Name: הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: למדו להעריך תפוקת תרכובות בלוח TLC באמצעות תאורת LED כחולה. שיטה זו בטוחה, יעילה וזולה, ומאפשרת מדידה סימולטנית של מספר דגימות בביוכימיה ובכימיה של מוצרים טבעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).

הפרוטוקול הנוכחי מתואר באמצעות lovastatin כדוגמה. לובסטטין הופק מאספרגילוס טראוס בן שבוע.
1. מיצוי תרכובת
הערה: לפרטים על מיצוי תרכובת, ראו איור 1.
<ol><li>תרבית אספרגילוס טראוס על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA, ראו טבלת חומרים) בינונית ב-30 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ייבשו את התרבית בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העבירו את התרבית המיובשת לצינור של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת והוסיפו 15 מ"ל אתיל אצטט.</li>
	<li>נערו את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך דקה אחת ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד.</li>
	<li>סוניקו את התערובת באמצעות אמבט אולטראסוני של 40 קילוהרץ (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 40°C למשך שעה אחת.</li>
	<li>סובבו את התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וסננו באמצעות נייר סינון של 11 מיקרומטר.</li>
	<li>מוציאים את התסנין בנפח שווה של מים סטריליים במשפך מפריד.</li>
	<li>לאחר הפרדת פאזה, אספו את השכבה האורגנית, ולאחר מכן התאדו במאייד סיבובי (ראו טבלת חומרים). ממיסים את השאריות ב-2 מ"ל של אתיל אצטט.</li>
</ol>2. הפרדת התמצית הגולמית לפי עמודת ספיחה בפאזה רגילה (NP)
<ol><li>ארזו את העמודה עם ג'ל סיליקה NP כפאזה נייחת, והשתמשו ב-n-הקסאן:אתיל אצטט:חומצה טריפלואורואצטית (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) כשלב הנייד.</li>
	<li>טען 2 מ"ל של התמצית (שלב 1) על העמודה והוסף את ממס הפאזה הנייד בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה כדי לחמוק מהתמצית. הערה: קצב הזרימה נשלט באופן ידני באמצעות stopcock.</li>
	<li>אמת את השפכים על ידי TLC כדי לאשר את נוכחותו של lovastatin, ולאחר מכן להתאדות במאייד סיבובי ב 45 מעלות צלזיוס עד שהממס מוסר. צעד זה אורך כ-20-25 דקות.</li>
	<li>ממיסים את השאריות ב-1 מ"ל של אתיל אצטט, ואז מערבבים עם נפח שווה של 1% חומצה טריפלואורואצטית.</li>
	<li>צנטריפוגות התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואוספים את השכבה האורגנית בצינור זכוכית חדש.</li>
</ol>3. הכנה וטעינה של לוחות כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC)
<ol><li>יש לזהות 5 μL של דגימות ותקני לובסטטין (ראו טבלת חומרים) על קו הבסיס של לוח TLC באמצעות פיפטה נימית, ולהשאיר גבול של 1 ס"מ בצידי לוח TLC.</li>
	<li>יבשו את צלחת ה- TLC במכסה אדים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הניחו את הצלחת בעדינות על ידי מלקחיים בתא זכוכית רוויה המכיל את ממס הפאזה הנייד. מכסים את התא במכסה זכוכית ומאפשרים לצלחת להתפתח במלואה.</li>
	<li>הסר את הצלחת מהתא כאשר קו הממס מגיע ל -1 ס"מ מראש הצלחת.</li>
</ol>4. ניתוח על ידי תאורת ה- LED הכחולה
<ol><li>סמן את קו הממס בעיפרון. יבשו את הצלחת במכסה האדים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הייבוש, יש להשרות מיד את הצלחת בממס 10% H2SO4 , ולאחר מכן לייבש במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מניחים את הצלחת על לוח החימום עד להופעת הכתמים החומים. ודא שהצלחת אינה מחוממת יתר על המידה, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הדמיה של לובסטטין.</li>
	<li>העבירו את הלוחית לתאורת ה-LED הכחולה וסרקו באמצעות תוכנה חופשית תואמת (MiBio Fluo) (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>5. הערכת תשואה לפי מודל הרגרסיה
<ol><li>מדוד את ממד הפסים באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>צור מודל רגרסיה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים (ראה טבלת חומרים) המבוססת על הריכוזים היורדים של תקני לובסטטין, כולל 1 מ"ג/מ"ל, 0.75 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל ו-0.25 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>החל את מודל הרגרסיה כדי להעריך את התשואה של הדגימות.</li>
</ol>

