כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

דינמיקת הכרומטין העולמית הוכחה כמתווכת חשובה של מספר מצבי מחלה, כגון סרטן והזדקנות. הפרוטוקול שלנו מספק מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לחקר תהליך זה. ניתוח מעבדה סטנדרטי של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון או PTMS מוגבל בדרך כלל לבדיקת PTM יחיד בכל פעם באמצעות בדיקות מבוססות נוגדנים.

ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית של היסטון PTMS מאפשר לנו למדוד את השפע של מאות PTMS בניסוי יחיד. מי שידגימו את הנוהל יהיו סטפני סטרנסקי, רונלד קאטלר וג'ולי קים, פוסט-דוקטורנטית, סטודנטית לתואר שני וטכנולוגיית מחקר, בהתאמה, מהמעבדה. ראשית, באמצעות מדיית גדילה סטנדרטית, מגדלים את התאים כחד-שכבתיים עד שהם נפגשים ב-80%.

לאחר מכן לשטוף את התאים עם HBSS. הוסף חמישה מיליליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA מדולל ב- HBSS. דגירה של התאים במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.

השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את ניתוק התאים. לאחר ספירת התאים, דיללו את תרחיף התאים במדיית גדילה טרייה. הוסיפו 0.5 מיליליטרים של מדיית גדילה כדי לאזן לוח תחתון עגול בעל חיבור נמוך במיוחד של 24 בארות עם מיקרו-בארות מרובות בכל אחת מהן.

לאחר מכן צנטריפוגה את הלוחות ב 3000 x g כדי להסיר בועות אוויר מן פני השטח של הלוח. כעת העבירו את מתלי התאים שיוצרו בעבר ללוחית הצנטריפוגה בעלת 24 הבארות למשך שלוש דקות ב-120 x גרם. בדוק את התאים בצלחת 24 הבאר ולאחר מכן דגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות להיווצרות ספרואידים.

בינתיים, כדי לאזן את הביוריאקטור, הוסיפו 25 מיליליטרים של מים סטריליים לתא הלחות ותשעה מיליליטרים של מדיית גדילה לתא התא. הדגירה של הביוריאקטור בחממת קלינוסטאט מסתובבת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. נתקו את הספרואידים מהצלחת בעלת החיבור הנמוך במיוחד של 24 בארות על ידי צנרת עדינה באמצעות קצוות נשאים רחבים של מיליליטר אחד, והעבירו אותם לצלחת תרבית רקמה.

כדי לבחור צורות מספיקות של ספרואידים, בדקו את איכות הספרואידים מתחת למיקרוסקופ. לספרואידים באיכות טובה יש גודל אחיד, קומפקטיות ועגולות. מלאו את הביוריאקטור המשוקלל בחמישה מיליליטרים של מדיית גדילה טרייה, והעבירו לתוכה את הספרואידים.

לאחר מכן מלאו את הביוריאקטור לחלוטין במדיית גדילה רעננה והכניסו את הביוריאקטור לחממת הקלינוסטאט ב-10 עד 11 סל"ד. כל יומיים-שלושה, להחליף מדיה צמיחה על ידי החלפת 10 מיליליטר של מדיה ישנה במדיה טרייה. ככל שספרואידים אלה גדלים בגודלם ובמספרם, הגדילו את מהירות הסיבוב של האינקובטור.

לאחר קבלת הכדורית הספרואידית, הוסיפו חמישה נפחים של חומצה גופרתית טוחנת 0.2 קרה לכדור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את הכדור ולשחרר היסטונים. לאחר קבלת הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה, הוסף חומצה טריכלורואצטית מרוכזת קרה, כך שהריכוז הסופי הופך ל -25 עד 30% נפח לפי נפח. וערבבו אותו על ידי היפוך הצינור כמה פעמים וצנטריפוגה כפי שמתואר בכתב היד.

לאחר השלכת הסופרנאטנט, באמצעות פיפטת מרעה זכוכית, לשטוף את הכדור ואת דפנות הצינור עם כ -500 מיקרוליטרים של אצטון קר ו 0.1% חומצה הידרוכלורית, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 3, 400 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הפוך את הצינור כדי להשליך את ה- supernatant. באמצעות פיפטת מרעה זכוכית, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 100% אצטון קר כדי לשטוף את הכדור והצנטריפוגה כפי שהודגם בעבר.

