Name: Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: למדו מיפוי פלואורסצנציה ביומטרי בדגימות ביולוגיות חיות באמצעות מודול אופטי מתקדם בטכנולוגיית TCSPC. שיטה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של ריכוז חמצן וחיים פוספורסצנטיים לחקר תהליכים ביולוגיים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית לעבודה זו מקרן המדע אירלנד, מענקי SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 ו-18/SP/3522, ומחקר סרטן פורץ דרך (אונקולוגיה מדויקת אירלנד) זוכה להכרת תודה.

כל ההליכים עם בעלי חיים בוצעו תחת אישורים שהונפקו על ידי הרשות הרגולטורית למוצרי בריאות (HPRA, אירלנד) בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית (2010/63/EU) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קולג 'קורק.
1. הכנת מדגם
<ol><li>מכתים עם בדיקה של דגימות רקמות חיות ex vivo<ol><li>עבור יישומי ex vivo , השתמש בדגימות רקמה מבודדות טריות מעכברות Balb/c בנות 4 שבועות.</li>
		<li>ביום הניסוי, הרדימו עכבר על ידי עריפת ראש, ונתחו במהירות שברים של המעי הגס, בגודל של כ -10 מ"מ. שטפו אותם מיד עם חיץ PBS, הניחו בתווך DMEM בתוספת חיץ Hepes של 10 mM (pH 7.2), ודגרו בטמפרטורה של37°C 36.</li>
		<li>עבור צביעת פני השטח של הצד הסרוסלי של המעי, להעביר את דגימות הרקמה החיה לתוך צלחת מיני, להחיל 2 מ"ל של DMEM מלא המכיל 1 מ"ג / מ"ל NanO2-IR בדיקה כדי לכסות את דגימות הרקמה, לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C. הערה: תאים ברקמה שלאחר המוות נשארים חיים במשך שעות רבות בתרבית. NaNO2-IR מראה ציטוטוקסיות מינורית, כך שכל הניסויים הושלמו תוך 4 שעות לאחר בידוד הרקמות.</li>
		<li>עבור צביעת רקמות עמוקות intraluminal ex vivo , להעביר את חתיכות המעי לצלחת פטרי יבש, ולהסיר כל DMEM עודף עם נייר סינון.</li>
		<li>הזריקו 1 μL של DMEM המכיל 1 מ"ג/מ"ל NanO2-IR 35 לתוך לומן עם מזרק המילטון, ודגרו על הדגימות במשך15 דקות או עד 4 שעות. הערה: NaNO2-IR מראה השפעות ציטוטוקסיות קלות לטווח ארוך; לכן, כל הניסויים צריכים להסתיים בתוך 4 שעות לאחר בידוד רקמות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת רקמת גידול מוכתמת בבעלי חיים<ol><li>עבור יישומי in vivo , תאי CT26 טרום כתמים למשך 18 שעות בתווך ללא סרום המכיל בדיקת NaNO2-IR במינון 0.05 מ"ג/מ"ל.</li>
		<li>קח עכבר, לגלח את אזור ההזרקה באגף הימני, ולהזריק עם מזרק 200 μL של תערובת של 1 × 10 5 תאים לא מוכתמים ו 1 × 105 תאים מוכתמים מראש עם NanO2-IR .</li>
		<li>לאפשר גידולים לגדול בעכברים, ניטור גודל הגידול עם קליפר ואת משקל החיה מעת לעת37. בעלי החיים עם גידולים מושתלים מוכנים להדמיה ביום השביעי לצמיחת הגידול. הערה: נפח הגידול חושב באמצעות משוואה (1): V = (L × W 2)/2 (1) כאשר L הוא קוטר הגידול, ו-W iהוא הקוטר בניצב לקוטר L.</li>
		<li>להקריב את בעלי החיים על ידי נקע צוואר הרחם ממש לפני ההדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הגדרת הדמיה של PLIM
<ol><li>קח את מתאם Cricket והסר את מתאם ההרכבה C בצד האחורי שלו כדי לקבל גישה לבית המניע שבתוכו. הכנס את משפר התמונה MCP-125 לתא זה, והחזיר את מתאם הרכבה C.</li>
	<li>הסר את מתאם הרכבה C בצד הקדמי של הצרצר, הכנס את מסנן הפליטה 760 ננומטר ± 50 ננומטר, ותקן אותו על-ידי החזרת תושבת C.</li>
	<li>חבר את מודול המצלמה Tpx3Cam לצד האחורי של מודול הקריקט באמצעות מתאם C-mount שלו</li>
	<li>חבר את העדשה לצד הקדמי של מודול הקריקט באמצעות מתאם הרכבה C.</li>
	<li>הרכיבו את כל מכלול המצלמה על גבי הקופסה השחורה האופטית, כשפניה כלפי מטה אל השלב שבו יצולמו הדגימות (איור 1).</li>
	<li>הרכיבו את נורית ה-LED הבהירה במיוחד בגודל 624 ננומטר על עמוד המחובר לקרש לחם בתוך הקופסה השחורה.</li>
