ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

היי, שמי מאט לואי. אני פוסט-דוקטורנטית במעבדה של לסלי סאל באוניברסיטת רוקפלר. והיום אני רוצה לספר לכם על הניסויים שעשינו כדי לחקור כימוטקסיס של זחלים.

הבעיה שמעניינת אותנו, היא די פשוטה. זה למעשה מיוצג כאן במערך הזה. זה עתה העברתי קבוצה של זחלי ג'וזף על פני השטח הזה של אגרוס.

הסביבה הזו עוינת למדי והם קרובים לגווע ברעב. איכשהו בעלי החיים האלה יצטרכו למצוא את דרכם למקור המזון הקרוב ביותר והנה קצת ריח פולט בננה שימשוך את הזחלים. סביבה זו אינה אידיאלית לחקר התנהגות כימוטקסיס, ולכן השיפור הראשון יהיה החלפת הבננה בכימיקל.

כימיקל זה הוא איזו אצטט והוא אחד הטעמים השולט בבננה. אז זה הטעם המלאכותי שלנו ועל ידי שימוש בו יש לנו שליטה הרבה יותר טובה על גירוי הריח. השיפור הבא הוא להשתמש בסביבה סגורה ולנסות למנוע בצורה כזו את התנודות בהתפלגות האחרת.

אז הנה הבדיקה שאנו משתמשים בה במעבדה די הרבה זמן. זוהי צלחת פטרי עם משטח של אגרו בתחתית. אגרו אידיאלי לזחלים להתקפות כימותרפיה מכיוון שהוא שומר עליהם לחות.

בשני צידי הצלחת, אתה מוצא כובע אחר שעשוי טפלון ומה שאנחנו הולכים לעשות עכשיו זה להכניס או איסאם אצטט בצד אחד ואין סדר בצד השני. לאחר שזה נעשה, הרעיון הוא לסגור את צלחת הפטרו, לחכות מעט זמן עד שהריח יתפזר, ולאחר מכן לפתוח את הצלחת. הכניסו כאן חיה, ואנו נותנים לחיה לנוע לפרק זמן מסוים.

בדיקה זו מסתמכת על ההנחה שעל ידי הכנסת תיאודור בצד אחד של המנה, יש לנו שיפוע שמתבסס די מהר ויישאר יציב לתקופת הבדיקה. עכשיו הבעיה העיקרית היא שאף אחד מעולם לא הוכיח שהשיפוע קיים בצלחת. יכול מאוד להיות שמהר מאוד לאחר הוספת תיאודור, יש לך פיזור הומוגני של תיאודור בלוח בצורה כזו שהשיפוע יהיה רדוד מאוד או שיכול להיות שנדרשות מספר דקות כדי לקבוע את השיפוע.

זה כמובן יהיה תלוי בעיקר בלחץ האדים של הריח שבו משתמשים. הנושא השני קשור למה שמכומת במהלך הניסוי. תארו לעצמכם שבעל חיים מתחיל מכאן, ה-X ואחרי שלוש דקות נמצא בלוח הקצה הזה, ה-X האדום.

דבר אחד שאתה יכול לעשות הוא לתעד את המיקום הסופי של החיה רק לאחר פרק זמן מסוים, שלוש או חמש דקות. אז המידע היחיד שתלכוד הוא מיקום ההתחלה, ואנו מאמינים שחשוב לקבל החלטה טובה לגבי התנהגות החיה לאורך זמן. לדוגמה, בעל חיים בקושי יכול היה לזוז ממצב ההתחלה למצב הסיום כמו כאן, או שהוא יכול היה לבקר באזור המקיף את תיאודור במשך חלק ניכר מהזמן ולהחזיר אותו לפני סוף הניסוי.

המסקנה שהיינו מסיקים משני המצבים הללו שונה מאוד. במקרה אחד, ייתכן שהחיה לא הגיבה לגירוי ואילו במקרה השני היא בהחלט הגיבה. שני השיפורים שאנו מנסים להשיג הם ראשית, לשלוט בצורה וביציבות של השיפוע השני בזירה.

שנית, עקבו אחר התנהגות החיה בזמן אמת ושמרו את כל המידע הזה. ברצף הבא, סילביה תציג בפניכם כיצד אנו מכינים דילול הזמנות. שמי S ti.

