Name: CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד עריכת CRISPR-Cas9 מדויקת בדגי זברה לחקר תסמונת QT ארוכה. השיטה משלבת זיהוי פלואורסצנטי ופנוטיפינג גנטי לאפיון וריאנטים הקשורים למחלות לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק פרויקט מחקר של המכונים הקנדיים לבריאות (T.W.C.) ומענקי תגלית של המועצה למחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (T.W.C.).

<ol><li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+methods+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Genome editing methods in animal models.</a> Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+genome+editing+technology+in+animal+disease+modeling+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+data%3A+Zebrafish+as+a+model+for+cardiovascular+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease.</a> Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kegel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+using+zebrafish+to+identify+new+genes+involved+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Oligodendrocytes%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination.</a> Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>González-Rosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+cardiac+disease%3A+From+fortuitous+mutants+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine.</a> Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).</li>
<li>Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+editing+of+the+Zebrafish+genome+made+simple+and+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient.</a> Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).</li>
<li>Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+CRISPR%2FCas9-based+knock-in+approaches+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish.</a> Methods. 121-122, 77-85 (2017).</li>
<li>Armstrong, G. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+directed+knockin+of+point+mutations+in+the+zebrafish+tardbp+and+fus+genes+in+ALS+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).</li>
<li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+modification+by+a+long+ssDNA+template+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish.</a> BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).</li>
<li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+zebrafish+models+for+inherited+disorders+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).</li>
<li>Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+zebrafish+knock-in+reporter+lines+in+the+nefma+gene+by+Cas9-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination.</a> Genesis. 58 (1), 23340(2020).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).</li>
<li>Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+tagging+in+zebrafish+facilitated+by+insertion+into+non-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions.</a> Development. 148 (19), (2021).</li>
<li>Prykhozhij, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+knock-in+of+point+mutations+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Boel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+homology-directed+repair+by+ssODNs+in+zebrafish+induces+complex+mutational+patterns+resulting+from+genomic+integration+of+repair-template+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Tessadori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+CRISPR%2FCas9-based+nucleotide+editing+in+zebrafish+to+model+human+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+generating+somatic+point+mutations+with+germline+transmission+in+the+zebrafish+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).</li>
<li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels. 10 (2), 101-110 (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+3.+E.15%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+1%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+KCNH2+gene+mutations+of+type+2+long+QT+syndrome+in+larval+zebrafish+using+microscopy+and+electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography.</a> Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).</li>
<li>Dhillon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+embryonic+and+larval+ECG+measurement+in+zebrafish+for+quantifying+the+effect+of+QT+prolonging+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs.</a> PLoS One. 8 (4), 60552(2013).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+cardiac+conduction+phenotypes+in+developing+zebrafish+larvae%3A+Implications+to+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity.</a> Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).</li>
<li>Hurst, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+optimization+of+tools+for+embryonic+electrocardiograph+recording+for+heart+dysfunction+in+zebrafish%22">Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish</a>. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).</li>
<li>Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+express+an+orthologue+of+HERG+and+are+sensitive+toward+a+range+of+QT-prolonging+drugs+inducing+severe+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).</li>
<li>MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%3A+In+vivo+screening+in+the+zebrafish+to+overcome+complexity+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

ההנדסה של עריכות גנים מדויקות באמצעות CRISPR-Cas9 מאותגרת על ידי היעילות הנמוכה של מנגנוני HDR והזיהוי היעיל שלהם. כאן מתוארת גישה להחלפת אקסון דו-sgRNA המבוססת על CRISPR-Cas9 שמייצרת עריכות מדויקות בדגי זברה עם זיהוי חזותי פשוט של עריכות חיוביות. היעילות של גישה זו מודגמת על ידי יצירת עריכות מדויקות בגן zkcnh6a . מאמר זה מראה כיצד ניתן להעריך את תפקוד הלב בזחלי דגי זברה שעברו עריכה גנטית באמצעות מדדים פנוטיפיים לא פולשניים של קצב הלב, ממדי קרום הלב ומורפולוגיה של אק"ג. גישה זו, החל מהכנסת עריכת גנים ועד להערכה ...