	<li>חבר את נורית ה- LED לספק כוח וגנרטור פולסים. הפעל את נורית ה- LED, ומקד אותה כדי להבטיח עירור יעיל ואחיד של דגימות מצולמות.</li>
	<li>חברו את המצלמה למחולל פולסים אחר, וסנכרנו את הפולסים הנשלחים למצלמה ולנוריתה-LED 38.</li>
	<li>באמצעות הכבל והשקע המיוחדים ביחידת הקריקט, חבר את האינטנסיפייר לספק כוח סטנדרטי והגדר את הרווח ל- 2.7 V.</li>
	<li>באמצעות יכולות המיקוד של העדשה ומתאם הצרצרים, מקד את אופטיקת המצלמה על במת הדגימה כדי להפיק תמונות ברורות של דגימות עם ניגודיות ובהירות טובות.</li>
	<li>לשימוש במכונת הדמיה עם צבעי Pt-porphyrin, החלף את נורית ה-LED של 625 ננומטר בנורית LED של 390 ננומטר לעירור, והחלף את מסנן 760 ננומטר ± 50 ננומטר במסנן 650 ננומטר ± 50 ננומטר במודול Cricket.</li>
</ol>3. רכישת תמונות
<ol><li>הניחו את הדגימה מול עדשת המצלמה. הערה: השתמש בשלב מתכוונן x-y-z כמחזיק הדגימה כדי להתאים את מיקום הדגימה למיקוד טוב.</li>
	<li>כבו את כל האורות בחדר.</li>
	<li>הפעל את תוכנת Sophy לכוונון הפרמטרים התפעוליים, כגון מיקוד ויישור דגימה. הערה: תוכנת Sophy מסופקת יחד עם המצלמה כדי להגדיר את פרמטרי ההדמיה ולהקליט את הנתונים. ודא שהתוכנה מחוברת למצלמה על-ידי בדיקת קוד המצלמה. עם זאת, השתמשנו בתוכנית אחרת לרכישת נתונים.</li>
	<li>ב'מודולים', בחרו אינסוף מסגרות והגדירו את מצב הפעולה של הפיקסלים לזמן מעל הסף.</li>
	<li>במודולים, עבור אל תצוגה מקדימה ובחר מודול פעיל. פעולה זו פותחת את החלון Medpix/Timpix Frames.</li>
	<li>בחלון זה, שנו את סולם הצבעים וסובבו את התמונה לכיוון הרצוי.</li>
	<li>הפעל את האינטנסיפייר והתחל את ההקלטה. הערה: השתמש במסך ההקלטה של תוכנת Sophy כדי לאשר חזותית את היישור והמיקוד של הדגימה ולמטב את פרמטרי העירור LED להקלטה.</li>
	<li>עצור את ההקלטה וסגור את תוכנת Sophy.</li>
	<li>עבור אל המסוף והשתמש בתוכנה המותאמת אישית כדי לרכוש את הנתונים הגולמיים בפורמט הבינארי ולעבד אותם לאחר מכן (https://github.com/svihra/TimePix3).<ol><li>במסוף, הפעל את הפקודות הבאות כדי להקליט את הנתונים: מסמך CD/SPIDR/תא מטען/שחרור/ 
		 LS ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {שם הקובץ} - t {זמן רכישה} הערה: בעת הקלדת "ls", בדוק את רשימת הקבצים בספריה הנוכחית; אשר כי Tpx3daq נראה.</li>
		<li>המתן עד שכל המסגרות יוקלטו.</li>
		<li>כדי לעבד את הנתונים, הפעל את הפקודות הבאות במסוף: תקליטור מסמכים/עיבוד נתונים/Timepix3/Timepix3/ שורש . L dataprocess.cpp++ .x DRGUI. C</li>
		<li>המתן לפתיחת חלון RRGui . בחר את כל המשתנים משמאל ואת All Data, Single File ו - Centroid מימין.</li>
		<li>בחר את הקובץ לעיבוד והפעלה של מפחית הנתונים. הערה: כל הקבצים המעובדים יופיעו באותה תיקייה שבה נמצא הקובץ הגולמי.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>נתח את הנתונים שלאחר עיבוד באמצעות תוכנה ייעודית הכתובה בשפת C שתכתוב את הנתונים לקובץ תמונה .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).</li>
	<li>פתח את קובצי התמונה .ics באמצעות תוכנת Time Resolved Imaging הזמינה בחינם (ראה טבלת חומרים). השתמש בפונקציות דו-מעריכיות כדי להתאים לדעיכת הזרחן.</li>
	<li>פתח את .ics קובצי התמונה המותאמים באמצעות התוכנה הזמינה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>באמצעות טבלאות בדיקת מידע, צור תמונות לכל החיים של זרחן וקידוד שלהן בסקאלת פסאודו-צבעים (לדוגמה, צבע כחול לתקופות חיים קצרות ואדום לתקופות חיים ארוכות). השתמש בפונקציה Measure כדי לחשב את ערכי משך החיים הממוצע עבור התמונה כולה או אזורי עניין (ROI) ספציפיים.</li>
	<li>המרת ערכי החיים לריכוז החמצן באמצעות המשוואה המתקבלת מהתאמת כיול O2 של הגשושית36. הערה: משוואה (2) שימשה לעבודה זו: O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT (2)</li>
</ol>