אני עוזרת מחקר במעבדת VAs שעובדת עבור חומר לואי. היום אני הולך להראות לכם כיצד להכין את החומרים למערכת התאים שבה אנו משתמשים כדי לעקוב אחר בעלי חיים. הבעיה העיקרית במערכת התאים שלנו היא שאנו משתמשים בריח באוויר המפוזר

המשמעות היא שלדוגמה, אם לוחות האגרוס שבהם אנו משתמשים אינם שטוחים, אתה עלול לקבל תנודות וריכוז בין הניסויים, מה שיכניס רעש למערכת. אז אני אראה לכם ואתן לכם טיפים קטנים כדי לנסות להפחית את הרעש במערכת. אז החומרים להכנת דילול הריח שלך הם צנצנת זכוכית, רצוי זכוכית כהה למקרה שאתה משתמש בריחות ריאקטיביים קלים עם ציון הריח שאתה מעוניין בו.

פיפטות זכוכית להכנת אליקוט זה ועזר פיפטה מכני הולם. ואז קצות פיפטת שמן פרפין, איש הפיפט הסטנדרטי שלך ובקבוקונים קטנים לדילול. שוב, אלה צריכים להיות זכוכית ורצוי כהים ואז משקל שקילה כדי לבצע מדידות מדויקות ולהפחית רעש בין ניסויים.

מכיוון שהריחות נדיפים מאוד וחלקם רעילים, הם נעשים בתוך מכסה מנוע. הצעד הראשון לתיקון דילול ריח הוא לנטרל את הריח שאתה הולך לדלל. כדי להכין דילולים מדויקים ולמזער את השונות בין הניסויים, יש צורך לשקול הכל.

אז התחל בתיוג, הולך ליצור ריכוז מולארי אחד של אתיל בוטיראט. ראשית, מכינים את שמן הפרפין. שמן פרפין הוא צמיג מאוד, לכן חשוב לנסות לטבול את קצה הפיפטה כמה שפחות בשמן הפרפין, מספיק כדי להיות מסוגל לשאוב את שמן הפרפין מבלי ליצור בועות.

אז טוב לנגב את שמן הפארן הנוסף בצד הבקבוק. שוב, מכיוון ששמן פארן הוא צמיג, חשוב מאוד להוציא אותו לאט לתוך הבקבוקון. לאחר שהזרמת את שמן הפרה לתוך הבקבוק שלך, אל תזרוק את הקצה מיד מכיוון שיותר יתאסף בתחתית הקצה.

זה טוב להכין דף חישובים לפני שאתה מתחיל לדלל היכן שכבר מדדת את נפח שמן הפארן שאתה הולך להוסיף וגם את המשקל, ואז לעשות את אותו הדבר גם עבור הריח שלך עם המשקל. כך תוכלו לבדוק את המשקל שיש לכם, את כל שמן הפרפין שאתם צריכים ואת כל הריח גם כן. במידת הצורך, אתה שופך פנימה עוד שמן פארן ומודד מחדש עד שיש לך את המשקל הנכון.

ברגע שיש לך את משקל שמן הפארן הנכון, כל מה שאתה צריך לעשות הוא להוסיף ריח תוך שימוש באותם עקרונות. בסדר. כאן אני הולך להראות כיצד להכין זחלים למעקב.

בדרך כלל אנו משתמשים בזחלים בני שישה ימים. אנחנו עושים את זה כי הם גדולים מספיק כדי שהתוכנה שלנו תצליח לקלוט אותם בקלות והם גם עדיין פעילים מאוד כדי לדעת אם הזחלים שלך זקנים מדי לשימוש במעקב, אתה רק צריך לבדוק אם יש זחלים שמטפסים על הקירות. אם יש זחלים שמטפסים במעלה הקיר, אז הם זקנים מדי והם לא יהיו פעילים במיוחד.

הצעד הראשון בהכנת הזחלים שלך הוא לטבול אותם ב-15% סוכרוז. הסיבה שאנו משתמשים בסוכרוז 15% היא שהזחלים יהיו בויד בתמיסה זו והמזון במקום זאת יתמוסס חלקית בה או ייפול למטה לתחתית. אתה מוזג מספיק סוכרוז כך שהוא בערך, אני יודע קצת פחות מסנטימטר מהחלק העליון של הבקבוק או הבקבוקון שלך.

