פרוטוקול הצלת עוברים להכלאה בין-מינית בסקווש

פרוטוקול הצלת העוברים הוא חובה להתחדשות של עוברים לא בשלים שמקורם בהצלבות בין-מיניות בין מינים שונים של Cucurbita. הוא משמש בדרך כלל להצלבות בין Cucurbita moschata ו Cucurbita pepo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה.

הפרוטוקול משתמש רק במדיית טרשת נפוצה עם אנטיביוטיקה. לפיכך, ניתן לשכפל אותו בקלות על ידי כל מעבדה. ניתן יהיה לשנות טכניקה זו כדי לחקור מחסומים שונים להכלאה בין-מינית או בין-גנרית.

תשומת לב לפרטים במהלך כל שלב תועיל לתוצאה מוצלחת. התחילו בשתילת צמחי Cucurbita על ידי מילוי 50 תאים מתחילים שטוחים של 25 על 50 ס"מ באמצעות מדיום עציצים בתוספת חנקן מלא, זרחן ודשן אשלגן, המכיל 1.38 גרם לקילוגרם של חנקן, זרחן ואשלגן כל אחד. לאחר מכן, זורעים את הזרעים לעומק השווה לאורכם ומכסים אותם במדיום העציצים.

להשקות את הדירות מבלי ליצור מים עומדים ולשמור על המדיה לחה על ידי השקייתן פעם ביום. בסוף שלב העלה האמיתי השני, השתלו את השתילים בעציצים בקוטר 30 ס"מ בתוספת שלוש כפות דשן שלם לכל סיר. לאחר כל שבעה ימים, להפרות כל סיר עם 500 מיליליטר של דשן נוזלי המכיל 20, 20, 20 חנקן, זרחן ואשלגן בגרם אחד הוסיף לגלון של מים.

לשמור על צמחים בחממה בטמפרטורות שבין 22 ל 28 מעלות צלזיוס תחת משטר האור הטבעי. עבור גנוטיפים vining, לספק trellis תומך בחממה. בצעו הכלאה מבוקרת או האבקה ברגע שהצמחים מתחילים לפרוח בגיל שישה עד שמונה שבועות מהזריעה.

בדקו את הפרחים שלא נפתחו בעלי גוון צהוב על עלי הכותרת, וזהו פרחים זכריים ופרחים נקביים של תרבויות Cucurbita pepo ו- Cucurbita moschata. כדי למנוע האבקה מקרית של חרקים, הדבק בעדינות את הפרח הסגור בחלקו העליון באמצעות סרט מיסוך. למחרת בבוקר, בצע את ההאבקה לפני 10:00 בבוקר על ידי הסרה עדינה של החלק העליון המודבק של הפרח הזכר והנקבה.

הפרדת עלי הכותרת מהפרח הזכרי, והעברת האבקנים על ידי שפשוף עדין של הפתח על הסטיגמה של הפרח הנקבי. לאחר ההאבקה, סגרו מיד את הפרח הנקבי המואבק עם סרט מיסוך, והשתמשו בתג כדי לתעד את תאריך ההאבקה ולציין את ההורים האבהיים והאימהיים המשמשים בצלב. צלב מוצלח המסומן על ידי שחלה מורחבת יהווה פרי קטן תוך שבוע.

קוטפים את הפרי לאחר 45 עד 55 ימי האבקה. הכינו ציר צ'פוטקסימה. סננו אותו דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל 0.22 מיקרון.

ולעשות 0.5 מיליליטר aliquots של 250 מיליגרם לכל מיליליטר cefotaxime לפני אחסון אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. באופן דומה, להכין מלאי אמפיצילין. מסננים אותו דרך מסנן מזרק סטרילי של 0.22 מיקרון ומכינים אליקוטים של מיליליטר אחד של 100 מיליגרם למיליליטר אמפיצילין לפני שמאחסנים אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.

הכינו את Murashige ו-Skoog, או MS medium על ידי המסת 2.45 גרם של המדיום ב-500 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק של ליטר אחד. הוסיפו 1.5 גרם של מסטיק גלן למדיום MS וסובבו אותו בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מצננים את המדיום על ידי הנחת הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.

הפשירו את מלאי האנטיביוטיקה בתוך ארון הזרימה הלמינרית. מעבירים את הבקבוק הבינוני למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ומוסיפים 0.6 מיליליטר של מלאי cefotaxime ו-0.25 מיליליטר של מלאי אמפיצילין למדיום עם ערבוב נכון. יוצקים כשבעה מיליליטר של המדיום לתוך צלחת פטרי סטרילית סטרילית בגודל 60 על 15 מילימטרים.

