Name: במבחנה שיטה לחקר הבדלים מבוססי מין בתאי גביע הלחמית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: חקור שיטת תרבית מותאמת לתאי גביע הלחמית ללא הורמונים חיצוניים, המאפשרת בקרה מדויקת ברמות הורמונים מגדריים. השיטה משפרת את הדיוק במחקר ההבדלים הביולוגיים המבוססים על מין בריאות משטח העין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה ממומנת על ידי EY019470 המענקים של המכון הלאומי לעיניים (D.A.D).

כל הרקמה האנושית נתרמה לבנק העיניים בהסכמה מדעת מראש ובאישור התורם לשימוש במחקר מדעי. השימוש ברקמת הלחמית האנושית נבדק על ידי הוועדה ללימודי אנוש של העיניים והאוזן של מסצ'וסטס ונקבע כי הוא פטור ואינו עונה על ההגדרה של מחקר עם נבדקים אנושיים.
1. תרבית תאי גביע אנושית ראשונית
<ol><li>מבנק העיניים, להשיג רקמת הלחמית האנושית16.</li>
	<li>הכינו את מדיום התרבית, מדיום תרבית RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 2 מ"מ נתרן פירובט, 100 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, ו 2 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- חומצה פיפרזיניאתנסולפונית (HEPES).</li>
	<li>לבצע תרבית תאים ראשונית כמתואר להלן.<ol><li>טוחנים את הרקמה ל-1 מ"מ3 חתיכות עם אזמל סטרילי וזרעים על צלחות תרבית במכסה תרבית. זרעו ארבע חתיכות בכל באר של צלחת 6 בארות, ב 1 מ"ל של מדיה RPMI שלם. למרות שהכיוון של פיסת הרקמה אינו משפיע על צמיחת התאים, ודא שהחלקים נצמדים לצלחת התרבית כדי להבטיח צמיחה באמצעות להב האזמל.</li>
		<li>הכניסו את חלקי הרקמה לאינקובטור המכיל 95% אוויר ו-5% CO2 בטמפרטורה של 37°C. רעננו את אותו מדיום תרבית כל יומיים עד שתאי הגביע יגיעו למפגש של 70%-80% תוך כ-14 יום. הסר את תקע הרקמה כ 72 שעות לאחר הזריעה. הערה: אפיתל הלחמית האנושי מכיל בעיקר תאי קשקש מרובדים ותאי גביע. RPMI הוא מדיה סלקטיבית לתאי גביע. לעתים רחוקות בתרבית CGC אנושית, פיברובלסטים עשויים לגדול סביב היום השביעי. השיטה לטיהור התרבות תוארה בפרסום קודם 22.</li>
		<li>לאמת את טוהר תרבית GC באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (IFM) המכוון לציטוקרטין (CK)7 והליקס פומטיה לקטין-1 (HPA-1)22 בהתאם לשיטת IFM הסטנדרטית המתוארתב-19; ראה תוצאות מייצגות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מעבר תאי גביע לחמית אנושיים והכנה ניסיונית
<ol><li>שטפו את התאים עם PBS (pH = 7.4) ונתקו את התאים עם טריפסיניזציה באמצעות 0.05% טריפסין ב-1x EDTA. התבוננו בתאים כל דקה תחת מיקרוסקופ. ברגע שהתאים מתנתקים מהתחתית, נטרלו את פעולת הטריפסין באמצעות מדיית סל"ד מלאה.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 150 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את כדורית התא בתווך תרבית RPMI המלא וזרע מחדש על צלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית למדידת [Ca2+]i . הנפח הכולל של המדיום הוא 300 μL לכל מנה. שמרו את המדיה במרכז חלק הזכוכית של המנה.</li>
	<li>חיסול הורמונים במדיה תרבותית: מדיום התרבית עשוי להכיל הורמוני מין, במיוחד FBS. מכיוון שהפנול האדום הכלול ב-RPMI-1640 הוא בעל פעילות אסטרוגנית 23,24, החלף את מדיום ה-RPMI בתווך RPMI נטול פנול אדום וכוונן את ה-pH ל-7.45 באמצעות רצועות pH לאחר הכנת המדיום המלא. HEPES הכלול בתווך המלא שומר על ה- pH לטווח קטן יחסית.</li>
</ol>3. בדיקת Fura-2/אצטוקסימתיל (AM) למדידת [Ca2+]i
<ol><li>בצע טעינת Fura-2/AM כמתואר להלן.<ol><li>דגור על התאים בצלחות זכוכית תחתונות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C, אווירת הסביבה, ומוגן מפני אור עם חיץ ביקרבונט ביקרבונט Krebs-Ringer (KRB; מכיל 119 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.0 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO4 ו-25 mM NaHCO3) עם 0.5% HEPES (טבלה 1), בתוספת 0.5% BSA, 0.5 מיקרומטר fura-2/AM, 8 מיקרומטר חומצה פלורונית F127, ו 250 מיקרומטר sulfinpyrazone.</li>
		<li>יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.45 באמצעות מד חומציות לפני השימוש. לאחר טעינה עם fura-2/AM, שטפו את התאים עם KRB המכיל 250 מיקרומטר sulfinpyrazone מיד לפני [Ca2+]i מדידה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע מדידת [Ca2+]i כמתואר להלן.<ol><li>הניחו את הכלים המכילים את התאים העמוסים בפורה-2 מתחת למיקרוסקופ, אתרו שדה מייצג המכיל בין 20 תאים ל-50 תאים בהגדלה של פי 200, והשתמשו בפונקציה Freehand כדי לשרטט קו מתאר סביב כל תא כדי לציין לתוכנה מה פלואורסצנטי רקע ומה לא.</li>