<ol><li>Pyka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+progress+of+selected+drugs+in+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Detection progress of selected drugs in TLC.</a> BioMed Research International. 2014, 732078(2014).</li>
<li>Hess, A. V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+enhanced+thin-layer+chromatography%3A+An+inexpensive%2C+new+technique+for+qualitative+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis.</a> Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).</li>
<li>Ullah, Q., Mohammad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamins+determination+by+TLC%2FHPTLC-a+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Planar+Chromatography+-+Modern+TLC%22%5BJournal%5D)">Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review.</a> Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).</li>
<li>Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+identification+of+xanthine+oxidase+inhibitor+and+antioxidant+from+Erycibe+obtusifolia+by+a+drug+discovery+platform+composed+of+multiple+mass+spectrometric+platforms+and+thin-layer+chromatography+bioautography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography.</a> Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).</li>
<li>Duncan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+separations%3A+A+comparison+of+HPLC+and+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC.</a> Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).</li>
<li>Sherma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+in+food+and+agricultural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis.</a> Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).</li>
<li>Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+acetylsalicylic+acid+in+pharmaceutical+drugs+by+TLC+with+densitometric+detection+in+UV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV.</a> Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).</li>
<li>Poole, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+chromatography+at+the+turn+of+the+century%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Planar chromatography at the turn of the century.</a> Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).</li>
<li>Rapid Johnson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+quantitation+in+thin-layer+chromatography+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner.</a> Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).</li>
<li>El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+derivative+spectrophotometric%2C+TLC-densitometric%2C+and+HPLC+determination+of+acebutolol+HCL+in+presence+of+its+acid-induced+degradation+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).</li>
<li>Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+ion-pair+HPLC+and+TLC-densitometric+methods+for+the+simultaneous+determination+of+ciprofloxacin+hydrochloride+and+metronidazole+in+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets.</a> Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).</li>
<li>Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+TLC-densitometric+method+for+the+quantification+of+a+steroidal+drug%2C+danazol+in+its+pharmaceutical+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Planar+Chromatography+-+Modern+TLC%22%5BJournal%5D)">Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations.</a> Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

המחקר הנוכחי תיאר גישה חדשה, תאורת ה-LED הכחולה, לכמת תרכובות ללא שימוש בציוד יקר ומתמחה, כגון שיטת HPTLC, HPLC ו-GC, והשיטה הושוותה לשיטות הביו-אסאי וה-UV שזוהו כדי להעריך את ביצועי הכימות. כתוצאה מכך, הוסק כי שיטת התאורה הכחולה-LED היא פרוטוקול בטוח ויעיל יחסית המשמש לכימות התפוקה של תרכובות ממוקדות על צלחת TLC.
מחקרים קודמים דיווחו על מספר שיטות כמותיות ללא שימוש בציוד כמותי מיוחד, וכל המחקרים הראו כי דיוק הכמות היה קרוב לזה של השימוש בציוד מיוחד 2,9,10,11,12 (<...

כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) נמצאת בשימוש נרחב כטכניקה איכותית וכמותית בתחום הכימיה האורגנית 1,2,3. היתרונות העיקריים של TLC הם שהיא מספקת זיהוי מהיר, דרישות מדגם גמישות, ואינה דורשת ציוד מיוחד4. עד כה, למרות שגישות מתקדמות רבות הוקמו, TLC היא עדיין השיטה העיקרית לזיהוי דגימות לא ידועות בתערובת. עם זאת, האתגר של גישה זו הוא היעדר ציוד בטוח וזול לכימות תפוקת הדגימה, במיוחד לפיתוח מעבדות עם תקציבים מוגבלים. המחקר הנוכחי, אם כן, נועד לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה בשילוב עם TLC כדי להעריך את התשואה של הדגימות.
שלא כמו TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיית גז (GC) עם דרישות דגימה מחמירות, זמן רב ומעורבות של multistep להכנת דגימה 1,5, TLC הראה מספר יתרונות. ראשית, לצורך הכנת הדגימה, HPLC ו- GC אינם יכולים לזהות את התמצית הגולמית מכיוון שהתמצית הגולמית עשויה לחבר את העמודה של HPLC ו- GC. שנית, כאשר הדגימות אינן מתאימות ל- UV (חשוב לניתוח HPLC) או עם תנודתיות נמוכה (חשוב לניתוח GC), ניתן להחיל TLC על דגימות אלה, והשימוש במגיב הדמיה הופך את הדגימות המבודדות לגלויות על שכבות דקות 6,7,8. שלישית, עבור משתמשים כלליים, HPLC ו- GC דורשים בדרך כלל זמן רב יחסית לפני שהם עובדים באופן עצמאי, בהשוואה ל- TLC. בנוסף, ניתוח TLC כמותי, המכונה TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), יכול להפוך את המידע על לוח TLC לדיגיטלי באמצעות סורק רגיש במיוחד. עם זאת, העלות של מערכת HPTLC הוא יקר יחסית. ככזה, פיתוח גישה חסכונית ומהירה לכימות דגימות על צלחת TLC הוא נושא חשוב.
שיטות דומות פותחו לכימות תפוקת TLC; לדוגמה, Johnson9 דיווח על טכניקה המאפשרת לכמת את הדגימות על צלחת TLC באמצעות סורק שטוח המחובר למחשב. בשנת 2001, El-Gindy et al.10 פיתחו את השיטה TLC- densitometric, אשר שימשה לאיתור התרכובת עם צפיפות אופטית, והטכניקה יושמה גם על ידי Elkady et al.11. בשנת 2007, הס2 הציג את שיטת ה-TELC (DE-TLC) המשופרת דיגיטלית המיושמת כדי לזהות את התפוקה של תרכובת על צלחת TLC באמצעות מצלמה דיגיטלית בשילוב עם אור UV. הס גם השווה את הבדלי העלויות בין שיטת HPTLC לשיטת DE-TLC והגיע למסקנה כי ניתן להשתמש בשיטת DE-TLC במעבדות תיכון ומכללות בגלל עלותה הזולה2. עם זאת, העלות של שיטת TLC-densitometric עדיין הייתה יקרה, והפעלת אור אולטרה סגול דורשת הכשרה מקדימה מספקת למקרה שהמשתמשים עלולים להיחשף לקרינה אולטרה סגולה. לכן, בהתאם ל- TLC, רצוי לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה לכימות תפוקת המדגם.
המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול לגילוי הדגימה על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה, ופיתח מודל רגרסיה עם אמינות גבוהה (ערך ריבועי R גבוה) כדי למדוד את מידות הפסים ולאחר מכן לקבוע את התפוקה המורכבת. לבסוף, נמצא כי שיטת התאורה blue-LED היא בטוחה יחסית (לעומת שיטת גילוי UV), זולה (לעומת. GC, HPLC ו-HPTLC), וגישה יעילה (לעומת שיטת bioassay) לכימות תשואה.

<table><tbody><tr><td>אגר קונדלב בקטריולוגי אמריקאי</td><td></td><td>1802.00</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus terreus&nbsp; </td><td></td><td>ATCC 20542</td><td></td></tr><tr><td>תאורת LED כחולה</td><td>MICROTEK</td><td>Bio-1000F</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו מדעית&nbsp;</td><td>HERAEUS Megafuge 8</td><td></td></tr><tr><td>מנורת UV קומפקטית</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>MACRON</td><td>MA-H078-10</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון 125 מ"מ</td><td>ADVANTEC</td><td>60311102</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>תוכנה חופשית</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>לובסטטין תקן</td><td>ACROS</td><td>A0404262</td><td></td></tr><tr><td>MiBio פלואו&nbsp;</td><td>MICROTEK</td><td>V1.04</td><td></td></tr><tr><td>n-הקסאן</td><td>C-ECHO</td><td>HH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab</td><td>9.1</td><td>https://www.originlab.com/origin</td></tr><tr><td>מרק דקסטרוז תפוחי אדמה H</td><td>STBIO MEDIA</td><td></td><td></td></tr> 110533 <tr><td>מאייד סיבובי</td><td>EYELA</td><td>SB-1000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>Fluka</td><td>30743-2.5L-GL</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל סיליקה TLC 60 F254</td><td>MERCK</td><td>1.05554.0001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>Alfa Aesar</td><td>10229873</td><td></td></tr><tr><td>מכונת רטט אולטרסאונד</td><td>DELTA</td><td>DC600</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת התפוקה של תרכובות על לוח tlc באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-led