ואז אתה לוקח מרית. אתה כבר יכול לראות את הזחלים צפים למעלה ואתה חופר בעדינות לתוך המזון כדי לעקור את כל החיות שחופרות במזון, מסובב אותו מעט כדי להפריד אותם מהמזון ואז פשוט מושיב אותו לכמה דקות. לאחר שהמזון והזחלים נפרדו כראוי, קחו צלחת פטרי מסומנת מראש ושפכו אותם לחלק הביפר.

שמור את החלק העליון של צלחת הפטרי מכיוון שתמלא אותה במים והשתמש בה ככלי קיבול לזחלים שעקבת אחריהם כך שתוכל להפריד בין אילו מהם עקבת ואילו לא. כעת, לאחר ששפכתם את הזחלים לצלחת הפטרי, עליכם להמתין 30 דקות עד שהם יסתגלו לסוכרוז ויגיעו למצב של רעב. המשמעות היא שהם יתנהגו טוב יותר במערך המעקב במהלך 30 הדקות שהזחל מסתגל אליהן.

הסוכרוז הוא רגע טוב להכין את הצלחות למעקב. אז אלה צמרות של 96 צלחות באר. אתה יכול לקנות אותם בנפרד וזה פתרון של 3%aros שכבר התחמם.

אנו משתמשים ב-3% מכיוון שהוא מונע מהזחלים לחפור, אך הוא גם צפוף מספיק כדי שיוכלו ללכת עליו ולהישאר לחים על כל צלחת. אתה רוצה לזרוק 25 מיל של אגרוס. חשוב לנסות להימנע מהיווצרות בועות גדולות בג'ל.

חשוב גם להניח את הצלחות על משטח ישר, אחרת אתה עלול לעורר ג'לים שנמצאים במדרון ועלולים להשפיע על התנהגות הזחלים. לאחר שהארוס התייצב, אנו עורמים את החלקים ועוטפים אותם בניילון סורן כדי למנוע מהם להתייבש. זה אמור לשמור אותם במצב טוב למעקב במשך מספר ימים.

ברצף זה, אציג בפניכם את המבחן ההתנהגותי שלנו, השונה במקצת ממבחן צלחת הבנזין, עליו סיפרתי לכם קודם. מה שתצטרך הם מובילים של 96 צלחות באר כמו גם כאלה המכילים את שכבת האגרו. הבדיקות מורכבות משלושה מכסים, שנערמים.

השפה הראשונה מכילה דבר, אינה ריקה ומשמשת רק לבידוד המערכת מהמשטח עליו היא שוכבת. השכבה השנייה מכילה משטח אגרו של דייגו. כאן החיות יונחו על פני השטח ועכשיו, כפי שאראה לכם בהמשך, נכניס את תיאודור הצלחת.

חשוב להשתמש במכסה רענן וחדש בכל פעם שאתה טוען את הריח. זאת כדי למנוע כל זיהום מניסוי אחד למשנהו. תזדקק גם לדילול אחר.

בדרך כלל איננו משתמשים בצבע כדי להעמיס ריח, אך כאן אשתמש בו לצורך המחשה. זהו ריכוז גבוה של תיאודור. בעוד שזה מדולל מאוד, המטרה שלי תהיה ליצור שיפוע לאורך קו.

אמרו את השורה הזו ואנחנו רוצים שהריכוז יגדל משמאל לימין. כדי להשיג זאת, אשתמש במספר טיפות סדר המונחות בטבעת העיבוי בריכוז הולך וגובר. אני מתחיל עם הריכוז הגבוה ביותר, שיוצב בקצה.

חשוב לפזר אותו בטבעת. עכשיו אני ממשיך עם הריכוז הבא, שמדולל פעמיים בהשוואה לראשון, ומניח אותו על הטבעת הזו. אז הנה לא, יש לי שש טיפות.

הראשון מכיל ריכוז של נניח אחד. השני ריכוז של 0.5, פי שניים פחות מהראשון. השלישי הוא ריכוז, 0.25, וכן הלאה.

אז יש לנו סדרה גיאומטרית לאורך הקו. השלב הבא מורכב מהיפוך מכסה זה על משטח ה-AAL וכעת על ידי מתח פנים, כל הטיפות נשארות תלויות מהחלק העליון של המכסה. אנו מתכננים טכניקה המבוססת על ספקטרוסקופיה אינפרא אדום כדי למדוד את כל הריכוז בצלחת.