		<li>המתן עד שהתוכנה תחסר באופן אוטומטי פלואורסצנטיות רקע מהמדידה ולחץ על הלחצן התחל ניסוי .</li>
		<li>לאחר מכן, המתן בין 8 s ל 15 s כדי לקבוע את רמות הסידן הבסיסי בתאים לפני pipeting בזהירות אגוניסט של עניין. המשך למדוד לפחות 120 שניות לאחר הוספת האגוניסט או עד שרמות הסידן יחזרו לקו הבסיס.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע ניתוח נתונים כמתואר להלן.<ol><li>השתמש בשינוי בשיא [Ca2+]i כדי לייצג את פעולות הגירויים. חשב את רמת הסידן הבסיסית הממוצעת בכל תא מתוך 8-15 שניות הראשונות של המדידות. אם מספר זה שווה ל- 500 ננומטר או גבוה ממנו, הסר תא זה מערך הנתונים מכיוון שהוא עובר אפופטוזיס או נמק.</li>
		<li>לאחר חישוב הרמה הבסיסית של כל תא, הפחת סכום זה מהמקסימום שנמדד [Ca2+]i עבור אותו תא. ממוצע השינוי בשיא [Ca2+]I עבור כל התאים במנה נתונה.</li>
		<li>כדי להבטיח עקביות, רשום את התגובות של כל גירוי בכפילות, וחשב את הערך הממוצע של השינויים בשיא [Ca2+]i המתקבל מהכפילויות כנקודת נתונים אחת מהמדגם האנושי הבודד. השווה את הנתונים מקבוצות שונות באמצעות שיטת ניתוח נתונים מתאימה המבוססת על עיצוב המחקר.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+downregulation+of+tissue+polymorphonuclear+neutrophils+drives+impaired+regulatory+T+cell+and+amplified+effector+T+cell+responses+in+autoimmune+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease.</a> Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).</li>
<li>Wang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+negatively+regulates+epithelial+wound+healing+and+protective+lipid+mediator+circuits+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea.</a> FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).</li>
<li>Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+androgens+and+pituitary+hormones+on+the+structural+profile+and+secretory+activity+of+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).</li>
<li>Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+dry+eye+disease+among+US+men%3A+estimates+from+the+Physicians%27+Health+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies.</a> Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).</li>
<li>Tellefsen Nøland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+age+differences+in+symptoms+and+signs+of+dry+eye+disease+in+a+Norwegian+cohort+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients.</a> The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).</li>
<li>Sullivan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFOS+DEWS+II+Sex%2C+gender%2C+and+hormones+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report.</a> The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).</li>
<li>Meester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXY+chromosomes+and+the+immune+system%3A+reflections+after+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study.</a> Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).</li>
<li>Yang, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+replacement+therapy+reverses+the+decrease+in+natural+killer+cytotoxicity+but+does+not+reverse+the+decreases+in+the+T-cell+subpopulation+or+interferon-gamma+production+in+postmenopausal+women%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women.</a> Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).</li>
<li>Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+age%2C+refractive+error+and+gender+related+changes+of+the+cornea+and+the+anterior+segment+of+the+eye+with+Scheimpflug+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Lens+%26+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging.</a> Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).</li>
<li>Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+age+and+gender+on+corneal+biomechanical+properties+in+a+healthy+Italian+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population.</a> Cornea. 33, 968-972 (2014).</li>