אסטרטגיות עריכת גנים מבוססות קריספר במודלים של בעלי חיים מאפשרות לחקור מחלות, התפתחות וטוקסיקולוגיה תורשתיות גנטית ברמת האורגניזם השלם 1,2,3. דגי זברה מספקים מודל רב עוצמה הקרוב יותר בהיבטים פיזיולוגיים רבים לבני אדם מאשר מודלים של תאים שמקורם בבני אדם4. מגוון רחב של כלים ואסטרטגיות גנטיות שימשו בדגי זברה הן לבדיקה גנטית קדימה5 והן לבדיקה גנטית הפוכה6. מיפוי גנטי מקיף וביאור בדגי זברה סייעו לגישות לעריכת גנים כטכניקה עיקרית להנדסת נוקאאוטים של גנים ממוקדים (KOs) ודפיקות מדויקות (KIs)7.
למרות זאת, יצירת עריכות KI מדויקות בדגי זברה מוגבלת על ידי יעילות נמוכה והקושי בזיהוי מדויק. למרות שנוקלאזות משפיעות דמויות גורם שעתוק (TALENs) שימשו בהצלחה ואופטימיזציה עבור KIs8, קריספר מספק אסטרטגיית עריכת גנים משופרת עם מיקוד sgRNA פשוט יותר. מחקרים רבים השתמשו בקריספר כדי ליצור KIs מדויקים בדגי זברה 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, אם כי עריכות אלה שנוצרו באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה בתיווך קריספר (HDR) נוטות להיות לא יעילות עם הצלחה פנימית נמוכה שיעורים הדורשים גנוטיפ כמסך ראשי 9,10,14,21. זה מדגים את הצורך במערכת KI CRISPR יעילה בדגי זברה, כמו גם במערכת אמינה בעלת תפוקה גבוהה לאיתור עריכות מדויקות.
מטרת המחקר הייתה לתאר פלטפורמה ליצירת גן לב מדויק KI בלבבות דגי זברה עם זיהוי פשוט ותפוקה גבוהה של עריכות מוצלחות. מתוארת גישת החלפת אקסון דו-sgRNA מבוססת CRISPR-Cas9, המבוססת על גישת TALEN8. גישה זו כוללת כריתה של רצף המטרה באמצעות מדריכי שני sgRNA והחלפה ברצף תבניות אקסוגני המכיל את ה-KI המעניין וכן גן כתב פנימי מקודד גנטית (איור 1). השילוב של כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית בתוך הרצף הפנימי של גן המטרה מאפשר זיהוי יעיל של עריכות חיוביות. לאחר מכן מתוארת פלטפורמה פנוטיפית להערכת התפקוד החשמלי של הלב בזחלים של דגי זברה לצורך אפיון לא פולשני של גרסאות הגנים הקשורות ל-LQTS תורשתי, הפרעה חשמלית לבבית הגורמת לאנשים למוות לבבי פתאומי.
גישות אלה ישפרו את הגישה והשימוש בעריכות גנים של דגי זברה KI כדי ליצור מודלים של מחלות תורשתיות ולתת מענה לשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, כגון מיפוי דפוסי ביטוי גנים וויסות התפתחותי. מאחר שלבבות דגי זברה מקבילים טוב יותר למאפיינים אלקטרופיזיולוגיים של הלב האנושי מאשר מודלים של מורין, הם עשויים להיות אטרקטיביים במיוחד כמערכת הניתנת למתיחה גנטית עבור מודלים של מחלות לב 7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastructure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>המכון</td><td></td><td></td>האירופי לביואינפורמטיקה</tr><tr><td>ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מנהל</td><td>קוד פתוח (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>ניו אינגלנד Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחת</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 מ"מ צלחת פטרי</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 מצלמה</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermal</td><td>Cycler Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל EZNA</td> ערכת תמלול <td>אומגה ביוטק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000 חממה</td><td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 ערכת תמלול אולטרה</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 ספקטרופוטומטר</td><td>ערכת טיהור Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjector</td><td>מכשיר הרווארד PowerPac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח בסיסי</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 סטרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רחב מיני תת תא GT מערכת אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Zebrafish דיור מערכת</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequencing</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta; תאים מוכשרים</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR מאגר</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ תערובת נוקלאוטידים</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI אנדונוקלאז עם מאגר</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI אנדונוקלאז עם מאגר</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 פלסמיד (XL1 דקירה אגר חיידקית כחולה)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI אנדונוקלאז עם חוצץ</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII אנדונוקלאז עם מאגר</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 פלסמיד (XL1 כחול דקירה חיידקית אגר</td>) <td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (טריקאין)</td> <td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 פלסמיד (DH5 ואלפא; דקירה אגר חיידקית)</td> <td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI אנדונוקלאז עם חוצץ</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI אנדונוקלאז עם חוצץ</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ליגאז עם מאגר</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טאק פולימראז</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE מאגר</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI אנדונוקלאז עם מאגר</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספק</td> <td>רכיבי</td> <td>פתרון</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ חישול (pH 7.5-8.0)</td><td>10 מ"מ Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 מ"מ NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 מ"מ EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 מדיה (pH 7.2)</td><td>5 מ"מ NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.17 מ"מ KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 מ"מ CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 מ"מ מאגר הזרקת MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>(pH 7.5)20</td> <td>מ"מ HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 מ"מ KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR) מקובצות באופן קבוע במודלים של בעלי חיים מאפשרות מניפולציה גנטית מדויקת לחקר תופעות פיזיולוגיות. דגי זברה שימשו כמודל גנטי יעיל לחקר שאלות רבות הקשורות למחלות תורשתיות, התפתחות וטוקסיקולוגיה ברמת האיברים והאורגניזמים. הודות לגנום של דגי הזברה המבוארים והממופים היטב, פותחו כלים רבים לעריכת גנים. עם זאת, היעילות של יצירה וקלות של זיהוי עריכות מדויקות באמצעות קריספר היא גורם מגביל. המתוארת כאן היא גישת knock-in מבוססת CRISPR-Cas9 עם זיהוי פשוט של עריכות מדויקות בגן האחראי על רה-פולריזציה של הלב וקשור להפרעה החשמלית, תסמונת Long QT (LQTS). גישת RNA (sgRNA) דו-מנחה זו מכניסה ומחליפה את רצף המטרה ומקשרת בין גן מדווח המקודד גנטית. התועלת של גישה זו מודגמת על ידי תיאור מדידות פנוטיפיות לא פולשניות של תפקוד חשמלי לבבי בזחלים מסוג בר ודגי זברה שעברו עריכה גנטית. גישה זו מאפשרת מחקר יעיל של גרסאות הקשורות למחלות באורגניזם שלם. יתר על כן, אסטרטגיה זו מציעה אפשרויות להחדרת רצפים אקסוגניים של בחירה, כגון גנים מדווחים, אורתולוגים או עורכי גנים.

