פרופיל כלל-גנומי של אינטראקציות קשירה בין גורמי שעתוק לדנ"א בקנדידה אלביקנס: שיטת CUT&RUN מקיפה וזרימת עבודה של ניתוח נתונים

פרוטוקול זה מפרט את כל ההליכים הניסוייים, החל מתיוג אפיטופים של גנים המקודדים גורמי שעתוק באמצעות ניתוח נתונים חישוביים, וכלה בביצוע פרופילים כלל-גנומיים של אינטראקציות קישור פקטור שעתוק-DNA בקנדידה אלביקנס באמצעות CUT&RUN. זוהי טכניקה נגישה יותר, מהירה יותר, רגישה יותר, יקרה פחות, והיא מספקת נתונים באיכות גבוהה יותר מגישות ChIP-chip ו-ChIP-seq מסורתיות. למרות שהפרוטוקול שלנו פותח עבור תאי קנדידה אלביקנס המבודדים מביופילמים או מתרביות פלנקטוניות, זה צריך להיות מעשי להתאים אותו כמעט לכל צורה טובה של תאי קנדידה אלביקנס.

לאחר דגירה של תרחיף התא, העבירו אליקווט בעל חמישה מיקרוליטרים לצינור PCR חדש. לחמישה מיקרוליטרים של גרעינים מבודדים ואליקווט של חמישה מיקרוליטרים של תאים שלמים שאוחסנו בעבר בארבע מעלות צלזיוס, הוסיפו מיקרוליטר אחד כל אחד של קלקופלואור-לבן ו-SYTO 13. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 דקות.

בדקו באופן חזותי את שלמותם וטוהרם של הגרעינים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חפשו גרעינים מבודדים המציגים צביעה בולטת של SYTO 13 וודאו שאין צביעה על דופן התא על-ידי הצבע הלבן-עגל. חזור על הבדיקה עם תאים שלמים כבקרה להכתמת דופן התא בצבע לבן-עגל.

הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי והמתינו עד שהסלרי יהיה ברור לחלוטין. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מאגר הנוגדנים ומערבבים בעדינות על ידי צנרת.

מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של הנוגדן הפוליקלונלי נגד GFP לצינורות ומדגדגים את הצינורות על מערבל אגוזים ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. צנטריפוגה קצרה של הצינורות ב-100 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש שניות והניחו את הצינורות על מדף מגנטי. ברגע שהסלורי ברור, השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה.

בזמן שהצינורות עם החרוזים עדיין נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ חדירה של תאים קרים כקרח ישירות על החרוזים. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. חזרו על שתי שטיפות עם מאגר חדירת התאים הקרים כקרח.

מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חיץ חדירה של תאים קרים כקרח לכל צינור ומערבבים בעדינות על ידי צנרת. הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של החלבון AG-MNase לכל דגימה וערבבו על ידי צנרת. מניחים את הדגימות על מיקסר אגוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומדגרים את הדגימות למשך שעה אחת.

צנטריפוגה קצרה בצינורות הרצועה ב-100 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש שניות, ואז הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי. ברגע שהסלורי ברור, השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה. בזמן שהצינורות עם החרוזים עדיין נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ חדירה של תאים קרים כקרח ישירות על החרוזים.

השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. חזרו על שתי שטיפות עם מאגר חדירת התאים הקרים כקרח. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר החדירה של התאים הקרים כקרח לדגימות ופיפט בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים.

מוציאים את יציקת הג'ל מקופסת הג'ל ופותחים את יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן. מוציאים בעדינות את הג'ל מיציקת הג'ל ומניחים אותו בתוך מגש מחזיק ג'ל המכיל 100 מיליליטר של TBE חד-חוזק. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של כתם הג'ל של חומצת הגרעין למגש ומסתחררים בעדינות.

יש לכסות בנייר כסף כדי להגן מפני אור ולדגום באופן סטטי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן יש לשטוף את הג'ל פעמיים עם 100 מיליליטר של מי ברז שעברו דה-יוניזציה. דמיינו את הג'ל תחת תאורת אור כחול באמצעות כיסוי מסנן ענבר.

עבור כל ספרייה, חתכו את הג'ל מעט מעל רצועת הדימר הבולטת של זוג הבסיסים בערך 125 הבסיסים ומתחת לסימן הסולם של 400 זוגות הבסיסים. נקבו את החלק התחתון של צינור 0.65 מיליליטר באמצעות מחט בעלת 22 מדים והניחו את הצינור המנוקב בתוך צינור מיקרופוג' סטרילי דו-מיליליטר סטרילי. מעבירים את פרוסת הג'ל לצינור המנוקב בתוך צינור המיקרופוג' הדו-מיליליטר.

צנטריפוגה צינור מיקרופוגה דו-מיליליטר המכיל את הצינור המנוקב 0.65-מיליליטר ודגימה בטמפרטורה של 10, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות כדי לאסוף את סלרי הג'ל בתוך צינור המיקרופוגה של שני מיליליטר. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון ג'ל קר כקרח לג'ל. יש לערבב על מאגוז בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות או למשך הלילה.

מעבירים את כל הנוזלים והג'לים לעמוד מסנן של 0.22 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-10, 000 גרם פעמים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הורד את קוד המקור לניתוח CUT&RUN מהדף GitHub על ידי לחיצה על כפתור הקוד הירוק, ואחריו אפשרות הורדת ZIP. פתח את התיקיה למיקום רלוונטי במחשב המקומי.

התקן את סביבת Conda והפעל רק פעם אחת. לאחר התקנת Conda, צור סביבה וירטואלית המסופקת עם הפקודה הרלוונטית. הפעל את הסביבה הווירטואלית בכל פעם שזרימת עבודה זו מופעלת.

עיכול דופן התא והשלמות הגרעינית הוערכו על ידי הדמיה הן של תאי בקרה שלמים והן של גרעינים מבודדים המוכתמים בדופן התא הפלואורסצנטי ובכתמי חומצות גרעין. בניגוד לגרעינים השלמים המבודדים שבהם לא נצפה צביעה על דופן התא, הן הגרעינים והן דפנות התא מסומנים באופן פלואורסצנטי בתאי הבקרה השלמים. האיור מראה ספריות CUT&RUN TF שנותחו באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימי.

ספריות TF מוצלחות של CUT&RUN מועשרות עבור שברים קצרים הקטנים מ-200 זוגות בסיסים. ספריות TF לא אופטימליות של CUT&RUN מראות העשרה עבור שברי דנ"א גדולים. האיור כאן מראה כי מוטיבים קושרי דנ"א Ndt80 מועשרים בכל הלוקוסים הקשורים ל-Ndt80 שזוהו על ידי CUT&RUN, מה שמצביע על כך שהפסגות הנוספות שזוהו על ידי מתודולוגיה זו הן ככל הנראה אתרים הקשורים ל-Ndt80.

ניתוח השוואתי הצביע על כך שפרוטוקול CUT&RUN זיהה את רוב אירועי הקישור הידועים בעבר עבור Ndt80 ו- Efg1 במהלך היווצרות ביופילם. באופן כללי, גם Ndt80 וגם Efg1 קשורים לחפיפה עם נתוני ChIP של משקעים חיסוניים של כרומטין שפורסמו בעבר ומזוהים רק באמצעות CUT&RUN. זה מאפשר לנו להגדיל באופן משמעותי את ההיקף והקצב של המחקר שלנו המתמקד ברשתות רגולטוריות שעתוק ובלקנדידה אלביקנים.