Name: אקס ויוו ניתוח של Ca2+ transients מופעל מכנית בתאי השתן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: למדו ניתוח אקס ויוו של אירועי סידן בתאי השתן בעכברים באמצעות חיישן GCaMP5G. הטכניקה מאפשרת חקר תעלות יונים מופעלות מכנית ומספקת כלי יעיל למחקר מנגנוני התמרה מכנית ברקמות נוספות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01DK119183 (ל- G.A. ו- MDC) ו- S10OD028596 (ל- G.A.) ועל ידי ליבות הדמיית הכליות של פיזיולוגיה של התא ואורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307).

<ol><li>Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+relationship+between+the+flow+rate+of+tubular+fluid+and+potassium+transport+in+the+distal+tubule+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat.</a> Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).</li>
<li>Engbretson, B. G., Stoner, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+potassium+secretion+by+rabbit+cortical+collecting+tubule+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro.</a> American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).</li>
<li>Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%28%2B%29+channels+are+regulated+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na(+) channels are regulated by flow.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).</li>
<li>Woda, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+flow-stimulated+potassium+secretion+in+rabbit+cortical+collecting+duct%3A+functional+and+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).</li>
<li>Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+K%2B+secretion+in+cortical+distal+tubules+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat.</a> American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).</li>
<li>Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+rate+and+potassium+intake+on+distal+tubular+potassium+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer.</a> American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).</li>
<li>Good, D. W., Wright, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+influences+on+potassium+secretion%3A+sodium+concentration+and+fluid+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate.</a> American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).</li>
<li>Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+chloride+transport+in+rat+S1+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).</li>
<li>Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+absorption+by+isolated+perfused+rat+proximal+straight+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules.</a> American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+renal+potassium+excretion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat.</a> American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+distal+tubular+potassium+and+sodium+transport+in+rat+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron.</a> American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).</li>
<li>Cabral, P. D., Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+flow+regulates+NO+and+O2%28-%29+along+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron.</a> American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).</li>
<li>Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-dependent+regulation+of+apical+endocytosis+in+renal+proximal+tubule+cells+mediated+by+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+membrane+area+of+rabbit+urinary+bladder+increases+by+fusion+of+intracellular+vesicles%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study.</a> The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).</li>
<li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+control+of+micturition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural control of micturition.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).</li>
<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+and+physiology+of+the+uroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell biology and physiology of the uroepithelium.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).</li>
<li>Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-activated+ion+channels%3A+what+are+they%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Stretch-activated ion channels: what are they.</a> Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanically activated ion channels.</a> Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).</li>
<li>Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+principles+of+ion-channel-mediated+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction.</a> Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%2B+channels+are+activated+by+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).</li>
<li>Ross, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins in mechanotransduction.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).</li>
<li>Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%2C+cadherins+and+channels+in+cartilage+mechanotransduction%3A+perspectives+for+future+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).</li>
<li>Huveneers, S., de Rooij, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+systems+at+the+cadherin-F-actin+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface.</a> Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.+Pfl%C3%BCgers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Sun, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+GCaMPs+for+improved+tracking+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity.</a> Nature Communications. 4, 2170(2013).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).</li>
<li>Delmas, P., Coste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-gated+ion+channels+in+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechano-gated ion channels in sensory systems.</a> Cell. 155 (2), 278-284 (2013).</li>
<li>Tavernarakis, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerins.+At+the+core+of+the+metazoan+mechanotransducer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).</li>
<li>Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+channels%3A+feeling+tension+in+a+world+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).</li>
<li>Blount, P., Iscla, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+bacterial+mechanosensitive+channels%2C+from+discovery+to+physiology+to+pharmacological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).</li>
<li>Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כל האורגניזמים, ולכאורה רוב סוגי התאים, מבטאים תעלות יונים המגיבות לגירויים מכניים 20,33,34,35,36,37. הפונקציה של תעלות מופעלות מכנית אלה הוערכה בעיקר עם טכניקת מהדק טלאי. עם זאת, בשל בעיות נגישות, מחקרי מהדק טלאי של תעלות יונים המופעלות מכנית הוגבלו במידה רבה לתאים וקווי תאים מנותקים. מאחר שתעלות יונים רבות המופעלות מכנית חד...

