פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל
June 16th, 2022
מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג'לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג'לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.
פרוטוקול זה מתאר ייצור של מוטות מיקרו-ג'ל המתחברים לפיגומי מיקרו-נקבוביות. ניתן להשתמש בפיגומים אלה בשילוב עם תאים המספקים את המרחב הדרוש לאינטראקציה יעילה עם התא. שני הסוגים השונים של מוטות מיקרו ג'ל מתחברים זה לזה במגע.
יחס גובה-רוחב גבוה מוביל לנקבוביות גדולות יותר תוך שמירה על יציבות הפיגום תוך שימוש בפחות חומר סינתטי בהשוואה למיקרו-ג'לים כדוריים. פיגומי מיקרו-נקבוביות ישפרו באופן משמעותי את החדירה והאינטראקציה של תאים אנדוגניים לתיקון רקמות פגומות. הנקבוביות הגדולות יקלו על היווצרות כלי הדם כדי להחליף חומרים מזינים לרקמה הגדלה.
הפחתת החומר הפיגום מועילה ככל שיותר שטחים פתוחים מסופקים ליצירת רקמות, דבר החשוב הן ליישומי in vitro והן ליישומי in vivo. היבט קריטי הוא המיקרופיטי על טכניקת השיפוע. כדי להבטיח ייצור רציף של מוטות מיקרו ג'ל, יש להעביר את המוצר ביעילות אל מחוץ לצינור ללא סתימה.
כדי להתחיל, להכניס את המחטים לתוך צינורות פוליאתילן ולהסיר את הגז מן המזרק ואת הצינור. לאחר מכן הכנס צינור פוליאתילן נוסף לתוך השקע לאיסוף המוצר. לאחר מכן, מניחים את כל מזרקי הזכוכית ואת משאבות המזרק ומכניסים כל קצה צינור לכניסה המתאימה.
לאחר מכן, מקד את המיקרוסקופ בחתך מי השמן. הפעל את משאבת מזרק השמן הראשונה כדי למלא את הערוץ בשמן תחילה, כדי למנוע הרטבת ערוץ על ידי השלב המפוזר. לאחר מכן, להקטין את קצב זרימת השמן הראשון ל 30 microliters לשעה ולהתחיל את משאבת מזרק טרום פולימר עד שלב מימי מפוזר ניתן לראות בחתך רוחב.
לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה הטרום פולימרית ל -30 מיקרוליטר לשעה ומקד את המיקרוסקופ בשקע. לאחר מכן, הפעל את משאבת מזרק השמן השנייה והמתן עד שמשטר הזרימה יהיה יציב. מניחים את צינור היציאה במיכל איסוף ומגדירים את מערכת קרינת ה- UV כך שההקרנה תהיה בטווח של 900 עד 1000 מילי וואט לסנטימטר בריבוע.
ונקודת ההקרנה היא חלק הערוץ הישר לפני השקע. לפני הקרנת UV, התאם את קצבי הזרימה של הקדם-פולימר והשמן הראשון כדי להשיג את יחס הגובה-רוחב הרצוי בטווח של 3.0 עד 4.5, והגדר את זמן ההקרנה של הפאזה המפוזרת לכ-2.3 שניות, בהתאם לגודל נקודת ההקרנה. לאחר מכן התחל קרינת UV, ובמידת הצורך, התאם את קצבי הזרימה שוב בהתאם לסעיף הקודם.
לאחר מכן, שנה את מיכל האיסוף וציין את זמן ההתחלה וקצב הזרימה של איסוף המוצרים. כדי לסיים את האיסוף, הסר את הגורם המכיל של האוסף המציין את השעה. לאחר מכן, להפסיק את ההקרנה ואת כל משאבות המזרק.
לאחר מכן יש לשטוף את המוצר חמש פעמים כל אחת עם n-הקסאן, איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן הסר את supernatant לאחר שקיעת מוט. מעבירים את פיזור הרכיב הראשון לבקבוקון שקוף חרוטי של 1.5 או שני מיליליטר.
לאחר מכן מוסיפים את הרכיב השני באופן מבוקר בפעולה רציפה עם פיפטה של 100 מיקרוליטר ומערבבים את התוכן ישירות באמצעות הפיפטה כדי לקחת נוזל ולהוסיף אותו שוב. לאחר מכן הוסיפו תמיסת G R G D S P C למבנה המקושר כדי לשנות את כל קבוצות האפוקסי הנותרות כאשר פפטיד דבק התא נושא אמין ותיאלי חופשיים ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לאחר מכן, הסר את המולקולות שלא הגיבו על ידי שטיפה במים שעברו דה-יוניזציה והסר את הסופרנטנט.
לאחר הפחתת מפלס המים, פתח את הבקבוקון ומחק עם אור UV באורך גל, 250 עד 300 ננומטר. לאחר מכן סגור את הבקבוקון והעבר את הבקבוקון לספסל נקי. לאחר מכן, יש לשטוף במים סטריליים.
החליפו את המים בבקבוקון במדיה של תרבית תאים ואפשרו שיווי משקל למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הפיגום המאקרו-נקבובי לצלחת באר של תרבית תאים לצורך הניסוי על ידי מזיגה או שימוש במרית. מיקרוסקופיה קונפוקלית גילתה כי המבנה המאקרו נקבובי התלת-ממדי היה מורכב ממוטות מיקרו-ג'ל פונקציונליים של אמין ואפוקסי.
המבנה מציג גיאומטריה קומפקטית של כ -10, 000 מוטות מיקרו ג'ל שנוצרו תוך שתיים או שלוש שניות. המודולוס של מוטות מיקרו-ג'ל אמין ואפוקסי מבית Effective Young יחד עם כדורי מיקרו-ג'ל אמין ואפוקסי נמדד על ידי כניסת ננו. כדי לזהות קבוצות פונקציונליות פעילות, ניתן להשתמש בפלואורסצין ISO thiocyanate כדי להמחיש קבוצות אמינו ראשוניות ואיזומר אמין פלואורסצין ניתן להשתמש כדי לסמן קבוצות אפוקסי.
