איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon
1 ביולי 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר סכמה כללית וקלה ליישום לאיסוף נתונים מוטים של חלקיק יחיד בניסויי cryo-EM. הליך כזה שימושי במיוחד לקבלת מפת EM באיכות גבוהה עבור דגימות הסובלות מהטיה אוריינטציה מועדפת עקב היצמדות לממשק אוויר-מים.
הטיית שלב הדגימה מספקת דרך פשוטה וניתנת להכללה להגדלת התפלגות הכיוון של חלקיקים במהלך איסוף נתוני cryo-EM של חלקיק יחיד. הפיזור האחיד של החלקיקים המתקבלים כתוצאה מהטיה של שלב הדגימה מאפשר שיפור באיכות המפה הכוללת וביכולת הפרשנות. התחל על ידי יישור המיקרוסקופ כדי להבטיח הארה מקבילה של הדגימה ולמזער סטיות תרדמת.
כדי לזהות את הריבועים המתאימים לאיסוף נתונים, רשום אטלס רשת ללא הטיית במה או עם הטיית שלב, המספק סקירה כללית של איכות הרשת הכוללת ואינדיקציה ראשונית לאזורים מתאימים לאיסוף נתונים. בדוק את הריבועים באופן ידני בהגדלה המשמשת בצומת רכישת ריבועים. חפשו את הריבועים שבהם נייר הכסף שלם, אינו נראה מיובש ובעל עובי קרח אידיאלי, והזיזו את שלב הדגימה לריבוע מעניין.
קבע את הגובה האוצנטרי עבור מיקום הבמה באמצעות נדנוד אלפא בהטיית במה בסביבות 15 מעלות וכוונן את גובה Z כדי להביא את הבמה לגובה אאוצנטרי באמצעות לוח המקשים למיקרוסקופ. ודא שהיסט התמונה מינימלי במהלך שגרת נדנוד אלפא. כדי למצוא גובה Z מדויק יותר, הערך אותו בצומת המיקוד בהגדלה המשמשת בצומת רכישה ריבועית.
התאם את ההגדרות עבור צומת המיקוד והפעל או בטל את אפשרות המיקוד Z העדינה במהלך התור הראשוני של ריבועים. לאחר מכן לחץ על Simulate. הטה את שלב הדגימה לזווית ההטיה הרצויה לאיסוף נתונים בגובה האוצנטרי האמיתי ומרכז מחדש את הבמה במידת הצורך.
הקש Simulate בצומת הרכישה הריבועי כדי להתחיל להציב יעדים בתור עבור חשיפות שלמות של צומת רכישה. לאחר מכן, בחרו יעד מיקוד Z ואזורים עם חורים המתאימים לחשיפות להגדלה גבוהה והגישו את המטרות לתור להדמיה. החזירו את שלב הדגימה למצבו הבלתי מוטה ולאחר מכן עברו לריבוע הבא.
חזור על שלבים אלה עד למספר מספיק של חשיפות שלמות בתור. לאחר שכל הריבועים עומדים בתור, עבור אל צומת הפילוח כולו ולחץ על שלח יעדים בתור. בחר אפשר לאימות משתמש של יעדים נבחרים בהגדרות צומת ובדוק ידנית את המטרות שנבחרו על-ידי צומת רכישת החשיפה להגדלה גבוהה כדי לבדוק אם מאתר חורי ה- EM האוטומטי יכול לזהות במדויק את האזורים המתאימים לרכישת תמונה בעת הטיית שלב הדגימה.
לאחר שהמשתמש מרוצה מדיוק הפילוח, בטל את הבחירה באפשרות אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים לאיסוף נתונים אוטומטי. התמונות המייצגות של הרשת בהגדלה מרובעת עם זוויות הטיה שונות שנאספו קרוב ורחוק מגובה Z האיוצנטרי מוצגות כאן. מרכז הקרן מסומן על ידי מרכז הטבעות הקונצנטריות האדומות והחץ הירוק מציין את ריבוע העניין.
קיימת תכונת רשת שבורה הצמודה לריבוע העניין לצורך התייחסות. להלן החשיפות המייצגות לחורים וממוצעים דו-ממדיים שנאספו בזוויות הטיה של 0 מעלות, 30 מעלות ו-60 מעלות. למרות שריכוז החלבון אינו משתנה על פני זוויות ההטיה השונות, זווית הטיה גבוהה יותר גורמת לאזור המצולם להיראות צפוף יותר במונחים של ריכוז חלקיקים.
ממוצעי מחלקות דו-ממדיות המושפעים מצפיפות מוצגים בתיבה אדומה זו. פשטות הפרוטוקול מאפשרת לכל משתמש סטנדרטי במיקרוסקופ להתאים בקלות אסטרטגיית איסוף נתונים מוטה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה פשוטה לשיפור איסוף נתונים במיקרוסקופיה קריוגנית של חלקיקים בודדים (cryo-EM) באמצעות הטיה של במה השמישה. גישה זו מועילה במיוחד לשיפור איכות המפות של EM עבור דגימות המראות הטיה של אוריינטציה מועדפת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryo-EM)
- ביולוגיה מבנית
- ניתוח חלקיק בודד
רקע
- קריו-EM של חלקיק בודד (Single-particle cryo-EM) חיונית לקביעת המבנים של מקרו-מולקולות ביולוגיות.
