שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה

בשיטה זו, הכוח מוחל ישירות על הגרעין. פעולה זו מנתקת את אפקט העברת הכוח מממברנת הפלזמה התאית ומהשלד הציטוסקולרי, וחושפת את המנגנונים המולקולריים של מכניוסנסינג גרעיני. הכוח מופעל בתוך התאים החיים בצורה לא פולשנית.

בהשוואה לפינצטה אופטית, השדה המגנטי והכוח המגנטי אינם משפיעים על תפקודי התא ובעלי תפוקה גבוהה יותר. התחילו לגדל את התאים עם מיקרובים מגנטיים על ידי שקילה של 0.2 גרם של מיקרובי ברזל קרבוניל בקוטר ממוצע של שבעה מיקרומטרים. להשעות את החיידקים במדיום תרבית RPMI 1640 מיליליטר אחד באמצעות פיפטה.

לאחר מכן קחו את צלחת הפטרי עם תאי B2B לארון הביו-בטיחות והוסיפו במהירות 200 מיקרוליטרים של המדיום המכיל מיקרובים לצלחת פטרי. שים את צלחת פטרי באינקובטור עד שהמיקרובים מופנמים על ידי התאים. פתח את המיקרוסקופ ההפוך ובאמצעות הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית, קבע את הזמן האופטימלי להפנמת קווי התאים כל שש שעות על ידי הדמיה של גבול המיקרוב, הגרעין והתא.

המיקרובים המופנמים יהיו נוכחים בגבולות התא. עבור יישום כוח קטן והדמיית תאים חיים, פתח את יישום התוכנה Elements. כדי להגדיר את התצורה של חיפוש מגנטי, לחץ על הלחצן אחד מעל שניים כדי להגדיר את מהירות הסריקה למסגרת אחת לשתי שניות.

הגדר את גודל חור הסיכה ל-1.2 יחידה אוורירית. בדוק רק את ערוץ FITC והגדר את PMT HV כ- 70, היסט כאפס, עוצמת לייזר כ- 10. כדי להגדיר את גרעין YAP המגנטי של התצורה, הגדר את מהירות הסריקה למסגרת אחת לארבע שניות על-ידי לחיצה על לחצן אחד מעל ארבע.

לאחר מכן לחץ על כפתור 1.2 Airy unit כדי להגדיר את גודל חור הסיכה ליחידה 1.2 Airy ובדוק את ערוץ FITC. הגדר את PMT HV כ- 70, היסט כאפס, עוצמת לייזר כ- 10. להדמיית גבול הגרעין ועוצמת הכתם הגרעיני, בדקו את תעלת ציאנין 5.

אל תלחץ על לחצן 1.2 Airy unit והגדר את PMT HV ל-70, היסט לאפס ועוצמת הלייזר ל-10. גודל חור הסיכה יותאם להדמיית חלבונים תלת-ממדית הקשורה ל-YES. לאחר מכן, הפעל את DIA באמצעות אלמנטים.

פתח תצוגת סיבוב, השתמש בשדה בהיר והתאם את המיקוד של האובייקט כדי לקבל תמונה ברורה של תאים במיקוד. השתמש במטרה של פי 10 כדי למצוא תאים בודדים מרובים מתאימים בשלושה תנאים, כגון תא עם מיקרוב יחיד בפנים, עם מיקרובים מרובים בפנים, וללא מיקרובים בפנים. לאחר מכן עבור למטרה 40X ותן שם למיקום זה עם מספר המיקום המתאים.

פתח את Elements, לחץ על חיפוש מגנטי, הסר אינטרלוק, לאחר מכן סרוק כרטיסיות, ולאחר מכן בחר את הלחצנים העליונים והתחתונים כדי להתאים את מיקום Z של מישור המוקד לקביעת הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z של התאים שנבחרו. הפסק את הסריקה על-ידי לחיצה נוספת על סרוק. עבור לתצורת גרעין YAP מגנטי והגדר את שם הקובץ כ- before_small_force.nd2.

לחץ על כפתור ההפעלה עם ערימת Z המוקלטת. עבור לנתיב האור הימני והפעל את DIA. פתח תצוגת סיבוב ולחץ על כפתור ההקלטה.

הזז את המגנט ל-46 מילימטרים מעל תחתית צלחת פטרי על ידי סיבוב הידית של המכשיר הנע מגנט. שמור ובדוק את הסרטון כדי לאשר את תזוזת החיידקים המושרה על ידי כוח מגנטי. חזור על הליך הסריקה על-ידי הגדרת שם הקובץ כ- after_small_force.nd2.

לאחר מכן, עבור לנתיב האור הימני, הפעל את DIA ופתח תצוגת סיבוב לפני שתלחץ על כפתור ההקלטה. סובב את ידית המכשיר הנע מגנט עד 120 מילימטרים מעל תחתית צלחת פטרי ושמור רצף תמונות או סרטון brightfield. חזור על השלבים לסריקה על-ידי הגדרת שם הקובץ ל- before_large_force.nd2.

המיקרובים אינם יכולים לפלוט פלואורסצנטיות תחת עירור לייזר בערוץ FITC או בערוץ 5 של ציאנין. לפיכך, המיקרובים המופנמים זוהו על ידי החלול הכהה הממוקם בהדמיה הקונפוקלית של פלואורסצנציה של חלבון וגרעין הקשורים ל-YES. מעגליות גרעינית לא הראתה הבדל משמעותי בין תאי בקרה לתאים עם הפנמת מיקרובים.

גם היחס בין גרעין תא חלבון לציטופלסמה הקשור ל-YES של תאי בקרה שגודלו בתרבית עם מיקרובים אך ללא הפנמה ותאים עם הפנמת מיקרובים לא הראה הבדל משמעותי. דפורמציית הגרעין ודה-פילמור של אקטין נגרמו על ידי כוח הדחיסה שהפעילו החיידקים בתאים המכילים שלד ציטוסקולרי. עקומת כיול ניתוח ההדמיה הכמותי המסופקת על ידי יחסי תזוזת כוח AFM הכמותיים.

בהתבסס על מערכת יחסים זו, הוערך כוח החרוזים שהופעלו. דפורמציית הגרעין וטרנסלוקציה של חלבונים הקשורים ל-YES נצפו ביישום או בשחרור הכוח המגנטי. שינויי העוצמה בחלבון הקשור ל-YES בתעלה הירוקה וללא שינוי בכתם הגרעין בתעלה האדומה אישרו כי העיוות הגרעיני המושרה בכוח המגנטי נגרם על ידי טרנסלוקציית החלבון הקשורה ל-YES.

כימות השינוי נטו של יחס גרעין החלבון הקשור ל-YES בתוך שתי קבוצות אישר כי הכוח המגנטי המופעל על המיקרובים בתוך הציטופלסמה גרם לטרנסלוקציה של החלבון הקשור ל-YES ושינה את יחס גרעין החלבון הקשור ל-YES. לפני הפעלת כוח והדמיה, ודא שהתאים הפנימו את החרוזים המגנטיים והחרוזים נמצאים בתוך גבולות התא.