<ol><li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li>
<li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter%3F+Small+molecules+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li>
<li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+C%3A+Photochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li>
<li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research%5BTitle%5D)+AND+%2217th+International+Meeting+on+Chemical+Sensors+-+IMCS%22%5BJournal%5D)">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li>
<li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li>
<li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li>
<li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li>
<li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Environmental%2C+Chemical%2C+and+Biological+Sensing+Technologies+XIV%22%5BJournal%5D)">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150(2017).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li>
<li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li>
<li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li>
<li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li>
<li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen%3A+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li>
<li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li>
<li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).</li>
<li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li>
<li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li>
<li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li>
<li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells%3A+An+ex+vivo+PLIM+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
<li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJenkins%2C+J+%22Advanced+Time-Correlated+Single+Photon+Counting+Applications%22">Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications</a>. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).</li>
<li>Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecker%2C+W+%22Multiphoton+Microscopy+and+Fluorescence+Lifetime+Imaging%3A+Applications+in+Biology+and+Medicine%22">Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine</a>. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).</li>
<li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems%3A+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800(2017).</li>
<li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+TCSPC%3A+Methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003(2017).</li>
<li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+%28TCSPC%29+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602(2014).</li>
<li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707(2017).</li>
<li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChelushkin%2C+PS+%22Progress+in+Photon+Science%3A+Emerging+New+Directions%22">Progress in Photon Science: Emerging New Directions</a>. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591(2020).</li>
<li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimepixCam%3A+A+fast+optical+imager+with+time-stamping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Instrumentation%22%5BJournal%5D)">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li>
<li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research%2C+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment.+937%22%5BJournal%5D)">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li>
<li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timepix3%3A+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA%2FToT+and+sparse+readout%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Instrumentation%22%5BJournal%5D)">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013(2014).</li>
<li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+TimepixCam%2C+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Instrumentation%22%5BJournal%5D)">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017(2017).</li>
<li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104(2017).</li>
<li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDR%3A+A+read-out+system+for+Medipix3+%26+Timepix3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Instrumentation%22%5BJournal%5D)">SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028(2015).</li>
<li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006(2020).</li>
<li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake%2C+manually+restrained+mouse+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li>
<li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).</li>
<li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

הפרוטוקולים לעיל נותנים תיאור מפורט של הרכבת ה- imager החדש ופעולתו במצב FLIM/PLIM של מיקרו-שנייה. מצלמת Tpx3Cam מהדור החדש מבוססת TCSPC, המשולבת באמצעות המתאם האופטו-מכני Cricket עם חיישן התמונה, מסנן הפליטה ועדשת המאקרו, מייצרת מודול אופטי יציב, קומפקטי וגמיש וקל לתפעול. ההדמיה הוכחה כבעלת ביצועים טובים עם מגוון דגימות שונות ומשימות אנליטיות, שכללו אפיון חומרים זרחניים והדמיית רקמות חיות O2 . בניסויי ההדמיה נעשה שימוש בבדיקה המסיסה המבוססת על אינפרא-אדום קרוב Pt(II)-benzoporphyrin, NanO2-IR, וחיישני מצב מוצק...

