים. מטב את הריכוז של קולגן II שישמש לעיכול בניסויי פיילוט מכיוון שהפעילות האנזימטית עשויה להשתנות בין הרבה דברים שונים.
<ol><li>בידוד ותרבות של פראוסטאובלסטים קלבריאליים<ol>
<li>הקרב את הגורים לאחר הלידה 3-5 (P3-5) על ידי עריפת ראשים והעבר אותם ל-DPBS קר כקרח המכיל פניצילין-סטרפטומיצין (P/S).</li>
		<li>חשוף את הקלבריה על ידי הסרת העור והרקמות הרכות. אסוף את האזור האמצעי על-ידי חיתוך הרקמות הסובבות מאחורה לחזית ב-DPBS (איור 1A). מגרדים את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לסייע בשחרור התאים בעת העיכול הבא.</li>
		<li>מכינים תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-4 מ"ג/מ"ל של קולגן מסוג II ב-DPBS ומסננים כל תמיסה עם מסנן טרי של 0.22 מיקרומטר. מעכלים תחילה את הקלבריה המנוקה עם תמיסת הקולגן של 2 מ"ג/מ"ל למשך 15 דקות ומשליכים את תמיסת העיכול. לעכל את הדגימות המנוקות בתמיסת קולגן 4 מ"ג/מ"ל 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם, תוך איגום וחיסכון בתמיסת העיכול.</li>
		<li>סנן את תמיסת העיכול דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה של הסכל ב-300 × גרם למשך 5 דקות. החייאת גלולת התא ב-cMEMα (ראה שלב 2.2) המכילה 10% FBS ו-P/S.</li>
		<li>לספור ולזרוע את התאים ב 4 × 104 תאים / ס"מ2 ב 10 ס"מ צלחות. תרבית את התאים באינקובטור 37 °C עם 5% CO2 במשך 3 ימים.</li>
		<li>נתקו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין-EDTA. ספרו וזרעו את התאים בצלחות תרבית תאים של 24 בארות עם cMEMα המכילות 10% FBS ו-P/S ב-7.5 × 105/ס"מ2. זרעו לפחות 4 בארות לכל סוג תא לכל מצע ולפחות שלוש בארות נוספות עבור כל סוג תא לספירת תאים לפני הבדיקה.</li>
		<li>תרברו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני בדיקות חמצון המצע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד ותרבות של BMMs הערה: תרבית של BMMs דורשת גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF), אשר ניתן לרכוש באופן מסחרי כחלבון רקומביננטי. מדיום מותנה מקו התא CMG14-12 שהונדס כדי לבטא M-CSF הוא חלופה חסכונית המשמשת כאן13.<ol>
<li>אספו עצם הירך והטיביות מעכברים בני 8 שבועות לאחר הסרת השרירים ורקמות החיבור. חותכים ומשליכים את שני קצות העצמות במספריים חדים.</li>
		<li>שטפו את מח העצם מעצם הירך אחת וטיביה אחת לתוך צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם מזרק המצויד במחט 23 גרם המכילה 15 מ"ל של cMEMα עם 10% FBS, P/S, ו-10% CMG14-12 בינוני מותנה (BMM בינוני). תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
		<li>לאחר 3 ימים, יש להשליך את מדיית התרבות ולשטוף עם DPBS. נתקו את התאים המחוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות. צנטריפוגה והחזרת גלולת התא בתווך BMM.</li>
		<li>לספור ולזרוע את התאים בלוחות תרבית תאים של 24 בארות ב-7.5 × 105/ס"מ2 באותו אופן שתואר ב-3.1.6. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס לילה במדיום BMM לפני תחילת הבדיקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. בדיקת חמצון מצע עם מלכודת CO2
הערה: יש לקבוע צפיפות זריעה מתאימה עבור כל סוג תא כדי להשיג מפגש של 80-90% לפני תחילת הבדיקה. שים לב שצפיפות התאים יכולה להשפיע על המצב המטבולי של התאים.
<ol><li>שטפו את התאים בבארות הנוספות פעמיים באמצעות DPBS. נתקו את התאים עם 0.25% טריפסין-EDTA ותאי תערובת של 20 μL שעברו החייאה ב-DPBS עם 20 μL של תמיסת צבע מסחרית מוכנה לשימוש של 20 מיקרול'ידין כתום/פרופידיום יודיד (AO/PI). קבע את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי ורשום את המספר לחישובים סופיים.</li>
	<li>לשטוף את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם DPBS. הוסיפו 500 μL של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה התרביות המיועד ל-RAM. אטמו את הצלחות בפרפילם ודגרו את התאים באינקובטור המיועד ל-RAM ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.</li>