<li>Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+sex+steroids+exert+sex-specific+and%2For+opposite+effects+on+gene+expression+in+lacrimal+and+meibomian+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands.</a> Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).</li>
<li>Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age%2C+gender%2C+and+interracial+variability+of+normal+lacrimal+gland+volume+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI.</a> Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).</li>
<li>Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+aging+on+the+polar+and+neutral+lipid+profiles+in+human+meibomian+gland+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions.</a> Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).</li>
<li>Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+sex+hormone+levels+on+tear+production+in+postmenopausal+Nigerian+women%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Medicine+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women.</a> African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%27s+and+progesterone%27s+impact+on+gene+expression+in+the+mouse+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).</li>
<li>Shatos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cultured+human+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).</li>
<li>Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+rat+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1+and+aspirin-triggered+resolvin+D1+regulate+histamine-stimulated+conjunctival+goblet+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion.</a> Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).</li>
<li>Dartt, D. A., Masli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+epithelial+and+goblet+cell+function+in+chronic+inflammation+and+ocular+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).</li>
<li>Mantelli, F., Argüeso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+ocular+surface+mucins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functions of ocular surface mucins in health and disease.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).</li>
<li>García-Posadas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+performance+of+a+commercial+human+conjunctival+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line.</a> Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).</li>
<li>Shatos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+propagation+of+rat+conjunctival+goblet+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>García-Posadas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+IFN-%CE%B3+with+cholinergic+agonists+to+modulate+rat+and+human+goblet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function.</a> Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).</li>
<li>Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VIP+on+intracellular+%5BCa2+%5D%2C+extracellular+regulated+kinase+1%2F2%2C+and+secretion+in+cultured+rat+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).</li>
<li>Contrò, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+hormone+receptors%2C+their+ligands%2C+and+nuclear+and+non-nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways.</a> AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).</li>
<li>Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variation+in+estrogen+receptor-alpha+protein+turnover+in+the+presence+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).</li>
<li>Campen, C. A., Gorski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+behavior+of+protein+synthesis+inhibitors+on+the+turnover+of+the+estrogen+receptor+as+measured+by+density+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling.</a> Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-based+differences+in+conjunctival+goblet+cell+responses+to+pro-inflammatory+and+pro-resolving+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators.</a> Scientific Reports. 12, 16305(2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