O 2 הוא אחד הפרמטרים הסביבתיים המרכזיים למערכות חיות, והידע על התפלגות O 2 והדינמיקה שלו חשוב למחקרים ביולוגיים רבים 1,2,3. הערכת חמצון רקמות באמצעות בדיקות זרחניות 4,5,6,7,8 ו- PLIM 9,10,11,12,13 צוברות פופולריות במחקר ביולוגי ורפואי 3,9,14,15,16, 17,18,19. הסיבה לכך היא ש- PLIM, בניגוד למדידות עוצמת פלואורסצנטיות או זרחן, אינו מושפע מגורמים חיצוניים כגון ריכוז הגשוש, הלבנה, עוצמת עירור, יישור אופטי, פיזור ואוטופלואורסצנציה.
עם זאת, פלטפורמות O2 PLIM הנוכחיות מוגבלות על ידי רגישותן, מהירות רכישת התמונה, דיוקן והשימושיות הכללית שלהן. ספירת פוטון בודד מתואמת זמן (TCSPC), בשילוב עם הליך סריקת רסטר, משמשת לעתים קרובות בהתקני PLIM ומיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי (FLIM)20,21,22. עם זאת, מכיוון ש- PLIM דורש זמן שהייה ארוך של פיקסלים (בטווח של אלפיות השנייה), זמן רכישת התמונה ארוך בהרבה ממה שנדרש עבור יישומי FLIM20,22,23. טכניקות אחרות, כגון מצלמות CCD/CMOS מגודרות, חסרות רגישות לפוטון יחיד ויש להן קצב פריימים נמוך20,24,25,26. יתר על כן, מערכות PLIM הקיימות משמשות בעיקר בפורמט מיקרוסקופי, בעוד מערכות מקרוסקופיות נפוצות פחות27.
מצלמת המאקרו PLIM28 מבוססת TCSPC הוקמה כדי להתגבר על רבות ממגבלות אלה. העיצוב של imager היה מאוד הקל על ידי השימוש של מתאם אופטו-מכני חדש, קריקט, אשר יש את הדברים הבאים: i) שני מתאמי C-mount, אשר מספקים צימוד קל של מודול המצלמה בצד האחורי עדשה אובייקטיבית בצד הקדמי; ii) בית פנימי עבור מזין תמונה ושקע חשמל עבור האחרון בצד החיצוני של הצרצר; iii) חלל פנימי מאחורי מתאם ההרכבה C הקדמי שבו ניתן לאחסן מסנן פליטה סטנדרטי של 25 מ"מ לפני המפעיל; ו-iv) אופטיקה מובנית המתנגשת באור עם וסתי טבעת, המאפשרים יישור/מיקוד אופטי בין העדשה למצלמה כדי להפיק תמונות חדות על שבב המצלמה.
במכונת ההדמיה המורכבת, מודול המצלמה מוצמד לצד האחורי של מתאם הקריקט, אשר מכיל גם מעצבן תמונה המורכב מפוטוקתודה ואחריה צלחת מיקרו-ערוצית (MCP), מגבר, ומנצנץ מהיר, זרחן P47. מסנן פליטה של 760 ננומטר ± 50 ננומטר מותקן בתוך הצרצר, ועדשת אובייקטיבית, NMV-50M11 אינץ', מחוברת למתאם ההרכבה C בצד הקדמי. לבסוף, העדשה והמצלמה מיושרות אופטית עם וסתי הטבעת.
תפקידו של האינטנסיפייר הוא לאתר פוטונים נכנסים ולהמיר אותם לפרצי אור מהירים על שבב המצלמה, הנרשמים ומשמשים ליצירת דעיכות פליטה ותמונות לכל החיים. מודול המצלמה כולל מערך חיישנים אופטי מתקדם מבוסס TCSPC (256 פיקסלים x 256 פיקסלים) ושבב קריאה מהדור החדש 29,30,31,32,33, המאפשרים הקלטה סימולטנית של זמן ההגעה (TOA) והזמן מעל סף (TOT) של התפרצויות פוטונים בכל פיקסל של שבב ההדמיה ברזולוציית זמן של 1.6 ns וקצב קריאה של 80 Mpixel/s.
בתצורה זו, למצלמה עם האינטנסיפייר יש רגישות לפוטון יחיד. הוא מונחה נתונים ומבוסס על מערכת הקריאה המהירה של גלאי פיקסלים (SPIDR)34. הרזולוציה המרחבית של ה- imager אופיינה בעבר בחיישני O2 זרחניים מישוריים ומסיכת צלחת רזולוציה. פונקציית תגובת המכשיר (IRF) נמדדה על ידי הדמיה של חיישן פלואורסצנטי מישורי תחת אותן הגדרות ששימשו בכל המדידות האחרות. אורך החיים של הצבע בסביבות 2.6 ns היה קצר מספיק כדי להשתמש בו למדידת IRF במצב PLIM. מכונת ההדמיה יכולה לצלם עצמים בגודל של עד 18 מ"מ x 18 מ"מ ברזולוציות מרחביות וזמניות של 39.4 מיקרומטר ו- 30.6 ננומטר (רוחב מלא בחצי מקסימום), בהתאמה28.
הפרוטוקולים הבאים מתארים את הרכבת מצלמת המאקרו ואת השימוש בה לאחר מכן למיפוי ריכוז O 2 בדגימות ביולוגיות המוכתמות בגשושית O2 שאופיינה קודם לכן, NanO2-IR35. הגשושית היא גשושית O 2-sensing בהירה, ניתנת לצילום וחדירה לתאים, המבוססת על צבע פלטינה (II) בנזופורפירין (PtBP). הוא מעורר ב-625 ננומטר, פולט ב-760 ננומטר, ומספק תגובה אופטית חזקה ל-O 2 בטווח הפיזיולוגי (0%-21% או 0-210 מיקרומטר של O2). ההדמיה מודגמת גם כדי לאפיין חומרי חיישנים שונים המבוססים על צבעי Pt(II)-פורפירין. בסך הכל, מכונת הצילום קומפקטית וגמישה, בדומה למצלמת צילום נפוצה. בהתקנה הנוכחית, מכונת ההדמיה מתאימה ליישומי PLIM שונים בשדה רחב. החלפת נורית ה-LED במקור לייזר מהיר תשפר עוד יותר את ביצועי מכונת ההדמיה ועשויה לאפשר יישומי FLIM של ננו-שניות.