לאחר השלכת הסופרנאטנט, הסר לחלוטין את האצטון על ידי צנרת בזהירות, ותן לדגימה להתייבש עם מכסה פתוח במשך כ -20 דקות. החייאת הכדור ב-20 מיקרוליטרים של 15 עד 20% של אצטוניטריל ב-100 מילימולר אמוניום ביקרבונט של pH 8. לאחר המערבולת, סובבו את המתלים ב-1000 x g למשך 30 שניות.

עבור שמונה דגימות או יותר, העבירו כל דגימה מושעה מחדש ללוחית של 96 בארות. לאחר מכן, במכסה המנוע, מוסיפים שני מיקרוליטרים של אנהידריד פרופיוני ומערבבים על ידי צנרת חמש פעמים. הוסיפו במהירות 10 מיקרוליטרים של אמוניום הידרוקסיד וערבבו על ידי צנרת חמש פעמים.

מערבבים שרף HLB על צלחת ערבוב מגנטית. לאחר מכן הוסיפו 70 מיקרוליטרים של מתלי ה-HLB לכל באר של צלחת מסנן בת 96 בארות על צלחת איסוף בת 96 בארות. לאחר השלכת הזרימה, לשטוף את השרף עם 100 microliters של 0.1% חומצה trifluoroacetic.

לאחר החייאה חוזרת של כל דגימה ב-100 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, טענו כל דגימה בכל באר ומנעו התזה באמצעות ואקום. לאחר השלכת הזרימה, שטפו את הדגימות עם 100 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, והניחו את צלחת הפילטר על צלחת איסוף חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של 60% אצטוניטריל ב-0.1% חומצה טריפלואורואצטית לכל באר ומנעו התזה באמצעות ואקום.

אספו את הזרימה וייבשו בריק מהיר. טען את צלחת האיסוף המיובשת לתוך ה- HPLC והפעל את שיטת LC/MS/MS כמתואר בכתב היד. במחקר זה, השפע היחסי של שינויים נפוצים בהיסטון לאחר התרגום נצפה בהפטוציטים C3A שגדלו כספרואידים תלת-ממדיים.

ניתן היה להבחין בשינויים שלאחר התרגום גם על שאריות בודדות בפפטידים הנוצרים מחלבוני היסטון. הטיפול בספרואידים עם נתרן בוטיראט הגדיל את השפע היחסי של אצטילציה היסטון, בעוד שעם נתרן סוקצינאט שיפר את שאריות ההיסטון. השיטה הדגימה גם את דפוס ההתפלגות של אצטילציה היסטון לאחר טיפול בנתרן בוטיראט ואת זו של תמצית ההיסטון לאחר הטיפול בנתרן סוקסינט.

התוצאה הראתה גם דפוסים משותפים של שינויי היסטון שונים. טיפולים בנתרן בוטיראט שיפרו באופן משמעותי את האצטילציה של שאריות ליזין 14 על פפטיד שנוצר מחלבון ההיסטון H3, רק כאשר שאריות הליזין התשיעיות שלו כללו שתי קבוצות מתיל, אך לא אחת או שלוש קבוצות מתיל. כמו כן חושבו השפע היחסי של שינויים בודדים ושילובים שונים של שינויים לאחר התרגום בפפטיד הנגזר מ-H3.

דפוסים קומבינטוריים של שינויים לאחר תרגום לאחר טיפול בנתרן בוטיראט נצפו גם בפפטיד שנוצר מחלבון היסטון H4. גם כאן, הטיפול בנתרן בוטיראט הביא לעלייה משמעותית באצטילציה. יש לשים לב ביקורתית על שמירת הספרואידים על הספסל כמה שפחות ובשלב התפלה כדי למנוע שפיכת דגימה. ניתן להשתמש בזרימת עבודה זו כדי לחקור כרומטין ברקמות מוצקות באמצעות מודל פיזיולוגי יותר מאשר שכפול מהיר של תרביות תאים שטוחות.