תאי אפיתל בדרכי השתן נתונים לכוחות מכניים כאשר סינון השתן עובר דרך הנפרונים, והשתן נשאב מאגן הכליה ועובר דרך השופכנים כדי להיאגר בשלפוחית השתן. זה זמן רב ידוע כי כוחות מכניים (למשל, לחץ גזירה ומתיחה) המופעלים על ידי נוזלים על תאי אפיתל המרפדים את דרכי השתן מווסתים את הספיגה מחדש של חלבון בצינורית הפרוקסימלית ושל מומסים בנפרון הדיסטלי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, וכן אחסון שתן בשלפוחית השתן והשתן14,15,16,17.
ההמרה של גירויים מכניים לאותות חשמליים וביוכימיים, תהליך המכונה מכנוטרנסדוקציה, מתווכת על ידי חלבונים המגיבים לעיוות של מבנים תאיים או מטריצה חוץ-תאיתקשורה 18,19,20,21. תעלות יונים המופעלות באופן מכני הן ייחודיות במובן זה שהן עוברות ממצב סגור למצב חדיר פתוח בתגובה לשינויים במתח הממברנה, לחץ או לחץ גזירה 18,19,20,21,22. בנוסף, Ca 2+ transients יכול להיות מופעל על ידי mechanotransduction בתיווך אינטגרין או על ידי הפעלה של מערכות הידבקות mechanoresponsive בצמתים תאתא 23,24,25,26. תפקוד תעלת היונים מוערך בדרך כלל בטכניקת מהדק טלאי, הכוללת היווצרות חותם ג'יגה-אוהם בין קרום התא לבין פיפטת התיקון27. עם זאת, תאים הממוקמים בשכבות רקמה עמוקות עם מטריצה חוץ-תאית צפופה (למשל, צינוריות כליות) או מוקפים במחסום פיזי (למשל, glycocalyx) קשה לגשת עם מיקרופיפטה זכוכית. כמו כן, תאים המשובצים או שהם חלקים אינטגרליים של רקמות עם יציבות מכנית ירודה (למשל, אורותל) לא ניתן לחקור בקלות עם טכניקת מהדק טלאי. מכיוון שתעלות יונים רבות המופעלות מכנית חדירות ל- Ca 2+, גישה חלופית היא להעריך את פעילותן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות צבע רגיש ל- Ca2+ או מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) כגון GCaMP. מאמצים אחרונים בהנדסת חלבונים הגדילו באופן משמעותי את הטווח הדינמי, הרגישות והתגובה של GECIs28,29,30, וההתקדמות בגנטיקה אפשרה את ביטוים באוכלוסיות תאים ספציפיות, מה שהופך אותם למתאימים באופן אידיאלי לחקר מכנוטרנסדוקציה.
האורוטל, האפיתל המרובד המכסה את פנים שלפוחית השתן, מתפקד כמחסום, מונע דיפוזיה של מומסים בשתן לתוך אינטרסטיציום שלפוחית השתן, אך מתפקד גם כמתמר, חש מלאות שלפוחית השתן ומתקשר אירועים אלה לעצבים ולשרירים הבסיסיים16. מחקרים קודמים הראו כי התקשורת בין השתן לבין הרקמות הבסיסיות דורשת את תעלות היונים המופעלות מכנית Piezo1 ו- Piezo231. כדי להעריך את מעברי Ca 2+ המושרים מכנית בתאי השתן, פותחה טכניקה חדשה שתוארה המשתמשת בהעברת גנים אדנו-ויראליים כדי לבטא את חיישן Ca2+ GCaMP5G בתאי השתן. טכניקה זו משתמשת בהכנת יריעה רירית המספקת גישה קלה לשכבת תאי המטריה החיצונית ביותר ומערכת בסיוע מחשב לגירוי מכני סימולטני של תאים בודדים עם מיקרופיפטה סגורה מזכוכית ורישום שינויים בפלואורסצנטיות לאורך זמן.

<table><tbody><tr><td>20x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>UMPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>24 G ו-frac34; &rdquo; קטטר</td><td>Medline&nbsp;</td><td>שקופית Suresite IV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>UPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>ממיר אנלוגי/דיגיטלי</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab6556</td><td></td></tr><tr><td>מפצל קרן</td><td>Chroma</td><td>T495lpxr</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה דו קוטבי&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21114-1L</td><td>1 M</td></tr><tr><td>solution cellSens software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>תוכנה מצלמת CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA fusion</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב מצומד ל-Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן&nbsp;</td><td>כרומה&nbsp;</td><td>נימי זכוכית ET470/40X</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית קורנינג 8250 זכוכית</td><td>וורנר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>G85150T-4</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>תנור חימום מובנה&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda XL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינורות משאבת סעפת</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-510</td><td>ID 1.52 מ"מ</td></tr><tr><td>צינורות משאבת סעפת</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-533</td><td>ID 2.79 מ"מ</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>עכברים&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>664</td><td>נקבה בת 2-4 חודשים C57BL/6J</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige&nbsp;</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX51W</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36964&nbsp;</td><td>Slowfade Diamond Antifade עם DAPI</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>pClamp תוכנה</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>גרסה 10.4</td><td>Patch-clamp אלקטרופיזיולוגיה תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>מפעיל פיזואלקטרי</td><td>Thorlabs</td><td>PAS005</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק פיפטות</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטות</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>בסיס מחומם להחלפה מהירה עם ערכת טבעת זלוף ומתאם</td> פלטפורמת החלפה מהירה של <td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>QE-1</td><td>מתאימה לצלחת 35 מ"מ&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>רודמין-פלואידין&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-פלוט</td><td>Systat תוכנה בע"מ</td><td>גרסה 14.0</td><td>גרפיקה מדעית וניתוח נתונים&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>אלסטומר סיליקון</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>בקר פייזו לולאה פתוחה בערוץ יחיד</td><td>Thorlabs</td><td>MDT694B</td><td></td></tr><tr><td>כרית מחזיק רשת מרובעת</td><td>טד פלה</td><td>10520</td><td></td></tr><tr><td>תפר</td><td>AD כירורגי</td><td>S-S618R13</td><td>6-0 מוט</td></tr><tr><td>הרכבה טפלון</td> סילק <td>בהתאמה אישית השתמש</td><td></td><td>להרכבת המפעיל הפיזואלקטרי במיקרומניפולטור</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14171129</td><td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN</td></tr><tr><td>התקן קלט/פלט דיגיטלי USB&nbsp;</td><td>נשיונל אינסטרומנטס</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr></tbody></table>