<table><tbody><tr><td>627 ננומטר LED</td><td>חלקי אקספרס</td><td></td><td>ניתן להחלפה ב-LED שונה על סמך אורך גל העירור של החיישן. משומש 390 ננומטר LED לצבעי Pt-porphyrin.</td></tr><tr><td>760 &plusmn; מסנן פליטה של 50 ננומטר</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>84-788</td><td>ניתן להחלפה במסנן אחר המבוסס על אורך גל הפליטה של החיישן. משומש 650 &plusmn; מסנן פס פס 50 ננומטר לצבעי Pt-porphyrin.</td></tr><tr><td>עכברי Balb / c</td><td>Envigo, בריטניה</td><td>Balb / c</td><td></td></tr><tr><td>קופסה שחורה</td><td>Thorlabs</td><td>XE25C9 / M</td><td></td></tr><tr><td>מתאם קריקט</td><td>פוטוניס</td><td>צרצר -2</td><td></td></tr><tr><td>CT26 תאים&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CT26. WT</td><td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0697</td><td>ניתן להשתמש גם במדיה אחרת</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונות בחינם. ניתן להוריד מ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>MCP-125 מגביר תמונה עם מסך זרחן P47</td><td>Photonis</td><td>PP0360EF</td><td></td></tr><tr><td>מיני כלים</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>קוטר 35 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>סרט פלסטיק מיילר, 75 מיקרון&nbsp;</td><td>RS אירלנד</td><td>785-0795</td><td>ניתן להשתמש גם במצעי פלסטיק</td></tr><tr><td>תוצרת בית</td><td>NanO2-IR</td><td>n/a</td><td>ניתן לסנתז את הגשושית על פי השיטה שפורסמה 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. הדמיה in vivo של פעילות חילוף החומרים במוח באמצעות בדיקה זרחנית רגישה לחמצן. J שיטות נוירושי. 2013 יוני 15; 216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 באפריל. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' או מסופק על ידי המעבדה שלנו.&nbsp;</td></tr><tr><td>עדשת NMV-50M11 אינץ' 50 מ"מ</td><td>Navitar</td><td></td><td>ניתן להשתמש בעדשות אחרות התואמות ל-C-mount adators לוח</td></tr><tr><td>לחם אופטי</td><td>Thorlabs</td><td>MB1836</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td>קוטר 92 מ"מ</td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>Tenma</td><td>72-10495</td><td></td></tr><tr><td>מחולל דופק</td><td>Tenma</td><td>TGP110</td><td></td></tr><tr><td>Sophy</td><td>Amsterdam Scientific Instruments</td><td>n/z</td><td>מסופק על ידי ASI יחד עם Tpx3Cam</td></tr><tr><td>Tpx3Cam</td><td>Amsterdam Scientific Instruments</td><td>TPXCAM</td><td></td></tr><tr><td>Tri2 Software</td><td>University of Oxford</td><td>n/a</td><td>Free Time Resolved Imaging software, ניתן להוריד מ: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td></tr><tr><td>XYZ Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>LT3</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence lifetime macro imager עבור יישומים ביו-רפואיים