השימוש המוצלח בגישת הקריספר להחלפת אקסון דו-sgRNA מודגש על ידי הקדמה וזיהוי פשוט של עריכה מדויקת כדי להנדס את הגרסה הקשורה ל-LQTS, R56Q, בגן zkcnh6a בדגי זברה. איור 6 מראה זחלי 3 dpf מייצגים שהוזרקו בשלב העובר החד-תאי עם רכיבי קריספר כפי שתואר לעיל. איור 6A מראה את נוכחות ביטוי הגנים של כתב YFP mVenus בעדשת העין כדיווח חיובי של שילוב תבניות מוצלח. איור 6B,C מראה את הכרומטוגרמות של ריצוף סנגר המתקבלות מדנ"א גנומי שבודד מדגימ...

פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

הפרוטוקול שלנו מספק צינור הן לאינטגרציה מדויקת והן לזיהוי חזותי פשוט של עריכות קריספר, כמו גם דוגמה לפנוטיפ שלאחר העריכה. היתרון העיקרי של גישה זו הוא קלות זיהוי עריכות קריספר, המאפשרת זיהוי יעיל ופשוט של עריכות מוצלחות. גישה זו מאפשרת יצירה ואפיון פשוטים של וריאנטים הקשורים למחלות בדגי זברה.כאן, אנו בוחנים תסמונת QT ארוכה. לאחר מכן ניתן לבחון מחקרי מעקב אחר טיפולים תרופתיים. התחילו בתכנון שני מדריכי sgRNA כדי לכרות את רצף אתרי המטרה על ידי זיהוי אורתולוג דגי הזברה עבור הגן המעניין.השתמש ב- Ensembl כדי לאתר את אתר המטרה בתוך רצף הגנים המעניינים, כולל רצף שני הקילו-בסיסים המשמש ליצירת התבנית. השתמש בכלי תוכנה לעיצוב כגון CRISPOR ובחר מינים של Danio rerio ואנזים Cas. עבור גישת שתי ה-sgRNA, בחר sgRNA אחד לפני אקסון המטרה ו-sgRNA שני בתוך האינטרון המיידי במורד הזרם.ודא של-sgRNAs שנבחרו יש ספציפיות גבוהה ואיגוד חזוי נמוך מחוץ למטרה. השתמש בדירוגי CRISPOR כדי לזהות מדריכים עם כריכה מינימלית מחוץ ליעד. כעת זהה את האתרים הפוטנציאליים הסבירים ביותר מחוץ למטרה עבור גנוטיפ ריצוף סנגר מבוסס PCR.לאחר בחירת שני ה-sgRNA, מקבלים את המשלים ההפוך עבור כל אחד מהם, שני אוליגוסים משלימים שקודמים למוטציה ושני אוליגוסים משלימים במורד הזרם של המוטציה. הוסף אתרי הגבלה תואמים על כל אוליגו כדי לשלב את המדריך בפלסמיד המועדף. לשילוב רצפי המדריכים שנבחרו בפלסמיד DR274, צור שלוחה באמצעות אתר הגבלה של חמישה ראשי BSA1 והנדס את אתרי הזיהוי של BSA1 בחמשת הקצוות הראשוניים של המדריכים.לאחר מכן, עצבו את התבנית האקסוגנית ל-HDR בדגי זברה על ידי בחירת שני שברי רצף שיאגפו את הגן הכתב הוורידי של ה-YFP השוכן בפלסמיד PKHR5. חלק את התבנית לשני מקטעים כדי להוסיף אותה משני צדי הגן כתב YFP ורידי M. ודא שהאתר המפוצל נמצא באינטרון כדי להימנע מחיתוך רצף הקידוד.שלב את כל השינויים הנדרשים המוזכרים בכתב היד כדי להקל על השיבוט לתוך פלסמיד PKHR5. להזריק את העוברים בשלב של תא אחד בערך 40 דקות לאחר ההפריה. לאחר שלושה ימים של הפריה, מרדימים זחלי דגי זברה על ידי העברתם לצלחת פטרי בקוטר 25 מילימטר המכילה 0.3% MS222 עד שהם מאבדים את רפלקס ההצדקה העצמית שלהם.