תנו למדיום להתמצק בצלחות הפטרי למשך כ-15 עד 20 דקות. סגרו את צלחות הפטרי בעטיפת איטום והכניסו אותן לקופסת אחסון בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. קוטפים את פרי הדלעת על ידי כריתתו מהגפן הראשית ומחטאים את הפרי על ידי שטיפת פני השטח שלו בכיור המעבדה באמצעות חומר ניקוי נוזלי כמו 0.3% כלורוקסילנול.

שטפו את הפרי במי ברז רבים ויבשו אותו במגבות נייר נקיות לפני העברת הפרי לארון זרימת האוויר למינציה. יש לעקר את משטח הפרי בתוך הארון על ידי ריסוס 70% אתנול. חותכים את הפרי בסכין סטרילית ומוציאים את הזרעים.

השתמש במלקחיים סטריליים או בידיים עם כפפות סטריליות כדי לפתוח באופן אספטי את שכבת הזרעים ולחשוף את העוברים הלא בשלים לפני הנחתם בצלחת פטרי המכילה MS Medium בתוספת אנטיביוטיקה. אטמו את לוחות הפטרי באמצעות סרט עטיפה והניחו אותם בתא גידול בעל טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, תקופת צילום של 16 שעות ולחות יחסית של 70%. במקרה של זיהום, מיד תת-תרבות העוברים הלא מזוהמים לתוך צלחת חדשה בעלת אותו מדיום.

לאחר פיתוח שורשים לאחר 10 עד 14 יום, והקוטילדונים מפותחים לאחר 15 עד 21 יום, הוציאו את הצמחים מהכלים הפטריים, ושטפו בעדינות את המדיה הקיימת סביב השורשים באמצעות מי ברז. מניחים צמחים מנוקים במיכל פלסטיק בגודל 14 על 9 על 4 ס"מ ומכסים את השורשים במגבות נייר רטובות. מכסים את המיכל ומרטיבים מחדש את מגבות הנייר בעת הצורך.

הקפידו על מיכלי הפלסטיק בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס, ובפרק זמן של 16 שעות כדי להתאקלם בצמחים תוך שמירה על מצב הלחות של מגבות נייר. לאחר 7 עד 10 ימים של התאקלמות, מעבירים את השתילים באורך שלושה עד ארבעה סנטימטרים ל-50 תאים המכילים תערובת עציצים מסחרית מתוקנת עם דשן ומעבירים אותם לחממה. יש להימנע מהשקיית יתר כדי למנוע ריקבון ולהוסיף כ-10 עד 20 מיליליטר מים לתא לפי הצורך.

בשלב השני עד השלישי של העלים, משתילים את השתילים לעציצים בקוטר 25 ס"מ מלאים במדיום עציצים מתוקן בדשן ומבצעים הכלאה מבוקרת כאשר הצמחים מתחילים לפרוח. שמרו על הצמחים בחממה בטמפרטורה של 22 עד 28 מעלות צלזיוס תחת משטר האור הטבעי. ולהעריך את הצמחים עבור תכונות פירות וזרעים.

ארבעה פפו קוקורביטה ו-11 קוקורביטה מושצ'טה נבחרו להכלאה בין-מינית. מתוך 24 צירופי צלב בין-ספציפיים שנוסו, הושגה ערכת פירות עבור 22 צלבים המייצגים יותר מ-92% הצלחה בערכת הפירות. ההצלבות בין Cucurbita moschata ו- Cucurbita pepo המערבות גנוטיפים O ו- M, וגנוטיפים E ו- J, לא הניבו פרי בוגר.

ואילו ההכלאה בין Cucurbita moschata לבין Cucurbita pepo שכללה גנוטיפים F ו-J, הניבה שישה פירות. מספר הפרחים המואבקים עבור שילובי צלב שונים נע בין 1 ל -11. ושיעור ההצלחה של ההאבקה נע בין 0% ל-100% מתוך 44 פירות שהופקו מכל צירופי הצלב, רק פרי אחד מהכלאה בין Cucurbita moschata ו-Cucurbita pepo, גנוטיפים C ו-J יצרו עוברים לא בשלים שניתן להציל.

לצורך פיתוחם של עוברים לא מפותחים אלה, הם גודלו בתרבית באמצעות המדיה להצלת עוברים, מה שהביא לאחוזי הצלחה של 80% בהצלת עוברים. שני ההליכים החשובים ביותר הם זיהוי הצלבות תואמות בין שני מינים כלומר, Cucurbita moschata ו- Cucurbita pepo, והתחדשות עוברים מוצלחת. מכיוון שטכניקת הצלת העוברים היא פשוטה וניתנת לשכפול בקלות, מגדלי סקווש ברחבי העולם יכולים להשתמש בטכניקה זו להצלת עוברים לא בשלים שמקורם בהצלבות בין-ספציפיות בין מיני Cucurbita שונים.