חקירת ההבדלים מבוססי המין ברקמות העין מסייעת להבין את תהליכי המחלות, במיוחד עין יבשה ודלקת לחמית אלרגית, המשפיעות באופן לא פרופורציונלי על מין אחד 4,5,6. למרות שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים עבור מחקרים אלה, נתונים המתקבלים ישירות מרקמה אנושית חיוניים בשל הדמיון הגבוה ביותר לתאים האנושיים in vivo. רקמות הלחמית המשמשות במסגרת הניסוי הנוכחית הן מתורמים שנפטרו בטווח הגילאים של 70-85 שנים (לאחר גיל המעבר), מה שמקל על השל...

הבדלים מבוססי מין משפיעים על תהליכים מרובים של משטח העין 1,2,3. הביטוי הקליני של הבדלים מבוססי מין אלה הוא ההבדל בשכיחות של מחלות רבות על פני העין בין גברים לנשים, כגון עין יבשה ודלקת הלחמית 4,5,6. ראיות מצביעות על כך שהבדלים מבוססי מין נובעים מרמות ביולוגיות מרובות, כולל פרופילים שונים של גנים על כרומוזומי X ו- Y7 וההשפעות של הורמונים8. חקר הבסיס המולקולרי של הבדלים מבוססי מין יכול לספק הבנה טובה יותר של מחלות, ובסופו של דבר, לשפר את הרפואה המותאמת אישית.
משטח העין כולל את סרט הדמעות שמעליו, הקרנית והלחמית. הבדלים מבוססי מין נצפים במספר מרכיבים של משטח העין, כולל סרט הדמעות 9,10, קרנית 11, בלוטת הדמעות 12,13, ובלוטות מייבומיאן שגם מפרישות דמעות 12. מחקרים מכניסטיים רבים חקרו את ההשפעה של הורמוני מין על הקרנית ומרכיביה הקשורים14,15; עם זאת, מעט ידוע על ההבדלים מבוססי המין בלחמית ובתאי הגביע שלה. הלחמית היא קרום רירי המכסה את לובן העין ואת פני השטח הפנימיים של העפעף. אפיתל הלחמית מורכב מתאי קשקש לא קרקטיניים, רב-שכבתיים, מרובדים16.
בין תאי הקשקש המרובדים של הלחמית, ישנם תאי גביע (CGCs) המשולבים על פני השטח האפיקליים של האפיתל. תאי גביע אלה מאופיינים במספר רב של גרגרי הפרשה הממוקמים בקוטב האפי17. CGCs מסנתזים ומפרישים את המוצין MUC5AC יוצר הג'ל כדי להעניק לחות למשטח העין ולשמן אותו במהלך מצמוץ17. הפרשת מוצין מווסתת היטב על ידי התוך-תאי [Ca 2+] ([Ca2+]i) וההפעלה של קינאז מווסת אות חוץ-תאי תלוי Ras (ERK1/2)18. חוסר יכולת להפריש מוצין גורם ליובש של פני השטח של העין ו sequelae של הפרעות פתולוגיות. על משטח עיני מודלק, לעומת זאת, הפרשת מוצין נרחבת המגורה על ידי מתווכי דלקת מובילה לתפיסה של דביקות וגירוד של העין19. תנאים אלה עם הפרשת מוצין מופרעת יובילו בסופו של דבר להידרדרות פני העין.
תפקידם של תאי גביע כמקור העיקרי של מוצין עיני מוכר זה מכבר20, עם זאת, ההבדלים מבוססי המין בוויסות המוצין הן במצב פיזיולוגי והן במצב פתולוגי עדיין לא התגלו. מערכת במבחנה תהיה שימושית כדי לפקח על תפקודם של תאי גביע ללא ההשפעה ההורמונלית או עם רמה מבוקרת במדויק של הורמוני מין. למרות שקו תאי אפיתל לחמית התפתח21, אין קו תאי גביע עם הפרשת מוצין פונקציונלית זמינה. לכן, שינינו את תרבות ה-CGC האנושית הראשונית שפיתחנו כדי לבסס שיטה לניתוח ההבדל מבוסס המין במבחנה16, ולהציג אותו להלן.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין עם 1x EDTA</td><td>Gibco (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- פיפרזינאתיאנסולפוניקה חומצה</td><td>פישר ביו-ריאגנט (פיטסבורג, פנסילבניה)</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>מדיה RPMI מתקדמת</td><td>Gibco (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>קרבקול</td><td>קיימן כימיקל (אן ארבור, מישיגן)</td><td>144.86</td><td></td></tr><tr><td>סרום בווין עוברי</td><td>מו"פ D (מיניאפוליס, מינסוטה)</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2- אצטוקסימתיל אסטר&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>רקמת לחמית אנושית</td><td>בנק עיניים Eversight (אן ארבור, מישיגן)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מלח אנאורגני למאגר KRB</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)</td><td></td><td>כל מותג יעבוד</td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>קבוצת לונזה (באזל, שוויץ)</td><td>17-605F</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>גיבקו (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>גיבקו (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פנול נטול אדום RPMI מדיה&nbsp;</td><td>גיבקו (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פלורונית F127</td><td>MilliporeSigma (ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 מדיום תרבית</td><td>גיבקו (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>12460451</td><td>כל אזמל כירורגי סטרילי יכול לעבוד</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>גיבקו (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>סולפינפירזון</td><td>MilliporeSigma (ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>S9509-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה שיטה לחקר הבדלים מבוססי מין בתאי גביע הלחמית