	<li>במהלך הדגירה, חותכים את נייר הסינון לחתיכות עגולות מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינורות מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל ומכניסים את הנייר בנוחות לתוך המכסה (איור 1B). הוסיפו 200 μL של 1 M חומצה פרכלורית לכל צינור ו-20 μL של נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך המכסה.</li>
	<li>לאחר הדגירה של התאים, מעבירים 400 μL של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים וסוגרים את הכובעים מיד. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.</li>
	<li>במהלך הדגירה, קבעו בקבוקון סקינטילציה לכל צינור ומלאו אותו ב-4 מ"ל של נוזל ציצית. מעבירים כל פיסת נייר סינון לבקבוקון חרטום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>בצע בדיקות מגבונים על מכסה המנוע של תרבית הרקמה, אמבט המים (המשמש להכנת 14C-oleate), מקרר, אינקובטור, כיור, קרקע וכל אזור עבודה אחר לזיהום זיכרון RAM פוטנציאלי. מכניסים את מגבוני הנייר לבקבוקוני סקינטילציה המכילים נוזל סקינטילציה.</li>
	<li>מדוד רדיואקטיביות של 14C בבקבוקוני ה-scintillation באמצעות מונה נצנוץ. הקלט את תוצאות הקריאה. נטרל את סביבת העבודה בהתאם להנחיות בטיחות הקרינה במידת הצורך.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
הערה: בהנחה שכל מצע מחומצן באופן מלא כדי לשחרר CO2, ניתן לחשב את קצב חמצון המצע מהרדיואקטיביות CO2 הלכודה.
<ol><li>חישוב קצב חמצון המצע באמצעות Eq (1) וערכי X, Y ו-Z המופיעים בטבלה 1 עבור מצעים שונים. קצב חמצון המצע (μmol/cell/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>חשב היטב את סך ההתפוררות לדקה (DPM) עבור כל תגובה. עבור X, השתמש בערך DPM (קריאת מונה נצנוץ) מ-0.4 מ"ל של מדיום התגובה המשמש ללכידת CO2 מתוך 0.5 מ"ל של מדיום התגובה הכולל. לכן, ה-DPM הכולל מכל תגובה היטב הוא X × 1.25.</li>
		<li>חלקו את ה-DPM הכולל בפקטור של 2,220,000 כדי להמיר ל-μCi.</li>
		<li>המרת הרדיואקטיביות ב-μCi למספר של 14מולקולות המסומנות ב-C. חלק את ערך μCi בפעילות הספציפית (Y) של כל מצע מסומן. השתמש בערכי Y הבאים (טבלה 1): 14C-גלוקוז: 300 mCi/mmol; 14 C-גלוטמין: 200 mCi/mmol; 14 C-oleate: 50 mCi/mmol.</li>
		<li>חשב את המספר הכולל של מולקולות מחומצנות מ-14המולקולות המחומצונות המסומנות כ-C על-ידי הכפלת האחרונה בגורם הדילול החם לסך הכל (Z). השתמש בערכי Z הבאים (טבלה 1): גלוקוז: 4,125; גלוטמין: 1,000; oleate: 12.5.</li>
		<li>חלקו את המכפלה המתקבלת במספר תא (cell#) וב-4 (עבור זמן התגובה של 4 שעות) כדי לקבוע את קצב חמצון המצע לכל תא. השתמש בתא# שנקבע בבארות המקבילות בתחילת הבדיקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
<li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li>
<li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li>
<li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids%2C+ketone+bodies+and+pyruvate%2C+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation%2C+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li>
<li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li>
<li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+osteoblast%3A+implications+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li>
<li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).</li>
<li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li>
<li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li>
<li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+glucose%2C+glutamate%2C+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li>
<li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li>
<li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

