השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני
31 במאי 2022
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.
פרוטוקול זה מאפשר השתלה לא פולשנית של iPSMG במוח עכברים מדוכאי חיסון על ידי שילוב פרמקולוגי של הפעלה/כיבוי פרמקולוגית של אנטגוניסט לקולטן CSF1 PLX5622 עם השתלה טרנסנסאלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתיל iPSMG מבלי לגרום לנזק מוחי אפילו בעכברים חסרי יכולת חיסונית. השתלה מיקרוגליאלית עשויה לשמש כטיפול פוטנציאלי להחלפת מיקרוגליה לא מתפקדת עם אלה תפקודיים במחלות נוירודגנרטיביות שונות בעתיד.
מי שידגים את ההליך יהיה ביג'יי פרג'ולי, חוקר מהמעבדה שלי. התחילו בהפשרה מהירה של תאי המיקרוגליה האנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים קפואים באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה נמס.
הוסיפו את ה-iPSMG המופשר למדיה התרבותית, שחוממה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסיפו מיליליטר אחד של תאים ל-10 מיליליטרים של מדיית תרבית. צנטריפוגה של התאים במהירות של 300 פעמים g במשך חמש דקות כדי לקבל גלולת תא.
הסר את חומר העל מבלי להפריע לכדור התא. הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 10 לתאים החמישי לכל מיקרוליטר. מניחים את ה-iPSMG על הקרח, ומיד ממשיכים להשתלה.
כדי להכין עכברים להשתלת טרנסנסאל, האכילו את העכברים הזכרים בתזונה המכילה PLX במשך שבעה ימים. בסוף היום השביעי, להפסיק את דיאטת PLX ולהאכיל את העכברים עם דיאטה רגילה. שעה לפני ההשתלה הטרנסנזלית של iPSMG, תנו 2.5 מיקרוליטרים של היאלורונידאז ב-PBS לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להגביר את החדירות לרירית האף.
מניחים את העכברים במצב שכיבה לאחר מריחת ההיאלורונידאז. תן 2.5 מיקרוליטרים של היאלורונידאז עשר דקות לפני השתלת טרנסנסאל של iPSMG. יש למרוח 2.5 מיקרוליטרים של תרחיף תאים על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר.
מניחים את העכבר בתנוחת השכיבה במשך חמש דקות לפני מתן ההשעיה של התא לנחיריים האחרים. נהל את תרחיף התא ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 מיקרוליטרים לכל חיה. 48 שעות לאחר הפסקת ההזנה של PLX, חזרו על מתן היאלורונידאז ותרחיף התאים על אותם עכברים.
למתן ציטוקינים, יש למרוח 2.5 מיקרוליטרים של מדיום ההשתלה על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר. לאחר חודשיים של השתלה טרנסנסאלית, ניתן לקבוע את מספר התאים המושתלים על ידי ספירת תאים חיוביים הן לסמנים ספציפיים לבני אדם והן לסמנים פאן-מיקרוגליאליים. מיקרוגליה של עכברים אנדוגניים חיובית עבור סמן פאן-מיקרוגליאלי בלבד.
בעכברי בקרה זוהו רק מיקרוגליה של עכברים הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס. בקליפת המוח של עכברים מושתלים iPSMG זוהו רק מיקרוגליה של עכברים, ואילו בהיפוקמפוס iPSMG זוהו. כאשר מנסים את הפרוטוקול הזה, הסרה מלאה של סופרנאטנט חיונית כדי למנוע דילול של ציטוקינים.
חשוב מאוד למרוח ציטוקינים כל 12 שעות על הכדאיות של תאים מושתלים. דלדול של מיקרוגליה של עכבר אנדוגני נדרש להשתלת iPSMG. הליך זה מאפשר השתלה של iPSMG לתוך מוח עכבר רגיל או חולה.
לפיכך, ניתן לקבוע את המאפיין של iPSMG כמו גם את התגובה למחלה. טכניקה זו מתאימה כדי לקבוע את המאפיין in vivo של iPSMG במוח העכבר. לפיכך, השתלת iPSMG בעכברים במודל מחלה תסייע לנו להבין את התגובה ועשויה לסלול את הדרך למטרה טיפולית חדשה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לא פולשנית להשתלת מיקרוגליה אנושית המופקת מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSMG) אל מוחם של עכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה באמצעות נתיב טרנס-נזאלי. הפרוטוקול רותם מתן ציטוקינים ומחיקה של מיקרוגליה אנדוגנית כדי לאפשר שילוב יעיל של iPSMG, מה שעשוי לסלול את הדרך לגישות טיפוליות במחלות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מחקר תאי גזע
- ביולוגיה של מיקרוגליה
רקע
- ניתן להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים למיקרוגליה תפקודית.
- דיספונקציה של מיקרוגליה מעורבת במחלות ניוורו-דגנרטיביות שונות.
- מתן דרך האף (Transnasal delivery) מציג גישה חדשנית להשתלת תאים.
- מתן ציטוקינים הוא קריטי להישרדות התאים לאחר ההשתלה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להשתלת מיקרוגליה באופן לא פולשני.