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

מאמר זה מציג מצלמת פוטולומינסנציה חדשה שנועדה למפות את ריכוז החמצן המולקולרי (O 2) בדגימות זרחן שונות, החל מציפויים רגישים ל-O 2 במצב מוצק ועד לדגימות רקמות חיות של בעלי חיים המוכתמות בבדיקות מסיסות רגישות ל-O2. בפרט, נעשה שימוש בגשושית ננו-חלקיקית המבוססת על אינפרא-אדום קרוב NanO2-IR, הניתנת לגירוי באמצעות דיודה פולטת אור (LED) של 625 ננומטר ופולטת ב-760 ננומטר. מערכת ההדמיה מבוססת על מצלמת Timepix3 (Tpx3Cam) ועל מתאם אופטו-מכני, הכולל גם מאיץ תמונה. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) נדרש בדרך כלל עבור מחקרים שונים, אך לפלטפורמות הנוכחיות יש מגבלות בדיוק שלהן, בגמישות הכללית ובשימושיות שלהן.
המערכת המוצגת כאן היא מצלמת תמונה מהירה ורגישה במיוחד, הבנויה על חיישן אופטי משולב ומודול שבב קריאה, Tpx3Cam. הוא הוכח כמפיק אותות זרחן בעוצמה גבוהה וערכי חיים יציבים מדגימות רקמת מעי מוכתמת על פני השטח או מקטעים מוכתמים תוך לומינלית של המעי הגס ומאפשר מיפוי מפורט של רמות O2 ברקמה בכ-20 שניות או פחות. כמו כן מוצגים ניסויים ראשוניים על הדמיה של היפוקסיה בגידולים מושתלים בבעלי חיים חסרי הכרה. אנו גם מתארים כיצד ניתן להגדיר מחדש את מכשיר ההדמיה לשימוש עם חומרים רגישים O2 המבוססים על צבעי Pt-פורפירין באמצעות נורית LED של 390 ננומטר לעירור ומסנן פס פס של 650 ננומטר לפליטה. בסך הכל, נמצא כי מכשיר ההדמיה PLIM מפיק מדידות כמותיות מדויקות של ערכי חיים עבור הגשושיות בהן נעשה שימוש ומפות דו-ממדיות בהתאמה של ריכוז O2 . זה גם שימושי עבור הדמיה מטבולית של מודלים רקמות ex vivo ובעלי חיים חיים.

עבור יישומי הדמיה ex vivo , שברי רקמות מעיים הוכתמו על ידי יישום מקומי של בדיקת NanO2-IR בצד הסרוסלי של הרקמה. עבור צביעה עמוקה יותר, 1 μL של הבדיקה הוזרק לתוך לומן. במקרה האחרון, דופן המעי בעובי 0.2-0.25 מ"מ הגנה על הגשושית מפני המצלמה. שני תהליכי הצביעה מודגמים באיור 2A.
העוצמה המתקבלת ותמונות PLIM מוצגות באיור 2B-G. הצבעים משקפים בבירור את ההבדל בערכי החיים, ומכאן, את ההבדל בחמצון של הצדדי...