הפרוטוקול מספק שיטה קלה לשימוש לקביעת קצב החמצון של מצעי אנרגיה עיקריים. זוהי חלופה פשוטה יותר לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בצלוחיות המכילות באר מרכזית ומכוסות בפקקי גומי 14,15,16. למרות שהמחקר לדוגמה כאן מבוצע עם תרבית תאים, ניתן להתאים את השיטה בקלות לגולשי רקמות או להומוגנטים של רקמות המכילים מיטוכונדריה שלמה, כפי שתואר קודם לכן17.
כמה צעדים מרכזיים שיש לקחת בחשבון בפרוטוקול ז...

זרחון חמצוני (OXPHOS) באאוקריוטים הוא התהליך שבו חומרי מזון מתפרקים בתוך המיטוכונדריה כדי לשחרר אנרגיה כימית בצורה של ATP באמצעות צריכת חמצן.  קטבוליזם של מצעים שונים בתוך המיטוכונדריה באמצעות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) מייצר מעט מולקולות ATP ישירות, אלא מאחסן אנרגיה באמצעות הפחתה של נושאי האלקטרונים ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD+) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD+). לאחר מכן הנשאים המופחתים מתחמצנים על ידי ETC הממוקם על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה כדי ליצור שיפוע ריכוז פרוטונים על פני הממברנה. הפרוטונים זורמים בסופו של דבר במורד השיפוע שלהם בחזרה לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית דרך ATP synthase כדי לייצר ATP. OXPHOS הוא האמצעי היעיל ביותר לייצור ATP מצעי אנרגיה ומועדף בדרך כלל בסביבות אירוביות. בעבר, גליקוליזה אירובית - ייצור של לקטט מגלוקוז בזמן שיש חמצן - נחשבה לפתופיזיולוגית, לעתים קרובות סימן היכר של תאים סרטניים. יותר ויותר, מתגלה כי כמה סוגי תאים נורמליים משתמשים בגליקוליזה אירובית מסיבות שעדיין לא פוענחו במלואן.
גמישות מטבולית היא היכולת של תאים או אורגניזמים להסתגל לדרישות האנרגיה המשתנות ולמקורות הדלק הזמינים. לדוגמה, הביקוש האנרגטי של שרירי השלד נענה בעיקר על ידי OXPHOS במצב יציב אך על ידי גליקוליזה אנאירובית במהלך תרגיל בעצימות גבוהה1. ככל שמשך הפעילות הגופנית גדל, חמצון הגלוקוז וחומצות השומן תורמים יותר לייצור האנרגיה הכולל2. עם זאת, השימוש במצע אינו תלוי רק בזמינות, שכן מצעים מתחרים באופן אנטגוניסטי במהלך חמצון. בעיקר, חמצון חומצות שומן הוכח כמעכב את ניצול הגלוקוז על ידי שרירי השלד בתופעה הידועה בשם אפקט רנדל3. השפעה הדדית הודגמה על ידי מחקרים מאוחרים יותר 4,5. בנוסף, מחלות רבות קשורות לשינוי בהעדפת המצע ולהתפתחות של חוסר גמישות מטבולית בתאים. לדוגמה, חמצון חומצות שומן מופחת בשריר השלד של חולי סוכרת מסוג II בהשוואה לנבדקי ביקורת רגילים6. השינויים המטבוליים בהגדרות המחלה הם נושא לחקירה אינטנסיבית מכיוון שהם עשויים לתרום לפתוגנזה.
חילוף החומרים האנרגטי בסוגי תאי השלד הוא יחסית לא מובן מאליו, אך זכה לתשומת לב בשנים האחרונות7. עבודות קודמות הראו כי גליקוליזה אירובית היא מסלול האנרגיה הדומיננטי באוסטאובלסטים קלבריאליים, בעוד שחמצון גלוקוז באמצעות מחזור TCA ממלא תפקיד בהיווצרות אוסטאוקלסט 8,9. אחרים סיפקו ראיות לחומצות שומן כמקור אנרגיה לאוסטאובלסטים10. כמו כן, הוכח כי קטבוליזם של גלוטמין תומך בהתמיינות אוסטאובלסט מאבותאבותיהם 11,12. עם זאת, עדיין חסרה הבנה מקיפה של שימוש במצע על ידי סוגי תאי שלד שונים. בנוסף, שינויים בחילוף החומרים התאי במהלך התמיינות תאים או בתגובה לאותות פתולוגיים צפויים לשנות את ניצול מצע הדלק. להלן פרוטוקול קל לשימוש לבדיקת חמצון מצע במבחנה.