על ידי יישום טכניקה זו, הצלחנו להראות שאם יש לך סדרה גיאומטרית לאורך קו דאודורנט כאן, אתה בסופו של דבר מקבל ריכוז של תיאודור לאורך שגדל באופן אקספוננציאלי כפי שמוצג כאן ולאורך רוחב הצלחת. יש לנו פרופיל שהגיע לשיאו ממש מתחת לקו הריח. כך נראית הגיאומטריה בפועל של השיפוע.

אם לוקחים בחשבון את ריכוז התיאודור באוויר, הדבר הטוב הוא שהצלחנו להראות שהשיפוע הגיאומטריה שלו יציבה למשך 15 דקות לפחות. עם הכנסת המכסה העליון, אנו ממתינים 30 שניות כדי לאפשר את הקמת השיפוע. לאחר מכן אנו מציגים את החיה בזירה.

החיה מוכנסת מתחת לקו הקצה השני בין עמדה 3 ל-4, אנו משתמשים בסיכה קטנה כדי להעביר את הזחלים מתמיסת הסוכרוז למשטח החקלאי. ההעברה מתבצעת על ידי דיג זחל סביב ראש הציפורן. אנו פותחים במהירות את המכסה, הזחל מופקד על פני השטח של אגרו.

ואז אנו סוגרים את המכסה. חשוב למזער את הזמן שהמכסה נשאר פתוח. לאחר מכן, אתה מקליט את תנועת החיה במשך שלוש או חמש דקות.

ההקלטה עצמה מתבצעת. עם הגדרת מעקב זו, יש לנו מצלמה המחוברת למחשב. תוכנת מעקב התמונות בה אנו משתמשים היא Aton vision מבית Nordis כדי לאסוף את המידע על תנועת החיה ולאחסן אותו כקובץ דיגיטלי.

עכשיו אנחנו עומדים להתחיל את הניסוי ההתנהגותי. יש לנו את המכסה עם שכבת הארו. יש לנו את הדילול.

דייגו תקוע על המכסה הראשון. לפני העמסת הריח, חשוב למערבולת כל בקבוקון. אנו משתמשים בדילול שלנו עם הקטן ביותר משמאל והגבוה ביותר כאן מימין.

כל שש הטיפות יוטענו על הצלחת בו זמנית. כדי למנוע אובדן ריח, אנו משתמשים כאן ב-Pipeter רב ערוצי שש טבל, 10 מיקרוליטר של הריח נלקח מכל דגימת דילול, והריח נטען בו זמנית. עם הטעינה, המכסה מתהפך כעת על פני האגרוס.

השיפוע נוצר בצלחת במהלך 30 השניות האחרונות כפי שהראיתי לכם קודם. עכשיו אני הולך להציג חיה על פני השטח של דייגו. ברגע שהחיה הוצגה, אני מתחיל בהקלטה.

החיה כאן וכעת עוקבים אחר תנועתה. כפי שאתם יכולים לראות, החיה עוקבת אחר קו הריח ומתקדמת לעבר נקודת הריכוז הגבוהה ביותר של השיפוע. זכור שהריכוז עולה משמאל לימין עם צורה מעריכית.

כפי שאתה יכול לראות, כיוון התנועה מתוקן כל הזמן. ביחס לגירוי, החיה הגיעה כעת לנקודת הריכוז הגבוהה ביותר של השיפוע, ואנו מוציאים אותה מהצלחת. החיה מושלכת על צלחת אחרת כדי לוודא שאנחנו לא עוקבים אחר אותו אדם פעמיים ישירות.

לאחר שאנו מציגים זחל חדש ומתחילים הקלטה חדשה, הנה הכללים שאנו פועלים לפיהם למעקב. אנו מפסיקים את המעקב ברגע שהחיה הגיעה לשורת הריכוז הגבוהה ביותר של הצלחת, המתאימה לזה, זו כאן. כמו כן, אם חיה פוגעת בקיר, המעקב נקטע מאחר שאנו רוצים להימנע מכל הפרעה.