מאמר זה מתאר את השימוש במצלמה אופטית חדשה ומהירה עבור הדמיה מקרוסקופית פוטולומינסנציה לכל החיים של דגימות פולטות דעיכה ארוכה. מתוארים תהליכי האינטגרציה, רכישת התמונה והניתוח, לצד הכנה ואפיון של חומרי החיישן להדמיה ויישום ההדמיה בחקר דגימות ביולוגיות.

Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

הפרוטוקול שלנו מספק מיפוי דו-ממדי מפורט של משך חיי הזרחן וריכוז החמצן בעצמים מקרוסקופיים, במיוחד רקמת בעלי חיים חיים ובעלי חיים שלמים, באמצעות גשושיות ייעודיות וחומרי חישה. מידע זה חשוב לתחומי מחקר רבים. הפרוטוקול שלנו משתמש במודול הדמיה משולב וקומפקטי הפועל במצב TCSPC ומספק הדמיה קלה ומדויקת של משך החיים וחלוקת החמצן בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון רקמת חיים.קח את מתאם הקריקט ובדוק אותו מצדדים שונים. הסר את מתאם הרכבה C בצד הקדמי כדי להציג את חיישן PP0360EF Photonis השוכן בצרצר, ולאחר מכן החזר את מתאם C-mount בחזרה. הסר את מתאם ההרכבה C הקדמי של הצרצר והכנס את מסנן הפליטה 650 פלוס/מינוס 50 ננומטר.תקן זאת על-ידי החזרת תושבת C. לאחר מכן, חבר את מודול מצלמת שלוש מצלמות TPX לחלק האחורי של מודול הקריקט באמצעות מתאמי הטבעת שלהם. חבר את העדשה לצד הקדמי של מודול Cricket באמצעות מתאם C-mount.חבר את נורית ה- LED לספק כוח וגנרטור פולסים. כעת, הרכיבו את נורית ה-LED הבהירה במיוחד בגודל 390 ננומטר על עמוד המחובר ללוח לחם בתוך הקופסה השחורה. הפעל את נורית ה- LED ומקד אותה כדי להבטיח עירור יעיל ואחיד של הדגימה המצולמת.הרכיבו את מכלול המצלמה על גבי הקופסה השחורה האופטית הפונה כלפי מטה לכיוון השלב שבו יצולמו הדגימות. חבר את המצלמה ואת LED לגנרטורים דו-פעימתיים ואוסילוסקופ בעל ארבעה ערוצים. באמצעות הגדרות על האוסילוסקופ ומחוללי הדופק, לסנכרן את הפולסים הנשלחים למצלמה ואת LED.השתמש בכבל ובשקע המיוחדים ביחידת הקריקט כדי לחבר את האינטנסיפייר לספק כוח סטנדרטי והגדר את הרווח ל- 2.7 וולט. מקם את הדגימה לפני עדשת המצלמה. לאחר מכן, הפעל את המצלמה ואת כל המודולים החשמליים, למעט המפעיל.הפעל את תוכנת SOFI כדי לכוונן את הפרמטרים התפעוליים, כגון מיקוד ויישור דגימה. במודולים, הגדר את חשיפת המסגרת ל- 0.01 שניות. בחר Infinite frames והגדר את מצב הפעולה של הפיקסלים לזמן מעל הסף.לאחר מכן, עבור אל תצוגה מקדימה ובחר מודול פעיל כדי לפתוח את חלון המסגרות Medipix/Timepix. בשלב הבא, לאחר תחילת ההקלטה, התאם את סולם הצבעים וסובב את התמונה לכיוון הרצוי. לאחר מכן, כבו את האורות בחדר והדליקו את המזין.מקד את אופטיקת המצלמה על במת הדגימה עם יכולות המיקוד של העדשה ומתאם הצרצרים כדי להפיק תמונות ברורות של דגימות עם ניגודיות ובהירות טובות. לאחר השלמת המיקוד, סגור את תוכנת SOFI. לאחר מכן, עבור אל המסוף, בצע את הפקודות של תוכנת העיצוב המותאם אישית כדי לרכוש את הנתונים הגולמיים בפורמט הבינארי ולסגור את המסוף.פתח מסוף חדש כדי לעבד את הנתונים שנרכשו. טען את קובץ הנתונים והפעל את מפחית הנתונים. נתח את הנתונים שלאחר התהליך באמצעות תוכנה ייעודית הכתובה בשפת C שתכתוב את הנתונים לקובץ תמונה ICS.לאחר מכן, פתח את קובצי התמונה של ICS באמצעות תוכנת Time Resolved Imaging הזמינה באופן חופשי, והשתמש בשתי פונקציות מעריכיות כדי להתאים לדעיכת הזרחן. לבסוף, פתח את Fitted. קבצי תמונה ICS עם תוכנת ניתוח התמונה הזמינה.צור תמונות לכל החיים של זרחן באמצעות טבלאות בדיקת מידע וקידוד שלהן בסקאלת צבעים מדומה. השתמש בפונקציה Measure כדי לחשב את ערכי משך החיים הממוצע של התמונה כולה או של אזורי עניין. עוצמת זרחן וזרחן תמונות מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של נקודת חיישן הצבע פלטינום אוקטאתילפורפירין במצבים מחומצנים ולא מחומצנים מוצגים.ודא שמסנן הפליטה הנכון מותקן בתוך הצרצר ונעשה שימוש בנורית ה- LED הנכונה, חיבורי הכבלים והגדרות הדופק. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מוגבל למודלים של בעלי חיים, אך ניתן ליישם אותו באופן פוטנציאלי כדי לאבחן ולטפל במצבים פתולוגיים הקשורים להיפוקסיה של רקמות, כגון סרטן, שבץ ודלקת.