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SLGVM33RS</td><td>משמש לסינון תמיסת BSA</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>ניתוק תאים מלוחות תרבית תאים</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>משמש לדגירת תגובה</td></tr><tr><td>צלחות 10 ס"מ</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>משמש לתרבית תאים</td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>302995</td><td>משמש לשטיפת מח עצם מעצמות ארוכות</td></tr><tr><td>10%</td><td>FBS אטלנטה ביולוגית</td><td>S11550</td><td>לתרבית תאים תכשיר בינוני</td></tr> <tr><td>14C-גלוקוז</td><td>פרקיןאלמר</td><td>NEC042X050UC</td><td>משמש לייצור מדיה חמה</td></tr><tr><td>14C-גלוטמין</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>משמש לייצור מדיה חמה</td></tr><tr><td>14C-oleate</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>משמש לייצור מדיה חמה</td></tr><tr><td>מחט 23 גרם</td><td>BD</td><td>305120</td><td>משמש לשטיפת מח מעצמות ארוכות</td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>משמש לתרבית תאים</td></tr><tr><td>70 &mu; m מסנני תאים</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>משמש לסינון סופרנטנט במהלך עיכול קווארי</td></tr><tr><td>צבע אקרידין תפוז/פרופידיום יודיד (AO/PI)</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>מכתים תאים חיים לקביעת צפיפות הזרעים</td></tr><tr><td>סרום בקר Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>משמש לצימוד חומצות שומן</td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>קבע את מספר התאים ברי קיימא</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>המשמש לתאי גלולה</td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג II</td><td>וורת'ינגטון LS004176</td><td></td><td>ניתוק תאים מרקמה</td></tr><tr><td>מותאם אישית MEM אלפא</td><td>GIBCO</td><td>מק"ט: ME 18459P1</td><td>משמש ליצירת מדיה חמה מותאמת אישית</td></tr><tr><td></td><td>10010023</td> <td>ג'יבקו עם חוצץ פוספט של Dulbecco</td><td>משמש להמסת ודילול ריאגנטים, ושטיפת כלי תרבית</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>מלכודות CO2 עם נתרן הידרוקסיד</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>g7528</td><td>משמש לייצור מדיה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>מלכודות CO2 במהלך תרבית תאים</td></tr><tr><td>L-קרניטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0283</td><td>תוסף לחמצון חומצות שומן</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>g3126</td><td>משמש לייצור מדיה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>MEM אלפא</td><td>תרמו</td><td>A10490</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney אריזת פלסטיק</td><td>PM998</td><td>משמש לאיטום כלי תרבית תאים</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר</td><td>15140122</td><td>מונע זיהום בתרבית תאים</td></tr><tr><td>חומצה פרכלורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>משחררת CO2 במהלך בדיקה מטבולית</td></tr><tr><td>פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>p5280</td><td>משמש לייצור מדיה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>מונה נצנוץ</td><td>בקמן קולטר</td><td>LS6500</td><td>קובע רדיואקטיביות מנייר הסינון</td></tr><tr><td>Scintillation Fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>לספוג את האנרגיה הנפלטת מזיכרונות RAM ולפלוט אותה מחדש כהבזקי אור</td></tr><tr><td>בקבוקון נצנוץ</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>מיכלי תגובה לנוזל</td></tr><tr><td>נצנוץ נתרן פחמתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>מאגר איזון לנתרן</td></tr><tr><td>הידרוקסיד</td> בינוני <td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>לוכד CO2 במהלך בדיקת metaboilc</td></tr><tr><td>נתרן אולאט</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA הכנת חומצות שומן מצומדות</td></tr><tr><td>סינון ואקום 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>מסנן cMEM ואלפא;</td></tr></tbody></table>

הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת co 2 14

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

המיטוכונדריה מארחת את המכונות למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) ולשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), המייצרות אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי לשמור על הומאוסטזיס של אנרגיה. גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו הם מצעי האנרגיה העיקריים המניעים את הנשימה המיטוכונדרית ברוב התאים הסומאטיים. עדויות מראות שלסוגי תאים שונים עשויה להיות העדפה מובהקת למצעים מסוימים. עם זאת, ניצול המצע על ידי תאים שונים בשלד לא נחקר בפירוט. יתר על כן, מכיוון שמטבוליזם תאי מכוון לשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, הערכות ישירות של תלות במצע בתאי השלד עשויות לספק תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות עצם.
הפרוטוקול הבא מבוסס על העיקרון של שחרור פחמן דו חמצני ממולקולות מצע לאחר זרחון חמצוני. על ידי שימוש במצעים המכילים אטומי פחמן המסומנים באופן רדיואקטיבי (14C), השיטה מספקת בדיקה רגישה וקלה לשימוש לקצב חמצון המצע בתרבית תאים. מקרה בוחן עם פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) מדגים ניצול שונה של המצעים העיקריים בין שני סוגי התאים.

בדוגמה זו, שיטת לכידת CO2 משמשת להשוואת חמצון המצע על ידי פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת BMMs, המשמשים לעתים קרובות עבור אוסטאובלסט במבחנה או התמיינות אוסטאוקלסט או אוסטאוקלסט, בהתאמה. לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתרבית ב-cMEMα במהלך הלילה, הם בדרך כלל מגיעים ל-80-90% מהמפגש ומציגים את המורפולוגיה האופיינית להם. הקדם-אובלסטים הקלבריים גדולים משמעותית מ-BMMs (איור 2). כל סוג של תא נתון לבדיקות חמצון עבור גלוקוז, גלוטמין ואולאט על ידי ביצוע שלבים 4.1 עד 4.7. התוצאות מנותח...

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור 14CO2 במבחנה.

הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

השימוש במצעי אנרגיה שונים הוא גם ספציפי לסוג התא וגם מעיד על מחלה. מדידת הצריכה של המצעים הספציפיים יכולה לשפוך אור הן על הביולוגיה הרגילה והן על הפתולוגיה. הטכניקה אינה זקוקה לציוד מיוחד וקלה להרחבה.הוא גם קל יותר לשימוש מאשר שיטות קודמות שפורסמו. הבנת השינויים בקצב חמצון המצע תאפשר התפתחות של התערבויות תזונתיות ופרמקולוגיות להפרעות מטבוליות. למרות שהיא מודגמת עם רקמת עצם טכניקה זו מותאמת אישית בקלות כדי לחקור גמישות מטבולית בכל סוגי התאים ומספקת הבנה הן של הגורמים והן של ההשלכות של שינויים מטבוליים.לאחר הקרבת הגורים במשך שלושה עד חמישה ימים לאחר הלידה, העבירו אותם ל-D PBS קר כקרח המכיל תמיסת אנטיביוטיקה כפולה לפניצילין סטרפטומיצין. חשוף את הקלבריה על ידי הסרת העור והרקמות הרכות. אסוף את האזור האמצעי על ידי חיתוך הרקמות הסובבות מאחור לחזית ב- D PBS.מגרדים את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לסייע בשחרור התאים בעת העיכול הבא. מכינים 2 ו-4 מיליגרם לתמיסות מיליליטר של קולגן מסוג 2 ב-D PBS ומסננים כל תמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר טרי. ראשית, לעכל את הקלבריה המנוקה עם שני מיליגרם לכל מיליליטר קולגן תמיסה במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשליך את תמיסת העיכול.לאחר מכן, לעכל את הדגימות הנקיות בארבעה מיליגרם לכל מיליליטר קולגן תמיסה שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם. לאחר מכן, משכו את תמיסת העיכול ושמרו אותה. סנן את תמיסת העיכול דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה של הסכלאט ב-300 RCF למשך חמש דקות.להשעות מחדש את גלולת התא במדיום אלפא MEM מלא המכיל 10%FBS ופניצילין סטרפטומיצין תמיסה אנטיביוטית כפולה. לספור ולזרוע את התאים בצלחת של 10 סנטימטרים. תרבית את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שלושה ימים.לאחר מכן, נתקו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 0.25 טריפסין EDTA. לאחר העיכול, ספרו וזרעו את התאים בצלחת תרבית תאים של 24 היטב עם מדיום אלפא MEM שלם המכיל 10%FBS ופניצילין סטרפטומיצין תמיסה אנטיביוטית כפולה. זרעו לפחות ארבע בארות לכל סוג תא לכל מצע, ולפחות שלוש בארות נוספות לכל סוג תא לספירה לפני הבדיקה.תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר הסרת השריר ורקמת החיבור מעכברים בני שמונה שבועות ואיסוף עצם הירך והטיביות, חותכים ומשליכים את שני קצות העצמות במספריים חדים. שטפו את מח העצם מעצם הירך מעצם הירך וטיביה אחת לתוך צלחת פטרי טרייה בקוטר 10 ס"מ עם מזרק המצויד במחט 23 מדים המכילה 15 מיליליטרים של מדיום אלפא MEM שלם עם תמיסת אנטיביוטיקה כפולה של 10% פניצילין סטרפטומיצין, ו-10% CGM 14 12 בינוני מותנה.תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שלושה ימים משליכים את מדיית התרבית ושוטפים את התאים ב-D PBS. נתקו את התאים המחוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין EDTA למשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולת התא בתווך BMM. לספור ולזרוע את התאים בצלחת תרבית תאים של 24 באר לפי ההליך שתואר קודם לכן. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס לילה במדיום BMM לפני תחילת המבחנים.שטפו את התאים בבארות הנוספות פעמיים עם D PBS. נתקו את התאים עם 0.25% טריפסין EDTA. להשעות מחדש 20 מיקרוליטרים של תאים מעוכלים ב- D PBS.עם 20 מיקרוליטרים של תמיסת צבע כתום אקרידין ופרופידיום יודיד, קבעו את מספר התאים החיים עם מונה תאים אוטומטי ותעדו את המספר. לשטוף את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם D PBS. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה המנוע המיועד לתרביות רקמה המיועדות ל-RAM.לאחר איטום הצלחת עם parafilm, דגירה של התאים באינקובטור המיועד RAM ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. במהלך הדגירה, חותכים נייר מסנן לחתיכות עגולות, מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינור המיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומכניסים את הנייר בנוחות לתוך הכובע. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חומצה פרכלורית טוחנת אחת לכל צינור ו-20 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך הפקק.לאחר דגירה של התאים, מעבירים 400 מיקרוליטרים של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים וסוגרים את הפקקים באופן מיידי. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה. מקבילים במהלך הדגירה הקימו בקבוקון סקינטילציה לכל צינור וממלאים אותו בארבעה מיליליטרים של נוזל נצנוץ.מעבירים כל פיסת נייר מסנן לבקבוקון חרטום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בצע בדיקות מגבונים על מכסה המנוע של תרבית הרקמה, על אמבט המים, על המקרר, על האינקובטור, על הכיור, על הקרקע ועל כל אזור עבודה אחר לאיתור זיהום פוטנציאלי של זיכרון RAM. מכניסים את מגבוני הנייר לבקבוקוני סקינטילציה המכילים נוזל סקינטילציה.מדוד את פעילות הרדיו של פחמן 14 בבקבוקוני ה-scintillation באמצעות מונה נצנוץ ותעד את תוצאות הקריאה. נטרל את סביבת העבודה, על פי הנחיות בטיחות הקרינה, במידת הצורך. האיור משווה חמצון מצע על ידי קלבריה ראשונית קדם-אוסטאובלסטים לעומת BMMs.לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתורגבים בתרבית במדיום אלפא MEM שלם בן לילה, הם בדרך כלל מגיעים למפגש של 80 עד 90% ומציגים את המורפולוגיה האופיינית להם. הקדם-אוסטאובלסטים הקלבריאליים גדולים משמעותית מ-BMMs. התוצאות של חמצון המצע הראו כי קצב החמצון של כל מצע גבוה משמעותית בפרה-אוסטאובלסטים של קלבריה מאשר ב-BMMs, מה שככל הנראה מצביע על ייצור אנרגיה גבוה יותר על ידי זרחון חמצוני בפרה-אוסטאובלסטים.הנייר השלישי שהוכנס צריך להיות מעט גדול יותר ממכסה צינור עליון של 1.7 מיליליטר. ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם צריכת חמצן ולקבוע את הקצב הכולל של זרחון חמצוני וייצור הנקה בתאים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את השימוש במצע במהלך שלבי הבחנה שונים או הגדרות מחלה.עם הידע הזה אנחנו יכולים לפתח התערבויות עבור הפרעות מטבוליות.