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

עין יבשה היא מחלה רב-גורמית המשפיעה על בריאות פני העין, עם שכיחות גבוהה יותר באופן משמעותי אצל נשים. הפרעה של מוצין יוצר ג'ל המופרש על ידי תאי גביע הלחמית (CGCs) על פני השטח של העין תורמת למחלות מרובות של פני השטח של העין. חיסול הורמוני המין האקסוגניים חיוני להשגת תוצאות עקביות במהלך מחקר חוץ גופי של הבדלים מבוססי מין ב- CGCs. מאמר זה מתאר שיטה למזער את נוכחותם של הורמונים אקסוגניים בחקר הבדלים מבוססי מין ב- CGCs תוך שמירה על תפקודם הפיזיולוגי. CGCs מתורמים אנושיים לאחר המוות משני המינים תורבתו מחתיכות של הלחמית בתווך RPMI עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) (המכונה המדיום השלם) עד למפגש. כמעט 48 שעות לפני תחילת הניסויים, CGCs הועברו למדיום RPMI ללא פנול אדום או FBS אך עם 1% BSA (המכונה מדיום נטול פנול-אדום). התפקוד התאי התקין נחקר על ידי מדידת העלייה בגירוי תוך-תאי [Ca 2+] ([Ca2+]i) לאחר גירוי קרבצ'ול (Cch, 1 x 10-4 M) באמצעות מיקרוסקופ fura 2/acetoxymethyl (AM). התוצאה מראה כי CGCs שמרו על תפקוד תקין במדיה נטולת פנול-אדום לאחר 48 שעות. לא נצפה הבדל משמעותי בתגובת [Ca2+]i בין מדיום סל"ד ללא פנול אדום לבין מדיום שלם בגירוי Cch. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתווך RPMI ללא פנול-אדום עם 1% BSA כדי לחסל הורמונים אקסוגניים מבלי לשנות את התפקוד הרגיל של CGCs במחקר של הבדלים מבוססי מין.

CGCs אנושיים בתרבית ראשונית גדלים למפגש של 80% תוך כ-14 יום. סוג התא אושר על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עם נוגדנים לסמני תאי הגביע CK7 ו-HPA-125 (איור 1). למרות הסרת FBS מן המדיום יכול לחסל את הורמוני המין, חוסר FBS עלול להשפיע על התגובה התאית. כדי לאמת את שיטת סילוק ההורמונים, אגוניסט כולינרגי (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) שימש כגירוי כדי לחקות את הפרשת תאי הגביע הפיזיולוגית בתיווך קצות עצבים שונים המקיפים את תאי הגביע26. לא נצפה הב...

מדיום ללא פנול ללא אדום / סרום בקר עוברי הוא אפשרות טובה יותר מאשר RPMI מתקדם לחסל הורמונים אקסוגניים מבלי לשנות את התפקוד הרגיל של תאי גביע הלחמית במחקר של הבדלים מבוססי מין.