fluorescence-lifetime-macro-imager-for-biomedical-applications

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) התפתחה הטכניקה מפתח לתמונה הסביבה ואינטראקציה של חלבונים ספציפיים צבעים בתאים חיים. FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון מאפשר מיפוי של צמיגות בתאים חיים.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

מקור: Pigazzini, M. L., et. al. אפיון של מבני עמילואיד בהזדקנות C. Elegans שימוש בהדמיה לכל החיים של הקרינה. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי (FLIM) כדי להעריך צבירת חלבון polyQ ב C. elegans נוירונים, השוואה בין תולעים בקרה ותולעים חסרות חלבון מלווה. צבירה מוגברת בתולעים חסרות מלווה מקדמת העברת אנרגיה בין פלואורופורים מקובצים, ומקטינה את חיי הקרינה. מפות מקודדות בצבע שנוצרו על ידי FLIM מתארות את ההבדלים הללו, ומדגישות את רמות הצבירה בין קבוצות הניסוי.

הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים של צבירת חלבון PolyQ בנוירונים של Caenorhabditis elegans

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

אנו מתארים את השימוש של רומן, תדר-תחום מצלמה לאורך החיים עבור מיפוי 2D O2 הפצות עם משטח חיישן אופטי. מערכת המצלמה וניתוח התמונה הליכים מתוארים יחד עם ההכנה, כיול ויישום של כנפונים חיישן עבור המחשה O2 מיקרו הסביבה בריזוספירה של צמחים ימיים.

לומינסנציה הדמיה של החיים של O2 עם תדר-מערכת מבוססי התחום מצלמה

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר מדידת פלואורסצנציה כמותית לאורך החיים של גשושי ריבוגלו עבור תהליכי דימות RNA ניתנים לשחזור במבחנה, בתאי יונקים חיים, ובמודלים תלת-ממדיים תלת-ממדיים. אנו מתכננים תהליכי הכנת דגימות, אספקת גשושים, איסוף נתונים וניתוח כמותי להפקת מדידות חיים של פלואורסצנציה בלתי מוטה.

אפיון גשושי ריבוגלו במבחנה כבסיס להדמיה פלואורסצנטית לאורך חיים בתאים חיים ביונקים ובמודלים תלת-ממדיים של תאים

BioMEMS וביולוגיה נייד: היבטים ויישומים

למדו מיפוי פלואורסצנציה ביומטרי בדגימות ביולוגיות חיות באמצעות מודול אופטי מתקדם בטכנולוגיית TCSPC. שיטה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של ריכוז חמצן וחיים פוספורסצנטיים לחקר תהליכים ביולוגיים מורכבים.

Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים

גלה סרטונים נוספים