- דגימות סובלות לעיתים קרובות מהטיה של האוריינטציה (orientation bias) כאשר הן נצמדות למשטחים.
- שיפור באוריינטציה של החלקיקים יכול לשפר את איכות המפה.
- הטיית הבמה היא שיטה להשגת התפלגות אחידה יותר של החלקיקים.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול להטאת במה של הדגימה במהלך איסוף נתונים ב-cryo-EM.
- להפחית הטיות של אוריינטציה מועדפת בדגימות.
- לשפר את יכולת הפירוש של מפות EM.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- כיול המיקרוסקופ לתאורה אופטימלית.
- הקלטת אטלס רשת להערכת איכות הרשת.
- בדיקת ריבועים לתנאים אידיאליים לפני איסוף נתונים.
- בחירה ידנית של ריבועים על בסיס שלמות הרדיד ועובי הקרח.
תוצאות עיקריות
- הטיית הבמה מגדילה את התפלגות האוריינטציה של החלקיקים.
- נצפו שיפור באיכות הכללית של המפה וביכולת הפרשנות שלה.
- זיהוי מוצלח של ריבועים מתאימים לאיסוף נתונים.
- הפחתת Aberrations מסוג coma באמצעות יישור נכון.
מסקנות
- הטיית במה של הדגימה היא אסטרטגיה יעילה ב-cryo-EM.
- שיטה זו יכולה לשפר משמעותית את האיכות של מפות EM.
- יישומים עתידיים עשויים לדייק עוד יותר את טכניקות איסוף הנתונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
מיקרוסקופיה אלקטרונית בקירור (cryo-EM) של חלקיקים בודדים עם הטיית במה פותרת צוואר בקבוק קריטי בביולוגיה מבנית על ידי התגברות על אוריינטציה מועדפת של חלקיקים, העלולה להגביל את יכולת הפירוש והרזולוציה של המפה. יכולת זו משפרת את הביטחון בחיזוי בקביעת מבנים מקרו-מולקולריים, ומשפיעה ישירות על נקודות מפנה בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות. גישה זו תואמת באופן רחב לפלטפורמות TEM סטנדרטיות, ותומכת באיסוף נתונים בר-שחזור וניתן להרחבה על פני פורטפולי R&D בביופארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מבנית מקיפה של מטרות מקרו-מולקולריות באמצעות שיפור התפלגות האוריינטציה.
- מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה הודות לרזולוציית מפה איזוטרופית.
- תומך בביטחון חיזוי עבור עיצוב תרופות מבוסס-מבנה ומיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין סטים של נתונים מבניים שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה חישוביים ותהליכי סינון בהמשך הדרך.
- מאפשר הערכה כמותית וניתנת לשחזור של התפלגויות חלקיקים לאורך תנאים שונים.
- מאפשר הערכה מהימנה של פרוטוקולים להכנת דגימות ושל איכות הרשת (grid).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- משפר את הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת נתונים מבניים באיכות גבוהה.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות שיפור יכולת הפרשנות של המפה.
- מתיישב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים כאשר תובנות מבניות מנחות בדיקות פונקציונליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
איסוף נתונים של cryo-EM עם הטיה של הבמה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהוא מאפשר אפיון מבני חסון בשלבים מוקדמים וביניים של תהליך הפיתוח.
- ביולוגיה של הגילוי: מגבירה את כוח בדיקת ההשערות על ידי הפחתת הטיות אוריינטציה והבהרת הארכיטקטורה המקרו-מולקולרית.
- סריקה: מספקת התפלגויות אוריינטציה כמותיות וניתנות לשחזור לצורך מוכנות לבדיקה וסטנדרטיזציה של שיטות.
- אנליטיקה: מספקת מפות איזוטרופיות באיכות גבוהה לצורך ניתוח השוואתי ואופטימיזציה של תנאים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות פרה-קלינית על ידי הבטחת מהימנות נתונים מבניים עבור יישומים בהמשך התהליך.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה ניתנת להכללה ותואמת לציוד, לשימוש חוזר במגוון מטרות ופרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מבנית בתיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מעניק סטנדרטיזציה לאיסוף נתונים, מגביר את השחזוריות, ותואם לתשתיות TEM קיימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות מסוג go/no-go ומפחית סיכונים בשלבים מאוחרים על ידי אספקת ראיות מבניות חזקות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של מטרות המוכחות מבנית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור cryo-EM ובטיפול בדגימות.
- דורש גישה למכשירי TEM סטנדרטיים ולתוכנת Leginon לרכישה אוטומטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת רשתות ואיסוף נתונים.
- ניתן להתאמה למגוון של דגימות מקרו-מולקולריות וסוגי רשתות.
- יש לנטר ולמנוע צפיפות יתר אפשרית בזוויות הטיה גבוהות.
