גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירה אקראית של ספריות RNA באורך מלא של גנומים נגיפיים מסוג RNA חיובי לגדיל יחיד באורך של עד 10 קילובייט, ובחירה של פנוטיפים בעלי עניין בתנאי ניסוי רצויים. טכניקה זו יכולה ליצור ספריות RNA נגיפי באורך מלא עם רמות משתנות של מגוון גנטי בזמן קצר באמצעות גישה ללא שיבוט. הטכניקה משתמשת בריאגנטים זולים וזמינים באופן נרחב לסינתזה של ספריות.

את ההליך תדגים שאהין חאן, דוקטורנטית מהמחלקה לווירולוגיה, המחלקה למדעי החיים, אוניברסיטת שיב נאדר. כדי להתחיל, בצע ep-PCR על ידי הכנת תערובת האב לארבע קבוצות של ניסויים עם פריימרים קדימה ואחורה יחד עם רכיבי התגובה ללא תבנית pJFH1, כמתואר בכתב היד של הטקסט. Aliquot תערובת המאסטר לתוך ארבעה צינורות.

הוסף 100 ננוגרם, 50 ננוגרם, 25 ננוגרם ו -10 ננוגרם של התבנית לתוך צינורות בודדים, ולהתאים את נפח התגובה הכולל ל 50 מיקרוליטר. החל את תנאי הרכיבה כדי להגביר שבר זוג 97 36 בסיסים. להעריך את מוצר ep-PCR מוגבר על ידי טעינת חמישה מיקרוליטר של מוצרי PCR ולהשוות אותו לכמויות ידועות של סולם DNA קילו אחד על ידי הפעלת אלקטרופורזה ג'ל אגרוז מבוסס 0.8% TAE.

לטהר את המוצר באמצעות ערכת טיהור עמודות. להעריך את ריכוז המוצר המטוהר על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר. רכז ואקום את המוצר ep-PCR כדי לקבל ריכוז מוצר שווה או גדול מ -100 ננוגרם למיקרוליטר.

הגדר תגובת סינתזת RNA במבחנה, ומקם אותה על 37 מעלות צלזיוס לדגירה. לאחר מכן לטהר את המוצר המסונתז באמצעות ערכת טיהור עמודות. הגדר תגובת סינתזת cDNA של 20 מיקרוליטר על ידי הוספת מיקרוגרם אחד של הרנ"א הנגיפי, חמישה פריימר הפוך מיקרומולרי ו- 200 יחידות של שעתוק הפוך, בהתאם להמלצות היצרן.

בעזרת cDNA, הכינו תערובת תגובה כמתואר בכתב היד של הטקסט, והפעילו מחזור הגברה. הפעל את המוצר על ג'ל אגרוז מבוסס 0.8% TAE כדי לאשר את גודל המוצר של 25 זוגות 71 בסיסים, ולאחר מכן לטהר את המוצר באמצעות ערכת טיהור עמודות כפי שהודגם קודם לכן. Elute ב 40 מיקרוליטר של מים סטריליים.

כדי להוסיף תליה של שלושה פריים A, הוסף 0.5 מיקרומולרי DATP ויחידה אחת של Taq DNA פולימראז באיכות נמוכה, ודגר על כל מוצר ה-PCR בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, יחד עם מאגר PCR אחד ומגנזיום כלורי 1.5 מילימולרי. לאחר מכן לטהר את התערובת באמצעות ערכת טיהור עמודות. הגדירו את תגובת הקשירה ודגרו עליה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של Escherichia coli DH5-Alpha לדנ"א הקשיר, והחמימו את התאים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 35 שניות. מוסיפים מיליליטר אחד של LB בינוני לתרחיף התא, ודגרים עם ניעור עדין במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 13, 800 RCF.

השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש ב-200 מיקרוליטר של מדיום LB טרי. צלחת 100 מיקרוליטר של תאי E.coli DH5-Alpha שעברו טרנספורמציה על צלחת LB המכילה 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. הגדירו מיני תכשירים של 25 עד 30 מושבות בחמישה מיליליטר של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, וגדלו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס.

למחרת, לחלץ את הפלסמידים עם ערכה מסחרית ולבצע עיכול אנזימי הגבלה בנפח 10 מיקרוליטר עם 200 ננוגרם של פלסמידים מבודדים, שתי יחידות של חיץ הגבלה EcoR1 ו 1X לכל המושבות. לאחר הדגירה על תערובות העיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, יש להעמיס את המוצרים על ג'ל אגרוז מבוסס 0.8% TAE כדי לאשר החדרת DNA פלסמיד. בצע ריצוף Sanger של פלסמידים של 25 שיבוטים חיוביים באמצעות פריימרים המומלצים.

יום אחד לפני הטרנספקציה, לפצל את התאים, ולספור את מספר התאים קיימא באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן זרעו את הפטומה האנושית 7.5 תאים בצלחות 35 מילימטר בשני מיליליטר של DMEM מלא, ודגרו על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להכין את קומפלקס שומנים תמליל על ידי דילול 10 מיקרוליטר של מגיב transfection ב 50 מיקרוליטר של המדיום חיוני מינימלי, בנפרד לדלל חמישה מיקרוגרם של תעתיקים ויראליים ב 50 מיקרוליטר של המדיום החיוני המינימלי.

דוגרים על שתי התערובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן מערבבים אותם בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי יחיד, ודגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר דגירה התא, להסיר את מדיום התרבית, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS שחומם מראש, ולהוסיף 1.5 מיליליטר של התווך החיוני המינימלי.

מוסיפים לאט את המורכב, ומערבלים בעדינות את המנה לפיזור אחיד. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 10 שעות. לאחר מכן הסר את המדיום.