למוטות מיקרו ג'ל אמין יש ממדים עם אורך ממוצע של 553 מיקרומטר ורוחב ממוצע של 193 מיקרומטר במים שעברו דה-יוניזציה, וכתוצאה מכך יחס גובה-רוחב של כ-3.0. הערכים הממוצעים של נקבוביות המאקרו והפיגומים המורכבים ממוטות מיקרו ג'ל הם 100 מיקרומטר, כאשר 90% מגודל הנקבוביות נע בין 30 מיקרומטר ליותר מ-150 מיקרומטר. הכדור, כמו מיקרו-ג'לים, יוצר אשכולות עם גודל נקבוביות בין 10 ל-55 מיקרומטר, עם ערך ממוצע של כ-22 מיקרומטר.
מוטות המיקרו-ג'ל המתוארים נועדו לייצר פיגומי מיקרו-נקבוביות המקושרים זה לזה על ידי ערבוב אקראי. הליך ערבוב מבוקר עשוי לאפשר ייצור של גיאומטריות פיגומים מותאמות יותר בעתיד. ניתן לגוון את הנוקשות של המיקרו-ג'לים ואת הרמזים הביוכימיים בהתאם לדרישות המכירה.
על ידי שילוב אבני בניין שונות ניתן להשיג מגוון רחב של גיאומטריות ותכונות בתוך פיגום אחד. בדרך זו אנו יכולים להתמקד בתאים ספציפיים ביעילות כדי ליצור רקמות רב-תאיות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה דן בייצור של מוטות מיקרוג'ל המתחברים זה לזה כדי ליצור מסגרות מיקרופוריות המתאימות לתרבית תאים. העיצוב הייחודי מאפשר נקבוביות גדולות יותר תוך שמירה על יציבות, ומשופרת אינטראקציה של תאים ותיקון רקמות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- חומרים ביולוגיים
- הנדסת רקמות
רקע
- מוטות מיקרוג'ל מיוצרים באמצעות מיקרו-נוזלים.
- יש להם קבוצות תגובתיות משלימות לחיבור.
- מבנים אלו יוצרים נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למיקרוג'לים כדוריים.
- מבנים מאקרו-נקבוביים יכולים לתמוך בתרבית תאים ביעילות.
מטרת המחקר
- ליצור מוטות מיקרוג'ל שיכולים להתחבר למסגרות יציבות.
- לשפר את האינטראקציות בין תאים ביישומי הנדסת רקמות.
- לשפר את חילופי החומרים המזינים דרך מבני נקבוביות גדולים יותר.
שיטות ששימשו
- ייצור מיקרו-נוזלי של מוטות מיקרוג'ל.
- שינוי של מיקרוג'לים עם GRGDS-PC.
- הערכת יציבות המסגרת וגודל הנקבוביות.
- הערכת יעילות תרבית התאים במבנים מאקרו-נקבוביים.
תוצאות עיקריות
- מוטות מיקרוג'ל מתחברים בעת מגע, ויוצרים מסגרות יציבות.
- יחס גודל גבוה מוביל לנקבוביות מיקרו גדולות יותר.
- המסגרות שומרות על יציבות עם פחות חומר סינתטי.
- חדירה ואינטראקציה משופרת של תאים לתיקון רקמות.
מסקנות
- מוטות מיקרוג'ל יעילים ביצירת מסגרות לתרבית תאים.
- נקבוביות גדולות יותר מאפשרות היווצרות כלי דם והחלפת חומרים מזינים.
- גישה זו יכולה לסייע משמעותית ביישומי הנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Interlinked macroporous 3D scaffolds fabricated from functionalized microgel rods enable the creation of high-porosity, mechanically stable constructs for advanced cell-based assays and tissue engineering models. This platform supports efficient cell infiltration and interaction, providing a robust foundation for discovery-stage studies requiring physiologically relevant environments. The method's modularity and tunable properties position it as a reusable capability for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of cell-matrix interactions in a controlled 3D environment.
- Enables functional validation of biomaterial-driven cellular responses.
- Supports predictive confidence in early-stage tissue engineering hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible scaffolds for quantitative cell-based assays.
- Enables preparation of high-porosity constructs for compound screening workflows.
- Supports scalability and platform reuse across multiple assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold architecture with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of biomaterial candidates based on functional cell outcomes.
- Supports mechanistic de-risking by allowing post-modification of active functional groups.
Pipeline & Workflow Integration
This scaffold fabrication method integrates from early discovery through preclinical research, supporting lead identification and translational model development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cell behavior in tunable 3D matrices.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for cell viability and interaction studies.
- Analytics: Provides measurable outputs such as pore size distribution and scaffold stiffness for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical tissue models through customizable scaffold properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-matrix studies.
- Operational Value: Standardizes scaffold production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust, physiologically relevant assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomaterial and tissue engineering programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics and polymer chemistry for scaffold fabrication.
- Needs access to UV irradiation systems and analytical tools for scaffold characterization.
- Demands cross-team standardization for reproducible scaffold properties and assay integration.
- Adaptable to various cell types and experimental models with post-modification options.
- Practical limitations include flow control precision and potential clogging during microgel rod production.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:11
Production and Purification of Amine and Epoxy Functionalized Microgel Rods
3:34
Macroporous Scaffold Formation and Cell Adhesive Post-Modification
4:24
Sterilization and Transfer into Cell Culture Media
5:02
Results: Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods
6:41
Conclusion
