יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות

היכולת שלנו לחזות במדויק כיצד בני אדם מגיבים לתרופות במהלך ניסויים קליניים מוגבלת בשל היעדר מודלים פרה-קליניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. המערכת המיקרופיזיולוגית הזו יכולה להתמודד עם הפער הזה. מערכת זו שמקורה בתאים אנושיים מחקה במדויק את כל אופי מחלת המפרקים של דלקת מפרקים ניוונית בברך האדם, מה שמאפשר בדיקה של תרופות לשינוי מחלה לפני ניסויים קליניים, מה שעשוי לחסוך מיליוני דולרים.

התחל להכין ג'לטין מתקרילט, או GelMA, על ידי הוספת 17 גרם של ג'לטין מסוג B ל 500 מיליליטר של מים מזוקקים. ערבבו במשך 30 דקות על שייקר בחום של 37 מעלות צלזיוס והוסיפו 13 מיליליטר של אנהידריד מטאקרילי לפני ערבוב לילה על שייקר. למחרת, להכין סביב 60 מיליליטר של aliquots של GelMA לתוך שקיות דיאליזה.

הניחו את כל שקיות הדיאליזה במים מזוקקים עם מוט ערבוב למשך שבעה ימים. החליפו את המים מספר פעמים ביום והשאירו את השקיות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השביעי, יוצקים את הג'למה לצלחת ומקפיאים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הליאופיליזציה.

לאחר מכן, lyophilize GelMA על ידי הצבתו בתא ואקום של lyophilizer. יש להקפיד על ייבוש מלא לפני ההסרה מהליופיליזר. לאחר מכן, המיסו את הג'ל הליופילי בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס בריכוז של 15% והתאימו את ה- pH ל -7.4 באמצעות כמות קטנה של נתרן הידרוקסידי.

בהתבסס על הנפח שנרכש, להשלים את התמיסה עם אנטיביוטי antimycotic ו 0.15% ליתיום פניל פוספינאט, או LAP. הגן על פתרון GelMA מפני אור ואחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. Autoclave 3D הדפיס תאים ביוריאקטורים בזרימה כפולה, מכסים ותוספות בשקיות autoclave ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עם קיטור.

ואז, במשך 20 דקות עם חום יבש. לאחר העיקור, יש להשרות את תאי הביוריאקטור, המכסים והתוספות ב-15 מיליליטר של PBS סטרילי למשך הלילה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, ולאחר מכן לייבוש מלא. באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, יש להשהות 20 פעמים 10 לתאי גזע מזנכימליים מזנכימליים ממח העצם האנושי השישי, או MSCs, למיליליטר בתמיסת 15% GelMA.

לאחר מכן, לחצו תבנית סיליקון סטרילית ויבשה על צלחת פטרי, באמצעות כפפות סטריליות. הכניסו תוספת אחת לכל חור של תבנית הסיליקון עם מלקחיים כאשר צד החור של האינסרט פונה כלפי מטה. לאחר שתסיים, הוסף כ -50 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל תוספת באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.

הצליבו את הג'ל בתוך האינסרט על ידי חשיפת החלק העליון לפנס UV באורך גל של 395 ננומטר למשך 1.5 דקות, ולאחר מכן הארת הצד השני למשך 30 שניות. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו מיד את התוספות לשמונה מיליליטר של מצע גידול בתרבית שאינה רקמה שש פלטות באר ואפשרו לתאים להתאושש בן לילה. כדי ליזום את ההבחנה של רקמת השומן, להעביר את תוספות לשמונה מיליליטר של מדיום אדיפוגני ולגדל אותם במשך 28 ימים עם שינוי בינוני יומי.

כדי להנדס את היחידות האוסטאוכונדרליות, הכניסו את התוספות לתאי ביוריאקטור בעלי זרימה כפולה, סגרו את הבארות והזרימו את שני הזרמים בנפרד בקצב זרימה של חמישה מיקרוליטר לדקה עם 35 מיליליטר של תווך אוסטאוגני ו-35 מיליליטר של תווך כונדרוגני. שמור על תאים להתמיינות במשך 28 ימים על ידי ביצוע שינויים מזרק דו שבועי עם סוגי המדיום המתאימים. כדי להפיק את הפיברובלסטים, להבדיל את MSCs בתרבית דו-ממדית בבקבוק תרבית תאי רקמה T 150 סנטימטר מרובע המכיל 20 מיליליטר של תווך פיברוגני למשך 21 יום.

שמור על השינוי השבועי של המדיום. לאחר 21 יום, השתמש ארבעה מיליליטר של טריפסין כדי לנתק את התאים. עטפו את הג'לים התלת-ממדיים בתוך התוספות.

כדי להשיג רקמה סיבית סינוביאלית, או SFT, בצע פרוטוקול דומה. חבר את צינורות הסיליקון, בעלי קוטר פנימי של 0.062 אינץ 'וקוטר חיצוני של 0.125 אינץ ', למוט הביוריאקטור הזעיר בקצה אחד ולמחברי נעילת פיתוי F 1/16th בקצה השני. לאחר מכן, autoclave bioreactors 3D minijoint יחד עם צינורות סיליקון ומכסים.