Estimating the Yield of Compounds on the TLC Plate via the Blue-LED Illumination Technique

כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) היא טכניקה אנליטית נגישה שנעשה בה שימוש נרחב במחקר בכימיה אורגנית כדי לכמת את התשואה של דגימות לא ידועות. המחקר הנוכחי פיתח שיטה יעילה, זולה ובטוחה להעריך את תפוקת הדגימות על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה. לובסטטין שהופק מאספרגילוס טראוס היה התרכובת לדוגמה ששימשה במחקר הנוכחי. מודלים של רגרסיה המבוססים על תקן lovastatin שימשו להערכת התשואה של lovastatin. הושוו שלוש שיטות: ביו-אסאי, גילוי UV ותאורת LED כחולה. התוצאה הראתה כי שיטת התאורה blue-LED יעילה הרבה יותר בזמן מאשר שיטות זיהוי UV ובדיקת ביולוגיה. בנוסף, תאורת ה-LED הכחולה הייתה אופציה בטוחה יחסית בגלל החשש מסכנות ביולוגיות בשיטת הביו-אסאי (למשל, זיהום מיקרוביאלי) וחשיפה לקרינה אולטרה סגולה בשיטת גילוי ה-UV. בהשוואה לשיטות היקרות הדורשות מכשירים מיוחדים והכשרה ארוכת טווח לפני עבודה עצמאית, כגון GC, HPLC ו- HPTLC, השימוש בתאורת Blue-LED היה אפשרות חסכונית להעריך את תפוקת הדגימות מצלחת TLC.

מחקר זה הציג את שיטת תאורת ה-LED הכחולה כדי להעריך את תפוקת התרכובות, ושיטה זו אומתה והושוותה לשיטות ביו-אסאי ו-UV שזוהו (טבלה 1). מודלי הרגרסיה פותחו על בסיס ממדי הפסים וריכוז התקנים לשלוש שיטות, בהתאמה, כדי לחזות את תפוקת הדגימות. ראשית, בתוצאות שיטת הביו-אסאי, ריבוע ה-R בין ממדי אזור העיכוב לתקני לובסטטין היה 0.99, ותפוקת הדגימה הייתה 0.56 מ"ג שנחזתה על ידי מודל הרגרסיה (איור 2). שנית, בשיטת גילוי UV, ריבוע ה-R בין תקני הלובסטטין לבין ממד הפסים על לוחית ה-TLC היה 0.97, ות...

הפרוטוקול הנוכחי פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של גישה זו הם שהיא בטוחה, יעילה, זולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית.

הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED

Thin-layer chromatography (TLC) is an accessible analytical technique that has been extensively used in organic chemistry research to quantify the yield ...