- הערכת ההיתכנות של הובלה דרך האף (transnasal delivery) לשמירה על תפקוד מוחי תקין.
- הערכת הפוטנציאל של iPSMG להחלפת מיקרוגליה שאינה מתפקדת כראוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה העיקרית כוללת השתלה טרנסנזלית (דרך האף) של iPSMG בעכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה.
- עכברים זכרים טופלו מראש ב-PLX5622, אנטגוניסט לקולטן CSF1, ובתמיסת היאלורונידאז כדי להגביר את חדירות האף.
- תללי תאים הוכנסו במספר מנות לאורך לוחות זמנים מוגדרים כדי להבטיח אינטגרציה תקינה.
- ניטור לאחר ההשתלה כלל הערכה של נוכחותם וחיוניותם של התאים המשתלים.
תוצאים עיקריים
- תאי iPSMG מושתלים השתלבו בהצלחה בהיפוקמפוס של העכבר מבלי לגרום נזק למיקרוגליה אנדוגנית.
- מתן ציטוקינים בכל 12 שעות היה קריטי לשמירה על חיות התאים לאחר ההשתלה.
- שיטה זו מאפשרת לבחון את תגובות ה-iPSMG הן במודלים נורמליים והן במודלים של מחלה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מקל על חקר iPSMG in vivo, מה שעשוי להנחות טיפולים גנטיים עתידיים למחלות נוירודגנרטיביות.
- הבנת התנהגותן של מיקרוגליה מושתלה יכולה לסייע בהגדרת תפקידן בבריאות המוח.
- גישה זו עשויה לפתוח נתיבים למטרות טיפוליות חדשניות בטיפול בפתולוגיות הקשורות למיקרוגליה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתלה לא פולשנית של מיקרוגליה המופקת מתאי iPSC אנושיים לתוך מוחות של עכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה מאפשרת מחקר ישיר in vivo של תפקודי המיקרוגליה האנושית ותגובתה למחלות. גישה זו נותנת מענה לפערים תרגומיים בין מיקרוגליה של מכרסמים לזו של בני אדם, ובכך תומכת במודלים פרה-קליניים בעלי יכולת ניבוי גבוהה יותר למחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים. הפרוטוקול משפר את תיקוף המטרה (target validation) ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בנקודות השפל של שלבי הגילוי המוקדמים והשלבים הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה in vivo של הביולוגיה של מיקרוגליה אנושית בתוך סביבת מוח של יונקים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין תגובות מיקרוגליאליות ספציפיות לבני אדם לבין מודלים של עכברים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור מסלולים של נוירו-דלקת וניוון עצבי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוקפת להערכת שילוב ויחיוביות של מיקרוגליה אנושית in vivo.
- מאפשר כימות הדיר השכיל של מיקרוגליה מושתלת לעומת מיקרוגליה אנדוגנית באמצעות סמנים ספציפיים.
- תומך בסריקה של תרכובות המכוונות לתפקוד מיקרוגליה אנושית בהקשר פיזיולוגי.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מסנכרן מודלים פרה-קליניים עם הרלוונטיות למחלה בבני אדם על ידי שילוב מיקרוגליה אנושית במוחות של עכברים.
- מאפשר הערכה של התגובה של מיקרוגליה אנושית הן בעכברים תקינים והן בעכברים המהווים מודל למחלה.
- משפר את רמת הוודאות החזויית עבור גילוי ביומרקרים טרנסלציונליים ובדיקת השערות טיפוליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לביצוע מחקרים פונקציונליים של מיקרוגליה אנושית in vivo, ובכך הוא תומך בזיהוי מועמדים למולקולות מובילות ובהמשכיות תרגומית.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקידם של מיקרוגליות אנושיות בפיזיולוגיה ובפתולוגיה של המוח.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות של שילוב תאים וחיוניות לאחר השתלה.
- אנליטיקה: מאפשר הבחנה מבוססת-סמנים בין מיקרוגליות אנושיות למיקרוגליות של עכבר לצורך ניתוח נתונים מהימן.
- מחקר תרגומי: מקל על מידול רלוונטי למחלה על ידי השתלת iPSMG בעכברי מודל למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תפקוד מיקרוגליות אנושיות בהקשרים של מספר מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות תלוית-מין במחקר של דלקת עצבית (neuroinflammation).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימות עבודה להחדרה וכמותית של תאים באופן לא פולשני, לצורך הדירות (reproducibility) בין מחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך פיתוח (go/no-go) של טיפולים המכוונים למיקרוגליה, על ידי אספקת נתונים רלוונטיים לבני אדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון של תוכניות למחלות נוירודגנרטיביות באמצעות שיפור נאמנות המודל.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות iPSC, גמישת מיקרוגליה וטכניקות השתלה in vivo.
- נדרשת גישה לסוכנים פרמקולוגיים לצורך דילול מיקרוגליה אנדוגנית ותמיכה בציטוקינים.
- נדרשים פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת תאים, השתלה ואנליזה לאחר השתלה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרי ההחדרה והדילול.
- מתן רציף של ציטוקינים הוא קריטי להישרדות התאים המושתלים, כפי שמוצג בפרוטוקול.
