חקירת ההשפעות המקלות של מתן Bacillus cereus על קוליטיס באמצעות אפנון מיקרוביוטה של המעיים

פרוטוקול זה מאפשר להעריך את ההשפעה הדו-כיוונית של תוספי פרוביוטיקה על הבריאות ועל תוצאות יציבות וניתנות לשחזור. מודל קוליטיס חלופי המושרה על ידי DSS הוקם באמצעות עכברים נטולי חיידקים מדומים על מנת להימנע ממגבלות מעבדה מסוימות בשימוש בעכברים נטולי חיידקים כקולטנים לפרוביוטיקה. כדי לחקור את ההשפעות המועילות של פרוביוטיקה בטכניקה זו, זוהי גישה מבטיחה לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות להקלה על התסמינים של הפרעות דלקתיות כרוניות.

כדי להתחיל, הכינו קוקטייל של אנטיביוטיקה על ידי המסת אמפיצילין, ניאומיצין סולפט, מטרונידזול וונקומיצין במי השתייה. לאחר פירוק מוחלט, יש לאחסן את התמיסות בארבע מעלות צלזיוס. הכניסו את תמיסות הקוקטייל האנטיביוטי לבקבוק מים.

הקפידו להשתמש בבקבוקים חומים או לעטוף את הבקבוקים בנייר אלומיניום כדי להגן על תמיסות האנטיביוטיקה מפני אור. הנח את הבקבוק על גבי כלוב העכבר. להכנת תמיסת נתרן של 2.5% דקסטרן סולפט ממיסים 2.5 גרם DSS ב-100 מיליליטר מים מזוקקים.

החלף את מי השתייה בתמיסת DSS של 2.5% בקבוצת העכברים מדגם קוליטיס. כדי להעריך את ההשפעה החיובית של B cereus על הקלה על קוליטיס, הקצו את העכברים באופן אקראי לשלוש הקבוצות הבאות: קבוצת הביקורת, מודל הקוליטיס המושרה על ידי DSS ותוסף B cereus פרוביוטי לעכברים המושרים על ידי DSS. כדי לחקור את תפקידה של מיקרוביוטת המעיים בוויסות ההשפעות הפרוביוטיות של B cereus על קוליטיס הנגרמת על ידי DSS, הקצו את העכברים באופן אקראי לשלוש הקבוצות הבאות, ABX/ביקורת, ABX/DSS ו-ABX/B cereus בתוספת DSS.

רשום את משקל גופם של העכברים כמשקל הבסיס לאחר מתן קוקטייל האנטיביוטיקה. טפל מיד בשישה עכברים זכרים C 57 BL עם תמיסת 2.5% DSS במי שתייה למשך שבעה ימים. הכן שמונה צינורות מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר מלאים ב-900 מיקרוליטר של מי מלח רגילים סטריליים.

פיפטה 100 מיקרוליטר של גידול לוגריתמי B cereus ומתמוססת ב-900 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים רגילים. יש לדלל באופן סדרתי את B cereus באמצעות צינורות. צלחת 40 מיקרוליטר מכל דילול על צלחת אגר LB המתאימה המסומנת ביחס הדילול.

חזור על הפעולה שלוש פעמים עבור כל יחס דילול. תרבית את הצלחות בחממה בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. בחר את הצלחות עם כ -20 עד 70 מושבות לספירה.

לאחר הכימות של B cereus, אסוף מיליליטר אחד של מדיום B cereus המכיל אחד כפול 10 ל-CFU התשיעי וצנטריפוגה ב-8,000 גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את תאי החיידקים פעמיים במים סטריליים על ידי צנטריפיקציה בחום של 8, 000 גרם למשך 10 דקות והסירו את הסופרנטנט. יש לדלל את ה-B cereus המרוכז בתמיסת מלח סטרילית רגילה לריכוז סופי של פי שניים מ-10 עד ה-CFU השמיני לכל 200 מיקרוליטר.

פיפטה את הדילול למעלה ולמטה שוב ושוב כדי להשיג תרחיף B cereus מפוזר. נגב את החלק החיצוני של מחט הגאווג' עם אתנול 70% ושמור על יישום מינון מתאים. כדי לרסן את העכברים, הרימו אותם בזנבם ותפסו את העור הרפוי של הגב בחוזקה כשקצה הזנב קבוע בין שתי האצבעות האחרונות של המטפל.

שמור את העכברים במצב אנכי. לאחר מכן הכנס את מחט הגאווג' בזהירות ובעדינות דרך הפה לוושט. יש לתת את תמיסת B cereus, למשוך את המחט בעדינות ולהחזיר את העכבר לכלוב שלו.

מדוד את משקל גופם של העכברים מדי יום ואסוף את דגימות הצואה מיד בצינור צנטריפוגה מעוקר. קבע את הדם הסמוי בצואה על ידי נייר בדיקת דם סמוי בצואה. יש לאסוף 10 מיליגרם של דגימת צואה על מקל אפליקטור.

הניחו את הדגימה על כרטיס הבדיקה ומרחו מריחה דקה על הכרטיס. פתח את הדש האחורי והחל את המפתח על המריחה. תקן את העכברים שוכב על שולחן הניתוחים ופתח את חלל הצפק.

הפרד את כל המעי הגס בניתוח ומדוד את האורך בעזרת סרגל. לאחר מכן שטפו בעדינות את המעי הגס עם מזרק של חמישה מיליליטר מלא ב-PBS מקורר מראש. הסר שעווה והעניק לחות לחלקי המעי הגס.

לאחר מכן, יש להכתים את חלקי המעי הגס בהמטוקסילין ואאוזין. תנו לשני נסיינים עצמאיים להעריך את הציונים ההיסטולוגיים של הדגימה תחת מיקרוסקופ אור, צביעת המטוקסילין ואאוזין גילתה כי רקמת המעי הגס של עכברי מודל קוליטיס הציגה אובדן קריפטה, נזק לתאי גביע, חדירת תאים דלקתיים ואובדן אפיתל. טיפול ב-B cereus שיפר את הנזק ההיסטופתולוגי שנגרם על ידי DSS.

הציונים ההיסטופתולוגיים של עכברי קוליטיס היו גבוהים משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת. עם זאת, הציונים ההיסטופתולוגיים בקבוצת B cereus היו נמוכים משמעותית מאשר בעכברי קוליטיס. עכברים חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות, הירידה במשקל הגוף, ציוני ה-DAI וציוני ההיסטופתולוגיה היו גבוהים יותר ואורך המעי הגס היה קצר יותר בקבוצת ABX/DSS בהשוואה לעכברים בקבוצת ABX/ביקורת.

הירידה במשקל הגוף, אורך המעי הגס, ציוני DAI וציוני ההיסטופתולוגיה לא היו שונים סטטיסטית בין קבוצות ABX/DSS ו-ABX/B cereus בתוספת DSS. התוצאות הנוכחיות מצביעות בעקיפין על כך שלמיקרוביוטת המעיים יש תפקיד מפתח בהשפעות החיוביות של B cereus על קוליטיס. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא להשתמש ב-Bacillus cereus בשיטת gavage כדי לבנות את מודל הקוליטיס בעכברים.

הטיפול ב-Bacillus cereus חיסל את הקוליטיס הנגרמת על ידי DSS, מה שהוביל בסיס למחקר מעקב של פרוביוטיקה לטיפול בקוליטיס.