הכינו והעמיסו 35 מיליליטר של מדיום שישמשו לתרבית המיני-משותפת למאגרים הבינוניים. השתמש במלקחיים ישרים כדי להעביר את יחידות האוסטאוכונדרל מהביוריאקטור בזרימה כפולה לבאר הימנית של הביוריאקטור המיני-מפרקי. מעבירים את החדרת רקמת השומן ואת החדרת הרקמה הסיבית לבארות השמאלית והאמצעית, בהתאמה, לפני כיסוי כל הבארות בעפעפיים מעוקרים.

חבר את פתחי הקליפס הזעירים למאגרים הבינוניים ואת השקעים למזרקים. לאחר מכן, הרכיבו את המזרקים על משאבת מזרק. מעבירים את המשאבה והשבבים לאינקובטור.

מניחים את המאגרים הבינוניים על קרח מחוץ לאינקובטור. הפעל את המשאבה במצב נסיגה, ומשך את התווך מהמאגר הבינוני לתוך תא הביוריאקטור המיני-מפרקי. המשך תהליך תרבית מיני-משותף זה במשך 28 ימים.

כדי למדל את דלקת המפרקים ואת ניוון הסחוס, הוסף אינטרלוקין בטא אחד לזן הבינוני הפיברוגני ב -10 ננוגרם למיליליטר למשך שבעה ימים. הקפד להחליף את המזרק ביום השלישי לפני מתן אינטרלוקין טרי בטא אחת למדיום פיברוגני. לצורך בדיקת התרופה, לאחר שלושה ימים של טיפול בטא אחד באינטרלוקין, יש לתת את התרופה או בתווך המשותף, המדמה מתן תוך מפרקי, או בכל סוגי המדיום, המדמה מתן מערכתי.

לאחר שבעה ימים של טיפול בטא אחד interleukin, לאסוף רקמות בודדות לניתוח. לאחר הסרת התוספות באמצעות מלקחיים סטריליים, דחפו אגרוף ביופסיה דרך מרכז האינסרט כדי להסיר את הג'ל והניחו את הג'ל ב-PBS. לאחר מכן, לחתוך את הג'ל osteochondral לשניים תוך הערכת ביטוי הגן.

לאסוף צנטריפוגה סביב 1.5 מיליליטר של מדיה מכל מקור בינוני ב 14, 000 G במשך 10 דקות. לאחר השלכת המשקעים, הבזק להקפיא את המדיה המותנית בחנקן נוזלי. עבור צביעה היסטולוגית וצביעה חיסונית, ראשית, יש לתקן את הרקמה הסיבית האוסטאוכונדרלית והסינוביאלית, או דגימות SFT, בפורמלין חוצץ של 10% ולייבש אותן באתנול בריכוזים עולים.

נקה את הדגימה בקסילן, הטמע אותם בפרפין, ולבסוף, חלק את הדגימות לעובי שישה מיקרומטר. במקרה של רקמת שומן, יש להכתים ישירות את הדגימות הפורמליות והקבועות החוצצות ב-10%, בתמיסת O אדומה שמן או BODIPY. הפנוטיפים הספציפיים לרקמות נשמרו היטב עבור רקמות המיקרו הבודדות.

כל רקמות המיני-מפרק נאספו כדי לנתח את הפנוטיפים שלהן לאחר 28 ימי תרבית. המרכיב האוסאוסאוסי ברקמות המיקרו של יחידות האוסטאוכונדרל ביטא רמות גבוהות של אוסטיאוקלצין. בחלק הסחוס של האוסטאוכונדרל, הרקמות ביטאו רמות גבוהות באופן משמעותי של קולגן מסוג 2 ואגרקן.

רמות הביטוי של גנים אדיפוגניים מייצגים, אדיפונקטין ולפטין היו גבוהות יותר ברקמת השומן. שקיעת מינרלי סידן, פוספטאז אלקליין וחלבון אוסטיאוקלצין נצפתה בעיקר בגודל העצם של רקמות מיקרו אוסטאוכונדרליות. צד הסחוס של רקמות אוסטאוכונדרליות הראה גליקוזאמינוגליקן שמורה היטב וקולגן מסוג שתיים.

הביטוי של סמנים הקשורים להיפרטרופיה של כונדרוציטים, קולגן מסוג 10 וקיפוד הודי, היה מווסת באופן משמעותי לאחר 28 ימי תרבית. שקיעת טיפות שומנים בשפע נמצאה ברקמת השומן. הצביעה האימונופלואורסצנטית הראתה סיכה חזקה וביטוי קדרין 11 על ידי SFT לאחר ארבעה שבועות של תרבית.

במודל המחלה, טיפול בטא IL one הביא לאפופטוזיס תאי ולרמות גבוהות של MMP-13 ב-SFT. השפלת הסחוס טופלה על ידי IL one beta, מה שמרמז על התרחשות של crosstalk בין הרקמות האוסטאוכונדרליות לבין SFT. היעילות הטיפולית של נפרוקסן באמצעות מתן סיסטמי הראתה ירידה בפירוק הסחוס במיני מפרק בטא IL.

בדיקת PCR בזמן אמת הצביעה על כך שארבע התרופות הפוטנציאליות לשינוי אוסטיאוארתריטיס הפכו חלקית את אובדן הסחוס. השלבים החשובים ביותר של הליך זה כוללים קישור צולב של הג'לים בתוספות ואת מיקום החדרת לתוך bioreactor. השבב מאפשר לחקור את תרומתם של גורמי סיכון אחרים המוצעים בדלקת מפרקים ניוונית, כגון השמנת יתר ופגיעה מכנית.

זה יכול לשמש גם כדי ללמוד מחלות מפרקים אחרות.