פרוטוקול זה פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של שיטה זו הם שטכניקת התאורה blue-LED היא שיטה בטוחה, יעילה וזולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על ביוכימיה וכימיה של מוצרים טבעיים.כדי להתחיל, לייבש את התרבות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מעבירים את התרבית המיובשת לצינור של 50 מיליליטר באמצעות פינצטה מעוקרת ומוסיפים 15 מיליליטר של אתיל אצטט. מנערים את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך דקה אחת ודוגרים את הצינור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.לאחר מכן sonicate את התערובת באמצעות 40 קילוהרץ אמבטיה קולית ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, צנטריפוגה תערובת ב 5, 000 גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לסנן דרך נייר סינון 11 מיקרומטר. מוציאים את התסנין בנפח שווה של מים סטריליים במשפך מפריד.לאחר הפרדת פאזה, לאסוף את השכבה האורגנית, להתאדות אותו במאייד סיבובי, ולהמיס את השאריות בשני מיליליטר של אתיל אצטט. ארזו את העמודה עם ג'ל סיליקה פאזה רגילה כפאזה נייחת, והשתמשו ב-n-הקסאן אתיל אצטט וחומצה טריפלואורואצטית כפאזה הניידת. העמיסו שני מיליליטר של התמצית על העמודה והוסיפו את ממס הפאזה הנייד בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה כדי להחליק את התמצית.לאחר אימות הקולחים על ידי TLC כדי לאשר את נוכחותו של lovastatin, להתאדות במאייד סיבובי ב 45 מעלות צלזיוס עד שהממס מוסר. ממיסים את השאריות במיליליטר אחד של אתיל אצטט ואז מערבבים עם נפח שווה של 1% חומצה טריפלואורואצטית. צנטריפוגה תערובת ב 5, 000 גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאסוף את השכבה האורגנית בצינור זכוכית חדש.באמצעות פיפטה נימית מזהים חמישה מיקרוליטרים של דגימות ותקני לובסטטין על קו הבסיס של צלחת TLC, ומשאירים גבול של סנטימטר אחד בצידי לוח TLC. לאחר מכן יבשו את צלחת ה-TLC במכסה אדים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את הצלחת בעדינות על ידי מלקחיים בתא זכוכית רוויה המכיל את ממס הפאזה הנייד.מכסים את התא במכסה זכוכית ומאפשרים לצלחת להתפתח במלואה. הסר את הצלחת מהתא כאשר קו הממסים מגיע לסנטימטר אחד מראש הצלחת. מסמנים בעיפרון את קו הממס ומייבשים את הצלחת במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הייבוש, יש להשרות מיד את הצלחת בממס 10% חומצה גופרתית, ולאחר מכן לייבש במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצלחת על לוח החימום עד להופעת הכתמים החומים. העבר את הצלחת לתאורת ה-LED הכחולה וסרוק באמצעות תוכנה חופשית תואמת.התוצאות שהתקבלו משיטת הביו-אסאי הראו כי ריבוע R בין ממדי אזור העיכוב לתקני לובסטטין היה 0.99, ותפוקת המדגם הייתה 0.56 מיליגרם כפי שנחזה על ידי מודל הרגרסיה. שיטת זיהוי UV מראה כי ריבוע R בין תקני lovastatin לבין ממד הפסים על לוח TLC היה 0.97, ותפוקת הדגימה שנחזתה על ידי מודל הרגרסיה הייתה 0.53 מיליגרם. עם זאת, קצוות הלהקה היו מטושטשים ונצפו פסים בעוצמת אות נמוכה יחסית.עבור שיטת התאורה הכחולה-LED, ריבוע R בין תקני לובסטטין לבין ממד הפס בלוח TLC היה 0.98, ותפוקת הדגימה הייתה 0.54 מיליגרם כפי שנחזה על ידי מודל הרגרסיה. התפוקה החזויה באמצעות תאורת ה-LED הכחולה הייתה קרובה יותר לשיטת הביו-אסאי והתקבלו פסים ברורים. אם הצלחת מחוממת יתר על המידה, ההדמיה של lovastatin עשוי להיות קשה לצפייה.

estimating-yield-compounds-on-tlc-plate-via-blue-led-illumination

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

סרטון זה מדגים בדיקת אנזים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי לקבוע את פעילות פירופוספוקינאז באמצעות נוקלאוטידים בעלי תווית רדיו. השיטה מספקת תובנות לגבי סינתזת נוקלאוטידים ותגובות פוספוטרנספורט.

בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

הנגזרת של פלברול היא חיונית ליישומו בתחום הבריאות ותעשיית המזון. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יוסינטזה של פלאורול מן flavanone ולדון את הצעדים הקריטיים ואת יתרונותיה על פני גישות אחרות.

ביוסינתזה של פלאנונול מתוך Flavanone על ידי הקמת מדורגת ביאנזיטית בסיר אחד

שיטה זו מתארת את השימוש במתודולוגיית תפוקה גבוהה חדשנית, המבוססת על תגובות כימיות טיפות, לאופטימיזציה מהירה וחסכונית של רדיופארמה באמצעות כמויות ננו-מול של ריאגנטים.

אופטימיזציה של תגובות רדיוכימיות באמצעות מערכי טיפות

כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

מאמר זה מפרט את ההליכים הכרוכים overexpression וניתוח של GTPases קטן בתאי האפיתל מקוטב באמצעות טכניקה microinjection.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

למדו להעריך תפוקת תרכובות בלוח TLC באמצעות תאורת LED כחולה. שיטה זו בטוחה, יעילה וזולה, ומאפשרת מדידה סימולטנית של מספר דגימות בביוכימיה ובכימיה של מוצרים טבעיים.

הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED

גלה סרטונים נוספים