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

על ידי חקר תפקוד תאי הגביע בתרבית ראשונית, אנו מקבלים תובנות חשובות לגבי המנגנונים שמאחורי ההבדלים מבוססי המין בבריאות פני השטח של העין. שינינו את שיטת התרבית הראשונית של תאי גביע הלחמית שכבר נקבעה על ידי סילוק הורמונים וחומרים אסטרוגניים מהמערכת, מה שמאפשר שליטה מדויקת יותר ברמות הורמוני המין. שינוי זה משפר את הדיוק והאמינות של הממצאים שלנו.מדידת הסידן התוך-תאי היא שיטה לחקר תפקוד תאי הגביע תחת גירויים שונים ומסלולי האיתות התוך-תאיים המופעלים על ידי כל גירוי. ניתן להרחיב את הטכניקה לפיתוח תרופות למחלות פני השטח של העין כמו אלרגיה לעיניים, מחלת עין יבשה או דלקת הלחמית. טכניקה זו מאפשרת סריקה של השפעת מולקולות שונות על תאי גביע תחת רמות הורמונים ספציפיות.אנשים חדשים בטכניקה זו מתקשים לעתים קרובות בהפרדת רקמת הלחמית מרקמת החיבור. עצתנו היא לשים לב היטב למרקם ולתכונות החומר של הרקמה. הלחמית צריכה להיות אלסטית ושקופה למחצה ואילו רקמת החיבור בדרך כלל בהירה יותר בצבע ודמוית סיבי כותנה.כדי להתחיל, באמצעות אזמל סטרילי, לטחון את רקמת הלחמית האנושית לחתיכות קוביות מילימטר אחד. בצלחת בת שש בארות, זרעו ארבע חתיכות בכל באר המכילות מילימטר אחד של מדיום סל"ד שלם. הקפידו לעגן את החתיכות לצלחת.לדגור על חלקי הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% אוויר. רעננו את מדיום התרבות כל יומיים. לאחר 72 שעות מהזריעה, הסירו את פקק הרקמה והמשיכו לדגור עד שתאי הגביע מגיעים למפגש של 70% עד 80%.לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS והוסיפו 0.05% טריפסין EDTA כדי לנתק את התאים מתחתית הצלחת. התבוננו בניתוק התא תחת מיקרוסקופ. וברגע שהתאים מתנתקים, מוסיפים מדיום RPMI מלא כדי להשבית את הטריפסין.צנטריפוגו את מתלה התא ב 150 G למשך חמש דקות והשהו מחדש את הגלולה בתווך פנול ללא סל"ד אדום. לאחר מכן זרעו מחדש את תרחיף התא על צלחת תרבית תחתית זכוכית למדידת ריכוז הסידן התוך-תאי. להעמסת Fura-2 AM, יש להוסיף חיץ ביקרבונט Krebs-Ringer המכיל 0.5% HEPES, 0.5% BSA ו-0.5 מיקרומולרית Fura-2 AM, שמונה חומצה פלורונית מיקרומולרית F127 ו-250 מיקרומולרית סולפינפירזון לצלחת תחתית הזכוכית המכילה תאי גביע.לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, להגן עליהם מפני אור. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם חיץ Krebs-Ringer ביקרבונט המכיל 250 sulfinpyrazone micromolar. למדידת ריכוז סידן תוך תאי, הניחו את הצלחת המכילה תאים עמוסים בפורה-2 מתחת למיקרוסקופ.לאחר מכן מוסיפים הגדלה פי 200. אתר שדה מייצג המכיל 20 עד 50 תאים. באמצעות פונקציית היד החופשית, צייר קו מתאר סביב כל תא כדי להבדיל אותו מפלואורסצנטיות הרקע והמתן עד שהתוכנה תחסר אוטומטית פלואורסצנטיות רקע מהמדידה.לחץ על הלחצן התחל ניסוי והמתן שמונה עד 15 שניות כדי לקבוע את רמות הסידן הבסיסיות בתאים. לאחר מכן מוסיפים בזהירות את הקרבצ'ול אגוניסט הכולינרגי וממשיכים למדוד לפחות 120 שניות או עד שרמות הסידן חוזרות לקו הבסיס. באמצעות השינוי בריכוז הסידן התוך-תאי השיא, חשבו את רמת הסידן הבסיסית הממוצעת בכל תא משמונה עד 15 השניות הראשונות של המדידות.הסר תאים בעלי רמת סידן בסיסית ממוצעת השווה או מעל 500 ננו-מולרית ממערך הנתונים. לאחר מכן, חשב את ריכוז הסידן התוך תאי המרבי עבור כל תא. לאחר מכן הפחיתו את ערך רמת הסידן הבסיסית מהריכוז התוך-תאי המרבי שנמדד עבור אותו תא.לבסוף, ממוצע השינוי בריכוז הסידן התוך-תאי המרבי עבור כל התאים בצלחת. טוהר תאי גביע הלחמית האנושיים אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לסמני תאי הגביע, ציטוקרטין וסליל פומטיה לקטין 1. התוצאות של בדיקת Fura-2 AM לא הראו הבדלים משמעותיים בין תאים מודגרים בסל"ד אדום פנול עם 1% BSA ומדיום RPMI מלא.עם זאת, נצפתה עלייה משמעותית בתגובת הסידן התוך-תאית לקרבכול כאשר השוו את הקבוצה הבינונית המתקדמת בסל"ד לקבוצת ה-RPMI הבינונית השלמה. הדבר החשוב ביותר הוא להשיג תרבית תאי גביע אנושית ראשונית בעלת צפיפות תאים מספקת. במהלך הגדילה, ודא כי חתיכות הרקמה להידבק לצלחת התרבית עבור צמיחה יעילה.החוקרים יכולים לחקור את המעורבות של מסלולים ספציפיים על ידי הפעלת מעכבים שונים, מיקוד קולטנים או מולקולות איתות לתאים לפני הגירוי. ניתן להעריך גם את הפרמטרים האחרים המעידים על תפקוד תאי הגביע, כמו הפרשת מוצין ונטרול קינאזות חלבוניות המופעלות על ידי מיטוגן. המדידות המשלימות מספקות הבנה מקיפה של תגובת תאי הגביע לגירויים שונים.