השאלה הראשונה שהתייחסנו אליה הייתה די אפשרית. מה שרצינו לדעת היה אם בעל חיים יכול להריח תיאוריח בריכוז מסוים או לא. כדי לבצע בדיקה כזו, מה שאנחנו עושים בדרך כלל הוא שיהיה לנו מקור ריח יחיד במקום כמה.

זה מאפשר לך לקבל דרגת חופש אחת בשינוי הריכוז בטיפות קצה הריח. אז כאן, למשל, יש לך טיפה בריכוז גבוה, וכאן יש לך טיפה בריכוז נמוך. מה שאנו עושים בדרך כלל הוא להציג את החיה על פני השטח של דייגו ממש מתחת לטיפה של תיאודור ולראות אם החיה מסוגלת לזהות את נוכחותה ולהישאר בסביבתה.

עכשיו אני רוצה לעשות שימוש מתקדם יותר בבדיקה שלנו. דמיינו שיש לכם טיפת סדר אחת ואתם רושמים כמה מסלולים שנכפו כאן, ויש לכם שלושה מהם. יש לך אדם אחד שמייצר את המסלול הירוק הזה.

יש לך את המסלול הכתום הזה שהוא פחות ממורכז, ואז יש לך את המסלול הוורוד הזה שמייצג חיה שככל הנראה מסתובבת סביב המקור. אנו מאמינים שיש הרבה מידע להתחיל על הפרטים על המסלולים. מסיבה זו, אנו מייבאים את המסלול כסדרה של החזקה ל-matlab, ואנו מבצעים את הניתוח לאחר הניתוח עם matlab.

הנה המרחק למקור כנראה כפונקציה של הזמן. עבור שלושת המסלולים שהוצגו קודם לכן, יש לך את המסלול הירוק, שנשאר קרוב מאוד מהמקור. יש לך את המסלול הכתום, שמציג הרבה יותר רעש.

ואז יש לך את המסלול הסגול הזה, שהראה באופן מעניין שהחיה עזבה את המקור כדי להישאר במרחק, מה שכנראה תאם לריכוז שהיה אופטימלי. כאן אתם רואים את האיור של 10 מסלולים, בעלי חיים שאינם מסוגלים להריח. אלה מוטאנטים או שלושה מוטאנטים B, שאינם אלרים.

וכפי שאתם יכולים לראות, כל המסלולים הללו ממחישים שבעלי חיים לא הצליחו לזהות את מקור הריח ופשוט עזבו אותו. עכשיו בניגוד כוכבים, רשמנו כאן 10 מסלולים רצופים של חיות ברז לבנות. בעלי החיים האלה כמובן מסוגלים להריח, וכפי שאתם יכולים לראות, כולם מצטברים ממש מתחת למקור דאודורנט.

20 המסלולים, שהוצגו זה עתה, נרכשו למעשה מבלי לדעת את זהותם של בעלי החיים. זה מדגים את היעילות והאמינות של הבדיקה שלנו. כדי לקבוע אם חלק מהמוטאנטים מסוגלים להריח כאן באמצעות שיפוע אקספוננציאלי, אנו מייצרים מספר מסלולים ואנו רוצים לקבל תחושה עד כמה החיות מסוגלות לעקוב אחר גירוי הקצה השני.

אז אני הולך להראות לכם עכשיו 15 מסלולים שתועדו בנפרד, וכפי שאתם יכולים לראות, החיות עושות עבודה מצוינת במעקב אחר הגירוי מתחת לקו הקצה השני. כעת ברצוננו להמשיך עם פקד פשוט. יכול מאוד להיות שהחיות בשיפוע האקספוננציאלי עקבו אחר הקו מכיוון שהיה גירוי כלשהו ללא קשר לריכוז שלו, רק החיות הלכו ישר.

אז כדי להראות שהם אכן מחשבים את הריכוז או משהו שקשור לריכוז ועושים בו שימוש כדי לכוון את התנועה שלהם, יש לנו עכשיו את הגיאומטריה הזו, שקרובה לגג. הזחל מובא כאן כרגיל, ומה שאנחנו מצפים הוא שהם ינועו לאורך הקו ואז יזהו שהריכוז יורד אחרי הנקודה הזו ויחזרו אליו. אז ביצענו את הניסוי עם חמש חיות.