שטפו את התאים הנגועים פעמיים עם מיליליטר אחד שחומם מראש 1X PBS, והוסיפו שני מיליליטר של DMEM מלא. בודדו RNA נגיפי מ-140 מיקרוליטר של סופרנאטנטים בתרבית באמצעות ערכת בידוד RNA נגיפי. הגדר תגובת qRT-PCR של 10 מיקרוליטר באמצעות ערכת qRT-PCR מסחרית.

השתמש בפריימרים קדימה ואחורה ובבדיקה לכימות RNA HCV. הגדר את מחזור התגובה ל- 48 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו- 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ו- 60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הפעל את התגובות והגדר בקרות שליליות.

במקביל, צור עקומה סטנדרטית באמצעות מספר העתק ידוע בדילול סדרתי פי עשרה של תעתיקי HCV כדי לכמת RNA נגיפי. בצע בשלשה. צלחת הפטומה אנושית 7.5 תאים בצלחת של 96 בארות, ודגרה על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני כ -16 שעות לפני הוספת הנגיף.

בארון בטיחות ביולוגית Class II, בצע דילולים סדרתיים פי עשרה של הנגיף. הוסיפו 100 מיקרוליטר של הנגיף המדולל לבאר כדי להדביק תאים, ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שלושה ימים, לשטוף את התאים הנגועים שלוש פעמים עם 0.1 מיליליטר של PBS, ולתקן ולחדור את התאים עם 0.1 מיליליטר של מתנול קר כקרח במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

לשטוף את הבארות עם 1X PBS שלוש פעמים, ולאחר מכן 1X עם PBST. לאחר הסרת PBST, לחסום את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם 0.1 מיליליטר של 1% BSA המכיל 0.2% חלב דל שומן PBST. הסר את הפתרון החוסם, וטפל בתאים במשך חמש דקות עם 0.1 מיליליטר של 3% מי חמצן מוכן 1X PBS.

שוב, שטפו את התאים פעמיים עם 1X PBS, ו-1X עם PBST. הוסיפו 50 מיקרוליטר נוגדן חד-שבטי נגד NS5A 9E10 לכל באר, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 1X PBS ופעם אחת עם PBST.

הוסף 50 מיקרוליטר של IgG משני נגד עכבר עז מצומדת HRP לכל באר, לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את הנוגדן הלא קשור על ידי שטיפת הבארות עם 0.1 מיליליטר של 1X PBS. מוסיפים 30 מיקרוליטר DAB, ודגרים על הצלחת בנדנוד עדין במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת DAB, ושטוף את הבארות פעמיים עם 1X PBS, ופעם אחת עם מים מזוקקים.

הוסף 100 מיקרוליטר של PBS המכיל 0.03% נתרן אזיד. בחנו כל באר תחת מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות מטרה פי 10. לספור את מספר הבארות החיוביות.

השתמש במחשבון Reed and Muench כדי להעריך את דילול נקודות הקצה שמדביק 50% מהבארות. להמיס pibrentasvir, מעכב NS5A, ב-100% DMSO לריכוז של מילימולר אחד ולדלל אותו עוד יותר ב-DMEM מלא לריכוז של 10 ננו-מולארי. לאחר מכן הדביקו תאי Huh-7.5 נאיביים במפגש של 70% עם מנת וירוס ML50 כדי להדביק 50% מהתאים למשך 12 שעות, ולאחר מכן העבירו את התאים הנגועים לצלחות שש בארות 24 שעות לאחר ההדבקה.

הוסף 1X EC50 PIB לתאים הנגועים לאחר 16 שעות של פיצול תאים. עשו זאת לאחר שכל תא התפצל במשך שישה מעברים רצופים, ולאחר מכן שלושה מחזורי מעבר ללא תרופות, ועקבו אחר התפשטות הנגיף באמצעות בדיקה יוצרת מיקוד. קצרו סופרנאטנטים נגיפיים בכל מעבר, ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

לחלץ RNA נגיפי מן supernatant ביום 18 ואת cDNA מסונתז. להגביר את הגן NS5A באמצעות חמישה מיקרוליטרים של cDNA מדולל. לאחר מכן לקבוע מוטציות עמידות לתרופות NS5A בשישה עד שמונה פלסמידים חיידקיים חיוביים באמצעות פריימרים לריצוף NS5A.

ספריות מוטנטיות מלאות של גנום סונתזו באמצעות pJFH1 משובט בכמויות הולכות ופוחתות מ-100 ל-10 ננוגרם. התשואות הממוצעות של מוצרי ep-PCR נעו בין 3.8 ל-12.5 ננוגרם למיקרוליטר. שיעור המוטציות בספריות מוטנטיות גדל עם ירידה בקלט של pJFH1 בתגובת ep-PCR.

ML50 שסונתז באמצעות 50 ננוגרם של התבנית כלל ארבעה החלפות לכל 10, 000 זוגות בסיסים שהועתקו, ואילו ML25 שסונתז באמצעות 25 ננוגרם של תבנית הכיל תשעה החלפות. לא נמצאו תחליפים בתוך מספר הנוקלאוטידים שרוצפו ב-pJFH1 השבטי. וריאנטים נגיפיים של ML50 היו פחות רגישים לפיברנטסוויר בהשוואה לנגיף השבט JFH1.

מתוך שמונת השיבוטים של NS5A, לארבעה היה שילוב של D7V + F28C, בעוד V8A + F28C ו- F36L התרחשו בשיבוט אחד כל אחד. מוטציות אלה היו באזור N terminus של NS5A, אשר ידוע כמכיל מוטציות עמידות רלוונטיות מבחינה קלינית של NS5A. הריכוז הסופי של כל רכיב של ep-PCR הוא קריטי, במיוחד כמות התבנית.

חוסר מאריך KB יפחית מאוד את התשואה של מוצר ep-PCR.