in-vitro-method-to-study-sex-based-differences-conjunctival-goblet

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר שיטה להסרה מכנית של קרומי הכוריון והויטלין מביציות דרוזופילה בוגרות שהיו קבועות בעבר. הפרוטוקול המוצג מציג הדגמה מפורטת של ההליך המניב ביציות התואמות לבדיקות הכלאה פלואורסצנטיות באתרן.

הסרה מכנית של קרום כוריון וויטלין: שיטה להכנת ביציות דרוזופילה להשגחה ישירה

סרטון זה מתאר טכניקה מבוססת מטוש לבידוד חיידקים קומנסליים בני קיימא מלחמית העין. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור פרופיל של המיקרוביום החיידקי הקומנסלי של הלחמית, אשר ממלא תפקיד הגנתי מפני פתוגנים.

בידוד חיידקי לחמית מבוסס ספוגית: טכניקה לבידוד חיידקים קומנסליים ממודל הלחמית של מורין

אספנו, צבענו וצילמנו תאים מהלחמית של שולי העפעף הפנימיים של נבדקים אנושיים. על ידי אפיון מורפולוגיה של תאים ופעילות מטבולית, שיטה זו עשויה לקדם את הבנתנו את העין היבשה ואת התפקיד שהחיכוך בין משטחי העין עשוי למלא בתפיסת אי נוחות בעיניים.

ציטולוגיה רושם של פינת מגב ומכסה

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

אנו מתארים כאן שיטת בידוד להשגת לימפוציטים תוך-אפיתליאליים אנדו-צוואריים אנושיים לניתוח תאי T גמא דלתא תוך-אפיתליים. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לטיהור תאי T גמא דלתא אנדו-צוואריים על ידי חרוזים מגנטיים או על ידי מיון תאים.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד והגברה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטטיביים של עכבר אנאירובי באמצעות ספוגית עיניים ייחודית וצעד העשרה מבוסס תרבות עם זיהוי עוקב על ידי שיטות מבוססות מיקרוביולוגיות וספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה של מקטעים של צינוריות עכבר בוגרות למחצה המייצגות שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי, וסוגי תאים בו, וחיסון לאחר מכן של תכשירי סקווש ומקטעי צינור שלמים.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר שיטות סטנדרטיות לבידוד ועיבוד נוזל זקיקים, תאים סומטיים וביציות לא בשלות מהליכי הפריה חוץ גופית, המאפשרים ניתוחים מולקולריים ותאיים באיכות גבוהה. גישות אלו תומכות במחקר תרגומי על פוריות, הזדקנות רבייה ותפקוד לקוי של השחלות באמצעות חומרים המושלכים בדרך כלל בטיפול קליני.

אוסף נוזל זקיקי אנושי, תאים סומטיים של זקיקים וביציות לא בשלות מאנשים העוברים הפריה חוץ גופית

מאמר זה מדגים את הפעולה וההשפעה של מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo באבחון וטיפול בעין יבשה וחוקר את היישום והתוצאות של מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo כדי לספק בסיס למחקר עתידי.

ב Vivo מיקרוסקופיה קונפוקלית באבחון וניהול עין יבשה: התמקדות בפרוטוקולי הדמיה ופרשנות

חקור שיטת תרבית מותאמת לתאי גביע הלחמית ללא הורמונים חיצוניים, המאפשרת בקרה מדויקת ברמות הורמונים מגדריים. השיטה משפרת את הדיוק במחקר ההבדלים הביולוגיים המבוססים על מין בריאות משטח העין.

במבחנה שיטה לחקר הבדלים מבוססי מין בתאי גביע הלחמית

גלה סרטונים נוספים