Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים
7 באפריל 2023
מאמר זה מתאר את השימוש במצלמה אופטית חדשה ומהירה עבור הדמיה מקרוסקופית פוטולומינסנציה לכל החיים של דגימות פולטות דעיכה ארוכה. מתוארים תהליכי האינטגרציה, רכישת התמונה והניתוח, לצד הכנה ואפיון של חומרי החיישן להדמיה ויישום ההדמיה בחקר דגימות ביולוגיות.
הפרוטוקול שלנו מספק מיפוי דו-ממדי מפורט של משך חיי הזרחן וריכוז החמצן בעצמים מקרוסקופיים, במיוחד רקמת בעלי חיים חיים ובעלי חיים שלמים, באמצעות גשושיות ייעודיות וחומרי חישה. מידע זה חשוב לתחומי מחקר רבים. הפרוטוקול שלנו משתמש במודול הדמיה משולב וקומפקטי הפועל במצב TCSPC ומספק הדמיה קלה ומדויקת של משך החיים וחלוקת החמצן בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון רקמת חיים.
קח את מתאם הקריקט ובדוק אותו מצדדים שונים. הסר את מתאם הרכבה C בצד הקדמי כדי להציג את חיישן PP0360EF Photonis השוכן בצרצר, ולאחר מכן החזר את מתאם C-mount בחזרה. הסר את מתאם ההרכבה C הקדמי של הצרצר והכנס את מסנן הפליטה 650 פלוס/מינוס 50 ננומטר.
תקן זאת על-ידי החזרת תושבת C. לאחר מכן, חבר את מודול מצלמת שלוש מצלמות TPX לחלק האחורי של מודול הקריקט באמצעות מתאמי הטבעת שלהם. חבר את העדשה לצד הקדמי של מודול Cricket באמצעות מתאם C-mount.
חבר את נורית ה- LED לספק כוח וגנרטור פולסים. כעת, הרכיבו את נורית ה-LED הבהירה במיוחד בגודל 390 ננומטר על עמוד המחובר ללוח לחם בתוך הקופסה השחורה. הפעל את נורית ה- LED ומקד אותה כדי להבטיח עירור יעיל ואחיד של הדגימה המצולמת.
הרכיבו את מכלול המצלמה על גבי הקופסה השחורה האופטית הפונה כלפי מטה לכיוון השלב שבו יצולמו הדגימות. חבר את המצלמה ואת LED לגנרטורים דו-פעימתיים ואוסילוסקופ בעל ארבעה ערוצים. באמצעות הגדרות על האוסילוסקופ ומחוללי הדופק, לסנכרן את הפולסים הנשלחים למצלמה ואת LED.
השתמש בכבל ובשקע המיוחדים ביחידת הקריקט כדי לחבר את האינטנסיפייר לספק כוח סטנדרטי והגדר את הרווח ל- 2.7 וולט. מקם את הדגימה לפני עדשת המצלמה. לאחר מכן, הפעל את המצלמה ואת כל המודולים החשמליים, למעט המפעיל.
הפעל את תוכנת SOFI כדי לכוונן את הפרמטרים התפעוליים, כגון מיקוד ויישור דגימה. במודולים, הגדר את חשיפת המסגרת ל- 0.01 שניות. בחר Infinite frames והגדר את מצב הפעולה של הפיקסלים לזמן מעל הסף.
לאחר מכן, עבור אל תצוגה מקדימה ובחר מודול פעיל כדי לפתוח את חלון המסגרות Medipix/Timepix. בשלב הבא, לאחר תחילת ההקלטה, התאם את סולם הצבעים וסובב את התמונה לכיוון הרצוי. לאחר מכן, כבו את האורות בחדר והדליקו את המזין.
מקד את אופטיקת המצלמה על במת הדגימה עם יכולות המיקוד של העדשה ומתאם הצרצרים כדי להפיק תמונות ברורות של דגימות עם ניגודיות ובהירות טובות. לאחר השלמת המיקוד, סגור את תוכנת SOFI. לאחר מכן, עבור אל המסוף, בצע את הפקודות של תוכנת העיצוב המותאם אישית כדי לרכוש את הנתונים הגולמיים בפורמט הבינארי ולסגור את המסוף.
פתח מסוף חדש כדי לעבד את הנתונים שנרכשו. טען את קובץ הנתונים והפעל את מפחית הנתונים. נתח את הנתונים שלאחר התהליך באמצעות תוכנה ייעודית הכתובה בשפת C שתכתוב את הנתונים לקובץ תמונה ICS.
לאחר מכן, פתח את קובצי התמונה של ICS באמצעות תוכנת Time Resolved Imaging הזמינה באופן חופשי, והשתמש בשתי פונקציות מעריכיות כדי להתאים לדעיכת הזרחן. לבסוף, פתח את Fitted. קבצי תמונה ICS עם תוכנת ניתוח התמונה הזמינה.
צור תמונות לכל החיים של זרחן באמצעות טבלאות בדיקת מידע וקידוד שלהן בסקאלת צבעים מדומה. השתמש בפונקציה Measure כדי לחשב את ערכי משך החיים הממוצע של התמונה כולה או של אזורי עניין. עוצמת זרחן וזרחן תמונות מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של נקודת חיישן הצבע פלטינום אוקטאתילפורפירין במצבים מחומצנים ולא מחומצנים מוצגים.
