מודל מעיים-על-שבב לחקר ציר המיקרוביום-מערכת העצבים של המעי

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחקור לראשונה השפעה של זן חיידקים על תאים ממערכת העצבים האנטרית. מאחר שמערכת העצבים האנטרית אינה נגישה בקלות, מודל זה מאפשר לחקור את השפעת מיקרוביום המעי על תאים ממערכת העצבים האנטרית. בעתיד, מודל זה יכול לשמש כדי לראות כיצד מיקרוביום המעי של חולים משפיע על תאים ממערכת העצבים האנטרית, למשל, במחלת פרקינסון.

מטרה עתידית אפשרית תהיה לחבר את המודל הזה למודלים אחרים של איבר על שבב כדי לבנות מודל המייצג את ציר המעיים-מוח. ההדגמה החזותית של טכניקה זו היא קריטית מכיוון שהפרוטוקול כולל שלבים רבים וכל שלב הוא קריטי למימוש מוצלח זה של מודל זה. מי שתדגים הליך זה תהיה קתרין סדראני, דוקטורנטית מהמעבדה לאקולוגיה מערכתית.

כדי להתחיל, הדקו את הברגים, אבטחו את החלקים העליונים והתחתונים של המהדק, והעבירו את מכסה הפוליקרבונט התחתון המצופה והמיובש מצלחת הפטרי המרובעת לחלק העליון של בסיס המהדק על ידי החזקת ארבעת הברגים בפינת המכסה. השתמש בפינצטה סטרילית כדי למקם את אטם תא האפיתל כאשר הקרום פונה כלפי מעלה על מכסה הפוליקרבונט. יישרו את האטם והמכסה בעזרת ברגים, וודאו שפתחי הכניסה והיציאה הפינתיים מתיישרים עם פתחי האטם.

הניחו את אטם הסנדוויץ' על אטם הקולגן כשהצד העליון פונה כלפי מעלה. ואז מניחים את מכסה הפוליקרבונט העליון על גבי אטם הכריך. ודא שהמוטות על מכסה המהדק מתיישרים עם מכלולי הממברנה פתח הכניסה והיציאה, ושברגי המכסה התחתון מתאימים לפתח המכסה העליון.

כדי לסגור את המכשיר, הנח את מכסה המהדק על מכסה הפוליקרבונט וסגור את התפחים. עבור הפריימינג של קווי הצינור, הכנס את מחטי האוורור עם מסננים במחיצה של כל בקבוק זרימה ויציאה. באמצעות פינצטה סטרילית נקייה, הכנס את מחטי ה-120 מילימטר לבקבוקי הסרום בקוטר 250 מ"מ ואת מחטי ה-80 מ"מ לבקבוקי הסרום בקוטר 15 מ"מ.

הכניסו את מחטי ה-40 מ"מ בקצה כל קו צינור לבקבוק סרום יציאה. המחטים בקוטר 40 מ"מ של קווי האפיתל והצינורית העצבית מחוברות לאותו בקבוק יציאה לצורך השלכה בינונית. קו צינור החיידקים עובר לבקבוק היציאה השני.

הכנס את קווי צינורות המשאבה לקלטות המשאבה. הגדר את המשאבה הפריסטלטית לכוון מדיה מהזרם הנכנס לבקבוק הזרימה במהירות של חמישה סל"ד ולחץ על לחצן ההפעלה כדי להפעיל את המשאבה. ודא שהסטופקוקים התלת-כיווניים של קווי הצינורות פתוחים כולם.

ברגע שהתקשורת נופלת לתוך בקבוקי היציאה, ודא שאין דליפות או בועות אוויר בקווי הצינורות ובנקודות החיבור. כאשר כל קווי הצינור נופלים לתוך בקבוקי היציאה, הגדר את קצב הזרימה לשני סל"ד כדי לחבר את המכשיר הראשוני. כדי לחבר קו, סגור את שסתומי הסטופקוק התלת-כיווניים, החל בצד היציאה.

נתק את הצינור הקצר ממחבר הפיתוי הנשי וחבר אותו ליציאת היציאה של המכשיר על ידי דחיפת הצינור מעל המשקוף. לחיבור מאובטח ללא דליפות, דחפו את הצינור כל הדרך למטה מעל המחבר, וודאו שהוא בא במגע עם המכסה. פתח את הסטופר ברגע שקו אחד מחובר לחלוטין למכשיר.

הגדר את קצב הזרימה של המשאבה לשני סל"ד והגדל את מהירות המשאבה למקסימום של 2.5 סל"ד כדי למנוע דליפות עקב הצטברות לחץ. הניחו למשאבה להפעיל את החדרים. הפחיתו את מהירות המשאבה ל-0.5 סל"ד ברגע שכל התאים מתמלאים בתווך תרבית התאים ולא נשארות בועות במכשיר.

