טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה
July 12th, 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.
פרוטוקול זה מספק נתיב גישה קל לעולם הפופולרי יותר ויותר אך המורכב של טומוגרפיה של אלקטרונים קריו. ניתן לדמות שש דגימות תאיות. מכון קרוב למדינת מולדת.
לאחר מכן ניתן לפתור מיקרומולקולות ברזולוציה גבוהה בסביבה התאית הטבעית שלהן באמצעות ממוצע CROW, ET ותת-אטומים. התחל על ידי הפעלת תוכנת Tomo חמש ממחשב שרת TEM. התחל את הגדרת ההפעלה על-ידי התאמת הפרמטרים של רכישת התמונה בכרטיסיית ההכנה, תחת קביעות מוגדרות מראש.
העתיקו את הפרמטרים של רכישת תמונה לכל שאר קביעות ההגדלה הגבוהות המוגדרות מראש. לחץ על Set"כדי להגדיר חשיפה למיקרוסקופ ועל Get" כדי לקבל את הגדרות החשיפה לכל ההגדלות הגבוהות האחרות לאחר בחירתן בנפרד. כדי לאסוף אטלס, לחץ על ההפעלה החדשה"בכרטיסייה אטלס".
הגדר את העדפות ההפעלה. הזן את נתיב האחסון ואת פורמט הפלט ולחץ על apply. בחר הקרנה"וסמן את כל האטלסים שיירכשו.
בחר שסתומי קריאה סגורים"אם המיקרוסקופ אינו מפוקח זה יסגור את שסתומי העמודה. לאחר מכן כדי להתחיל את ההקרנה, לחץ על לחצן התחל. בדוק את האטלסים הבודדים או המרובים לאיתור מטרות על-ידי לחיצה על הרשת בחלונית השמאלית תחת Session Setup"לאחר מכן לחץ שמאלה וגרור את העכבר כדי לנוע ולגלול באמצע כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה.
בחר את הרשת להגדרת היעד. בחר אותו ולחץ על טען דוגמה"מתוך התוכנה. כדי לבצע כיול הזזת תמונה, בכרטיסייה "פונקציות אוטומטיות" הגדר את הקביעה המוגדרת מראש לגובה Eucentric"נווט ל- Auto-Eucentric" לפי הטיית שלב, ולחץ על התחל.
אם התכונה נשארה ממורכזת במהלך המיקוד, דלג על כיול הזזת התמונה. אחרת, עבור אל הכרטיסייה "הכנה" לכיול הזזת תמונה בחר כיול Image Shift" ולחץ על התחל. פעולה זו תתאים את ההגדלה הנמוכה יותר לתכונה המרוכזת בהגדלת החשיפה.
עבור הגדרת טומוגרפיה, התחל הפעלה חדשה ב- Session Setup"עבור דגימות ביולוגיות. בחר Slab כמו"כסוג המדגם ובחר אצווה "ומינון נמוך"ואז בחר את פורמט הפלט ואת תיקיית האחסון". לחלופין, הוסף נמען דוא"ל ולחץ על החל"כדי להגדיר יעדים, עבור אל חץ האטלס, מצא אזור עניין ועבור על ידי בחירת האפשרויות שצצות בלחיצת עכבר ימין.
צלם תמונת סקירה כדי לאשר מיקום טוב להתאמת גובה Eucentric. לאחר מכן לחץ על autoeucentric"כדי להפעיל את שגרת ההטיה של eucentric על ידי שלב, קבל מחדש תמונת סקירה חדשה כדי לעדכן את הגובה eucentric. בדוק את הסקירה המרובעת או את מפת החיפוש שנרכשה.
עבור לאזור עניין ולחץ על חיפוש רכישה. לאחר מכן בדוק את תמונת החיפוש אם אזור העניין אינו ממורכז, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני במיקום הרצוי וחזור על שלב ההזזה כאן"ורכוש תמונה. התאם את אזורי המיקוד והמעקב.
לחץ לחיצה שמאלית כדי לגרור את אזורי המעקב והמיקוד. לאחר הגדרת כל הפרמטרים לחץ על הוסף מיקום"כדי לבצע פונקציות אוטומטיות בדוק את ההגדרות לביצוע היישורים באמצעות הכרטיסייה פונקציות אוטומטיות על ידי ניווט האטלס לאזור של פחמן. הביאו את האזור הזה לגובה האוצנטרי ועקבו אחר סדר היישורים כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן, התחל את הרכישה האוטומטית של הכרטיסייה טומוגרפיה. בחר את לוח איסוף הנתונים"sboard החוצה ולהגדיר את הפרמטרים הרצויים. הגדר פרמטרים לרכישת נתונים: צעד הטיה, זווית חיובית מקסימלית, זווית שלילית מקסימלית, ערכת מעקב.
לאחר מכן בחר סגור שסתומי עמודה"עבור ערכת הגובה האוצנטרית. התחל בהכנת קבצי קלט וספריות. צור תיקיית פרוייקט תחת התיקיה "פרוייקט".
צור ערימות תיקיות קבועות חדשות נוספות והכן את קבצי הקלט. סדרת הטיה אחת קבועה סדרת הטיה 1. XF וסדרת הטיה 1.tlt.