ודא שמסנן הפליטה הנכון מותקן בתוך הצרצר ונעשה שימוש בנורית ה- LED הנכונה, חיבורי הכבלים והגדרות הדופק. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מוגבל למודלים של בעלי חיים, אך ניתן ליישם אותו באופן פוטנציאלי כדי לאבחן ולטפל במצבים פתולוגיים הקשורים להיפוקסיה של רקמות, כגון סרטן, שבץ ודלקת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מדמייר אופטי חדש שתוכנן עבור הדמיית זמן חיים של פוטולומינצנציה (photoluminescence lifetime imaging) ברמה המקרוסקופית, אשר שימושי במיוחד עבור דגימות ביולוגיות כגון רקמות של בעלי חיים חיים. הפרוטוקול מאפשר מיפוי מפורט של זמן חיים של פוספורסנצנציה ושל ריכוז חמצן, דבר שהוא קריטי להבנת תהליכים ביולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- דימות ביולוגי
- ניתוח זמן חיים של פוספורסנציה
- מדידת ריכוז חמצן
רקע
- דימות מאקרוסקופי הוא חיוני לחקר דגימות ביולוגיות מורכבות.
- שיטות קיימות עשויות שלא לנתח ביעילות דגימות בעלות התפרקות ארוכה.
- מחקר זה נועד לשפר טכניקות ויזואליזציה ברקמות חיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימות אופטי במצב ספירה של פוטון בודד עם מתאם זמנים (TCSPC)
- יישום על רקמות של בעלי חיים חיים
- שימוש במודולי דימות ותוכנת עיבוד נתונים בעיצוב מותאם אישית
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה יעילה של זמן חיים והתפלגות חמצן
- יכולת להפיק תמונות של זמן חיים של פוספורסנציה בניגודיות גבוהה
- יישום מוצלח בתצפית על תנאי היפוקסיה ברקמה
מסקנות
- המחקר מדגים גישת דימות חדשנית למחקר ביולוגי.
- יישומים פוטנציאליים לאבחון וטיפול במצבים הקשורים להיפוקסיה של רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי כמותי של חמצון רקמות באמצעות הדמיית זמן חיים של פוספורסנציה נותן מענה לצורך קריטי במחקר פרה-קליני להערכה מדויקת של היפוקסיה. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים של מחלות ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים לצורך תיקוף מטרות במחקרים אונקולוגיים ומטבוליים. ההדמיה המהירה והרגישה של הפלטפורמה מאפשרת הערכה חסונה של מיקרו-סביבות רקמה, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של ניהול הפורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של חמצון הרקמות כסמן ביולוגי תפקודי במודלים של מחלות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתוני היפוקסיה ברזולוציה מרחבית ברקמות חיות וב-ex vivo.
- מסייע בתיקוף מטרות על ידי קישור התפלגות החמצן לפעילות של מסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים מאושרים של רקמות לסריקת תרכובות בהמשך תחת מצבי חמצון מבוקרים.
- מספק מדידות אורך חיים כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר מוכנות לסריקה בשנייה גבוהה (high-throughput) על ידי הפחתת זמן הדימוי לפחות מ-20 שניות לדגימה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לחתימות היפוקסיה הרלוונטיות למחלה לצורך המשכיות תרגומית.
- תומכת בדימות מטבולי הן במערכות ex vivo והן במערכות של בעלי חיים חיים.
- מספקת נקודות קצה כמותיות לקידום מועמדים תרפויטיים בהתאם לסיכון.
שילוב זרימת עבודה וקו עיבוד
פלטפורמת דימיון זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ותומכת בתהליכי עבודה של תיקוף מטרות, זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי מנגנונים תלויי-חמצן במודלים של רקמות.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וסטנדרטיות לפיתוח בדיקות ולהערכת תרכובות.
- אנליטיקה: יוצרת מפות כמותיות של ריכוז חמצן וזמן חיים עם רזולוציה מרחבית לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי התאמת פלטי הדימות לסממנים ביולוגיים של היפוקסיה הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ברמת הארגון: מציעה יכולת דימות מודולרית וניתנת להגדרה מחדש, הניתנת להתאמה לגששים ומערכות רקמות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במודלים של מחלות המונעות על ידי היפוקסיה.
- ערך תפעולי: מספק דימות מהיר וניתן לשחזור עם פרוטוקולים סטנדרטיים ותאימות גמישה של גששים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת הקצאת ההון על ידי אספקת נקודות סיום כמותיות חסונות.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף מועמדים מותאם סיכון על בסיס נתוני חמצון רקמות מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות אופטי ובניתוח זמני חיים של פוספורסנציה.
- מחייב גישה למכשור ייעודי, כולל מצלמות בעלות יכולת TCSPC ומגברי תמונה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי דימות ותהליכי עבודה לניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של רקמות ולכימיות של גששים באמצעות הגדרה מתאימה.
- מוגבל כעת למודלים של בעלי חיים; הרחבה למערכות אחרות דורשת תיקוף נוסף.