assessing-energy-substrate-oxidation-in-vitro-with-14co2-trapping

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe...

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

סרטון זה מדגים טכניקת כימות עבורCO2 המשתחרר במהלך חמצון המצע באמצעות 14מצעים בעלי תווית רדיו C. 14CO2 ששוחרר לכוד בתמיסה בסיסית ומכומת על ידי מונה נצנצים. חמצון של מצעים שונים משתנה בין רקמות ומשקף את המצב הפתופיזיולוגי של הרקמה.

בדיקת חמצון המצע בתאים בתרבית: בדיקת מבחנה לכימות חמצון המצע בתאים על ידי מדידת אותות רדיואקטיביים מ- CO2 לכוד

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

פרוטוקול זה מתאר calorespirometry, מדידת סימולטני הישירים של פיזור חום וגם נשימה, אשר מספקת גישה לא פולשנית כדי להעריך את חילוף החומרים האנרגיה. טכניקה זו משמשת כדי להעריך את התרומה של מסלולים אירובית וגם אנאירובית כדי ניצול האנרגיה על-ידי ניטור את זרימת האנרגיה התאית הכוללת.

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.

Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

אנו מציגים פרוטוקול לחדירות סלקטיבית של ממברנת הפלזמה, המאפשר אספקה ממוקדת של סובסטרטים ומעכבים להערכת פוספורילציה חמצונית מיטוכונדריאלית (OXPHOS) בתאים מתורבתים, תוך התגברות על מחסומי העברת ממברנת הפלזמה שבדרך כלל מונעים ניתוח כזה. באמצעות טכניקה זו הראינו כיצד תפקוד OXPHOS מווסת על ידי אגוניסטים ואנטגוניסטים מוסקריניים.

מודולציה תלויה בליגנד כולינרגי של קישור זרחון חמצוני בתאי נוירובלסטומה BE(2)-C עם פרי דיגיטונין

למדו שיטה להערכת חמצון מצע אנרגיה בתאים באמצעות מעקב אחר פליטת CO2 מסומן. השיטה מותאמת לסוגי תאים שונים ומסייעת בחקר הפרעות מטבוליות וגמישות מטבולית.

הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם ^{לכידת CO 2 14}

גלה סרטונים נוספים