לאחר ההרדמה, מעבירים את הזחל לבאר של צלחת בת 24 בארות. באמצעות מיקרוסקופ המסוגל לזהות GFP או YFP, לסנן פלואורסצנטיות של גנים מדווחים בעיני הזחל. לאחר לכידת התמונות של הזחל, לתעד את נוכחותו או היעדרו של ביטוי הגן המדווח.כדי לאשר עריכת גנים מדויקת ומדויקת של HDR, בצע גנוטיפ על ידי הרדמה ראשונה של הזחל שלושה ימים לאחר ההפריה כפי שהוכח קודם לכן ובידוד הדנ"א הגנומי מקליפס הזנב בשיטת hotshot. מוסיפים את קליפס הזנב שנכרת ל-15 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי 25 מילימולרי ומדגרים אותו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז מנטרלים עם 1.5 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית. צנטריפוגה ב 13, 800 פעמים G במשך 30 שניות, ולשמור על supernatant המכיל את הדנ"א הגנומי שחולץ.לשחזר את הזחל בתקשורת E3 ולהחזיר אותו למערכת הדיור אם המחקר הנוסף מיועד. באמצעות הדנ"א הגנומי המופק כתבנית, בצע ריצוף סנגר מבוסס PCR של אתרים פוטנציאליים מחוץ למטרה. ודא שתכנון הפריימר על המטרה לוכד את אתר המוטציה ואת אתר קשירת ה- sgRNA הקרוב ביותר.תכנן פריימר ריצוף נפרד כדי לזהות את המעבר מזרוע ההומולוגיה שהוכנסה ומגן המטרה כדי לאשר את האינטגרציה לגן המעניין. עצבו פריימרים כדי לרצף את שלושת האתרים הפוטנציאליים המובילים מחוץ ליעד. בצע הידור גנוטיפ על המטרה ומחוצה לה, קצב לב, ממדים קרום הלב, פנוטיפ א.ק.ג. ונתוני גנים מדווחים הניתנים לזיהוי עבור כל דג זברה.ביטוי הגנים הוורידי YFP M נצפה באיים, ומתנהג ככתב חיובי של אינטגרציה מוצלחת של תבניות. נמצאו דגים חיוביים לגנים בעלי עריכה מדויקת של G2A אשר מציגה את גרסת R56Q לתוך ZKCNH6A. המדידה של מידות קרום הלב כיחס של אזור העין מוצגת כאן.מגמה של ברדיקרדיה עם בצקת קרום הלב הולכת וגוברת הקשורה להפרעות של רפולריזציה לבבית בדגי זברה נצפתה בזחלים ערוכים בגן R56Q. רישום א.ק.ג. מלב זחל דג זברה שלושה ימים לאחר ההפריה מוצג כאן. ההיבט החשוב ביותר של גישה זו הוא עיצוב מדריך, כפי שקורה לעתים קרובות בהליכי קריספר.מדריכים יעילים חיוניים לעריכות קריספר מוצלחות. ניתן לעקוב אחר שיטות קריספר חלופיות המאפשרות דיוק רב יותר או פונקציות אחרות. בנוסף, ניתן להחדיר גנים גדולים כגון קומפלקס עריכה ראשוני המספק מערכת עריכה inducible in vivo.

crispr-cas9-mediated-precise-knock-in-edits-in-zebrafish-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למד עריכת CRISPR-Cas9 מדויקת בדגי זברה לחקר תסמונת QT ארוכה. השיטה משלבת זיהוי פלואורסצנטי ופנוטיפינג גנטי לאפיון וריאנטים הקשורים למחלות לב.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

גלה סרטונים נוספים