כדי לחשב את defocus, עדכן את קובץ הפרמטרים עם המיקרוסקופ ופרמטרי ההדמיה. העתק קובץ פרמטר לתיקיית הפרוייקט. שנה את שמו ל- param_CTF.
M והפעל את הפקודה המצוינת. לאחר מכן, בדוק את תוצאות הערכת ה- CTF. עבור כל ערימה, בדוק את הערימות המיושרות באמצעות מוד תלת-ממדי וודא שהחרוזים הפידוקיאליים נמחקים כהלכה.
ודא שהיד נכונה על-ידי הפעלת הפקודה שצוינה. לאחר מכן בדוק את ערך ההפחתה וודא שהוא תואם לאומדן CTF התיאורטי. כדי להגדיר את אזורי המשנה, צור טומוגרמה מכופפת.
בתיקיית הפרוייקט, הפעל את הפקודה שצוינה. קבע את הגבולות על-ידי בחירת שש נקודות Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin ו- Zmax, כדי ליצור אזור משנה אחד מתחת לסל התיקיות10, הפעל את הפקודה שצוינה. לאחר מכן, הפעל את בחירת החלקיקים עבור כל תת-אזור.
עבור מערך הנתונים apoferritin לבצע חיפוש תבנית בפח שש. שנה את זווית הקו התחתון של התבנית. פרמטרי חיפוש כדי לקבוע את הזווית, הטווח והמרווחים עבור חיפוש במישור או מחוץ למישור במעלות.
בתיקיית הפרויקט הפעל את הפקודה שצוינה. הסר את החלקיקים השגויים באמצעות מוד תלת-ממדי מתחת לתיקייה. Convmap_wedge_Type2_bin6. הפעל את הפקודה שצוינה.
לאחר מכן, אתחל את הפרויקט. בתיקיית הפרויקט הפעל את הפקודה המצוינת כדי ליצור מסד נתונים לבהירות EM, AppoF.mat. בצע שחזור טומוגרמה לפני תת-טומו ממוצע ויישור כדי ליצור טומוגרמות תת-אזור מתוקנות CTF ב- bin4, הפעל את הפקודה שצוינה.
לאחר מכן, כדי לבצע ממוצע ויישור תת-טומו, בצע את הממוצע באמצעות מברק המשנה המתוקן CTF החל מ- bin4. בתיקיית הפרוייקט, הפעל את הפקודה שצוינה. המשך לבצע יישורים והפעל את הפקודה.
נקה את החלקיקים החופפים על-ידי הפעלת הפקודה שצוינה. בצע שחזור סופי על-ידי שילוב שתי ערכות הנתונים למחצה. בתיקיית הפרויקט הפעל את הפקודות שצוינו.
סקירה כללית של תהליך הטומוגרפיה עבור הטומוגרפיה התאית והמולקולרית מוצגת כאן עבור דגימות תאיות ולמלה, אסטרטגיית איסוף הנתונים תלויה במידה רבה בדגימה ובמטרה של מחקר ההדמיה. פרמטרי איסוף עבור מספר מחקרי cryo ET מוצגים כאן. טומוגרמות מייצגות של דגימות מולקולריות כגון אפופריטין, תהליכים תאיים דקים וקרן יונים ממוקדת טחונה למלה של דגימת התא העבה מוצגות כאן.
ניתוח מבני ברזולוציה גבוהה יכול לעזור לחשוף אתרי קשירה למטרות תרופות וטומוגרפיה וממוצע תת-טומוגראלי סייעו גם בפיתוח חיסון נגד SARS-CoV-2.
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שלבים מפורטים לרכישת נתונים מרחוק ועיבודם בטומוגרפיה קריו-אלקטרונית בחדות גבוהה (cryo-ET) באמצעות apoferritin כמערכת מודל. זרימת העבודה משיגה רזולוציה של מבנה cryo-ET של 2.86 Å, ומציגה שיטות יעילות מאיסוף נתונים ועד לממוצע תת-טומוגרמה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- טומוגרפיה קריו-אלקטרונית
- ביולוגיה מבנית
- הדמיה תאית
רקע
- היכרות עם טכניקות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.
- חשיבות הדמיה של דגימות תאים במצבן הטבעי.
- שימוש ב-apoferritin להמחשת המתודולוגיה.
שיטות ששימשו
- רכישת נתונים מרחוק עם תוכנת Tomo5.
- מתודולוגיות עיבוד באמצעות emClarity לממוצע תת-טומוגרמה.
- הדמיה בחדות גבוהה במערכות ביולוגיות.
תוצאות עיקריות
- הדגמה מוצלחת של איסוף נתונים ועיבודם בחדות גבוהה.
- השגת הדמיה מפורטת של apoferritin ברזולוציה משמעותית.
- מתודולוגיות מאומתות למחקרים עתידיים ב-cryo-ET.
מסקנות
- מחקר זה מספק גישה שיטתית להדמיה בחדות גבוהה בביולוגיה מבנית.
- המתודולוגיות המתוארות רלוונטיות להתקדמות מחקר הטומוגרפיה הקריו-אלקטרונית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