אספנו את המסלולים, וכעת אנו מייצגים אותם על גבי שקופית זו. וכפי שאתם יכולים לראות, בעלי החיים התחילו מכאן, נעו לאורך הקו, ואז חקרו את האזור המתאים לריכוז הגבוה ביותר ובעיקר נשארים שם. זה מצביע על כך שהם מסוגלים לחשב ריכוז אחר בזמן אמת באמצעות בדיקת המקור היחיד.

הצלחנו לשאול בעיקר שאלה אחת גדולה. האם ריח של בעל חיים יכול לזהות ריח בריכוז מסוים באמצעות מכשיר מרובה מקורות? יש לנו גמישות רבה יותר בשינוי צורת השיפוע ולקבוע אם בעל חיים מסוגל להשתמש במידע הזה או לא.

אני רוצה להמחיש את הרעיון הזה על ידי ביצוע ניסוי פשוט. בשיפועים שהגדרנו עד כה, הייתה לנו צורה מעריכית לאורך העדשה. עכשיו השאלה היא, אם נאתגר את כל אלה יותר על ידי כך שהריכוז יגדל באופן ליניארי לאורך העדשה, האם הם עדיין מסוגלים למצוא את דרכם מתחת לקו הקצה השני?

גרף זה מייצג את שני סוגי הגרדיאנטים. בדקנו את האקספוננציאלי בסגול ואת השיפוע הליניארי בירוק. זהו השיפוע הליניארי, ואני הולך לכתוב את הריכוזים השונים של שמן פארן מדלל איסאם אצטט.

זוהי סדרה אריתמטית. יש לנו שיפוע ליניארי שיתבסס וכפי שאתם יכולים לראות, השיפוע רדוד למדי בהשוואה לשיפוע האקספוננציאלי כאן שבו ריכוז הגפיים גם הוא 0.5, אך עולה ל-0.03. השאלה היא, האם נאווי מסוגל לבצע התקפות כימותרפיות כאשר הם מתמודדים עם שיפוע רדוד כל כך?

כאן, הריכוז הממשי של אצטט המשמש בשש הטיפות עבור השיפוע המעריכי ועבור השיפוע הליניארי. כפי שאתה יכול לראות, למרות שהריכוז הגבוה ביותר זהה בשני המקרים עבור השיפוע הליניארי, הריכוז הנמוך ביותר כאן הוא גבוה למדי. אנו מבצעים את הניסוי עם השיפוע הליניארי, ו-15 מסלולים מיוצגים כאן של חיות בר מסוג בר, ואנו מאמינים שזה די ברור שבעלי חיים אלה הצליחו לזהות את השיפוע הליניארי ולעקוב אחר האות הזה לאורך קו הדאודורנט.

אז אני חושב שהנקודה שלנו ברורה. לפני שאסיים כאן, ברצוני לדבר בקצרה על כיוונים עתידיים למערך מעקב זה. למרות שמערך המעקב הזה מאפשר לך לעשות הרבה דברים מעניינים, למשל, לראות התנהגות מורכבת בזחלים לאורך פרק זמן גדול וארוך יותר, יש לו כמה מגבלות.

לדוגמה, אתה מוגבל לגודל הצלחת שלך, כך שמגביל את משך הזמן שאתה יכול לעקוב אחריו ואת ההתנהגויות המורכבות שאתה יכול להסתכל עליהן. אז זה יהיה נחמד אם נוכל לפתח מערכת שבה הלוח גדול יותר או שאתה לא מוגבל על ידי גבולות הלוח בכלל. בעיה נוספת היא שעם התוכנה שיש לנו כרגע, קשה לעקוב אחר יותר מחיה אחת בו זמנית, ולכן לא ניתן לצפות בהתנהגויות אוכלוסייה בזמן אמת.

היבט מעניין נוסף של ההתנהגות שאיננו יכולים לבחון באמצעות מערך זה הוא התנועות התלת-ממדיות בפועל של הזחלים בחלל. כשאתם עוקבים אחר חיות, אתם תראו שכאשר הן מגיעות לטיפת ריח, הן עשויות להרים את ראשן או לטאטא את ראשן בניסיון לזהות שינויים בריכוז. אולי זה לא אפשרי עם ההגדרה הספציפית שלנו כרגע, אז זה יהיה נחמד לפתח משהו שיאפשר לנו לעשות את זה.