עבור תאי אפיתל, נתקו את תאי Caco-2 מהבקבוק באמצעות טריפסין EDTA. השהה אותם מחדש בסל"ד 1640 בתוספת 10% FBS, וספור אותם במונה תאי נויבאואר באמצעות בדיקת ההרחקה הכחולה של טריפאן. צנטריפוגה את תאי Caco-2 מתלים למשך שלוש דקות ב-300G ומשליכים את הסופרנאטנט כדי להסיר את הנסיעות הנותרות ב-EDTA.

השהה מחדש את תאי Caco-2 בסל"ד 1640 בתוספת 10% FBS כדי להשיג השעיה של 0.35 מיליון תאים למיליליטר. מעבירים 1.5 מיליליטר מתרחיף התא Caco-2 למזרק סטרילי של שני מיליליטר, ומסירים את כל בועות האוויר שנותרו במזרק. סגור את שסתומי הסטופקוק התלת-כיווניים על הצינור של שני תאי החיידקים והנוירונים ונתק את הצינורית מהמשאבה על ידי הסרת הקלטות עם הצינור המתאים מהרוטור.

פתח את המכסה של שסתום הסטופקוק של צינור הזרימה המוביל לתא האפיתל וסובב את השסתום כדי להפנות את הזרימה הבינונית מהמכשיר למחבר הפתוח. אפשר לתווך לזרום עד שתופיע טיפה של התווך בקצה הפתוח של שסתום העצירה. הכנס את המזרק עם תאי אפיתל למחבר הפתוח בשיטת חיבור טיפה-טיפה כדי למנוע החדרת בועות אוויר במהלך ההחדרה.

סובב את השסתום של הסטופקוק כדי לעצור את זרימת התווך מבקבוק הזרימה, ולאפשר זרימה מהמזרק המחובר למכשיר הראשוני. נתק את תא האפיתל מהמשאבה ולחץ לאט על המזרק כדי לחסן את תא האפיתל עם 1.5 מיליליטר של השעיית התא. סגור את השסתום של הסטופק היוצא ונתק את המזרק.

סגרו את הקצה הפתוח של הסטופר עם הפקק והשאירו את התא סגור למשך שעתיים לפחות. בינתיים, לחסן את התאים העצביים. לאחר הסרת המכשיר מהאינקובטור והסרת קווי הצינורות, פתח לאט את המהדק והסר את המכסה.

הסר את מכסה הפוליקרבונט העליון בזהירות. אספו את התווך בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר והניחו אותו על קרח. מוציאים בעדינות את אטם הכריך, תוך איסוף המדיה מתא האפיתל מבלי לגעת בשכבת התא.

מניחים את אטם הכריך בצלחת פטרי מרובעת ומוסיפים 0.9% נתרן כלורי סטרילי ותמיסת מים לתא החיידקים עד לכיסוי מלא של התא. הסר לאט את אטם הקולגן תוך איסוף המדיה מהחדר העצבי. לאחר העברת המדיה לצינור מיקרו צנטריפוגה, הניחו את הצינורות על קרח.

הכניסו את אטם הקולגן לצלחת מרובעת והוסיפו בעדינות כמה מיליליטרים של PBS לשכבת Caco-2 עד ששכבת התא תכסה במלואה. הניחו את מכסה הפוליקרבונט התחתון בצלחת פטרי מרובעת והוסיפו בעדינות כשני מיליליטר PBS על גבי התאים העצביים, כך שהם לא יתייבשו במהלך תהליך הדגימה. צנטריפוגו את צינור המדיה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר העברת הסופרנאטנטים של כל צינור לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש, הניחו אותו מיד על קרח יבש. ספירת CFU הוערכה עבור שתי הגדרות התקן ראשוניות שונות. L.reuteri תרבית משותפת עם Caco-2 ו-L.reuteri במכשיר הקרוס-טוק המיקרוביאלי האנושי.

בשני המערכים ספירות ה-CFU היו שונות באופן משמעותי מהחיסון HuMix ומהתאים שנקטפו והצביעו על צמיחת תאי החיידק בתוך המכשיר הראשוני. כדי להעריך אם תרבית תאי העצב האנטרי במכשיר משנה את הפנוטיפ של התא, נצפתה המורפולוגיה הגסה שלהם באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה. הקמת רשת עצבית קונפלואנטית הצביעה על כך שהתאים התחברו היטב למכסה הפוליקרבונט המצופה במכשירים.

הקצה בין הרשת העצבית הקונפלואנטית לבין הספירלה המסומנת באטם היה ברור בבירור. הפוטנציאל של נוירו-הומיקס טמון במענה על שאלות שבעבר היה מאתגר להתייחס אליהן, הנוגעות לאינטראקציות בין מיקרוביום האדם-מעיים לבין מערכת העצבים האנטרית בשל היעדר מודל מייצג.