אקס ויוו ניתוח של ca2+ transients מופעל מכנית בתאי השתן

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

תעלות יונים המופעלות מכנית הן מתמרים ביולוגיים הממירים גירויים מכניים כגון כוחות מתיחה או גזירה לאותות חשמליים וביוכימיים. ביונקים, תעלות המופעלות באופן מכני חיוניות לאיתור גירויים חיצוניים ופנימיים בתהליכים מגוונים כמו תחושת מגע, שמיעה, ויסות נפח תאי הדם האדומים, ויסות לחץ הדם הבסיסי ותחושת מלאות בשלפוחית השתן. בעוד שתפקודן של תעלות יונים המופעלות באופן מכני נחקר בהרחבה בסביבה חוץ-גופית תוך שימוש בטכניקת מהדק הטלאים, הערכת תפקודן בסביבתן הטבעית נותרה משימה קשה, לעתים קרובות בגלל גישה מוגבלת לאתרי הביטוי של תעלות אלה (למשל, טרמינלים רגשיים, תאי מרקל, ברצפטורים וצינוריות כליות) או קשיים ביישום טכניקת מהדק הטלאים (למשל, המשטחים האפיקליים של תאי מטריה של השתן). פרוטוקול זה מתאר הליך להערכת מעברי Ca 2+ מעוררים מכנית באמצעות חיישן פלואורסצנטי GCaMP5G בהכנה אורותלית ex vivo, טכניקה שניתן להתאים בקלות לחקר אירועי Ca2+ מעוררים מכנית בתכשירים רקמתיים מקומיים אחרים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת מעברי Ca 2+ מעוררים מכנית בתאי מטריה באמצעות חיישן Ca2+ פלואורסצנטי GCaMP5G. התמרה אדנו-ויראלית שימשה לביטוי GCaMP5G בתאי דרכי השתן בשל יעילותו הגבוהה ומשום שהוא מייצר רמת ביטוי גבוהה. תמונות פלואורסצנטיות של קריוקציות מוכתמות משלפוחית שתן מומרת מוצגות באיור 2D. עבור ניסויים אלה, ביטוי GCaMP5G הוא הגבוה ביותר בשכבת תא המטריה. רצף של תמונות מייצגות שצולמו במהלך ניסוי שבו נדקר תא מטריה מוצג באיור 3A. התמונה...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להערכת תפקודן של תעלות יונים המופעלות מכנית בתאי שתן טבעיים באמצעות חיישן Ca2+ פלואורסצנטי GCaMP5G.

אקס ויוו ניתוח של Ca2+ transients מופעל מכנית בתאי השתן

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לחקר אירוע סידן המתעורר באופן מכני בתכשיר דרכי השתן ex vivo. הטכניקה קלה יחסית לביצוע וניתן להתאים אותה לחקר אירוע סידן המעורר מכנית בתכשירים אחרים של רקמות מקומיות. לייצר את micropipettes על ידי הנחת זכוכית נימי במושך ולהתאים אותו עם ידיות תומכות נימים.משוך את נימי הזכוכית בשני שלבים בהתאם להוראות היצרן. סגור את קצה המיקרופיפטות באמצעות מיקרופורג' עם ידית כוונון החימום המוגדרת על 60. לאחר חשיפת שלפוחית השתן ועצם האגן של העכבר שעבר המתת חסד, יש לפצח את עצם האגן כדי לחשוף את השופכה ולסדר את השופכה באמצעות צנתר בעל 24 מד.השתמש בתפר 6-0 כדי לאבטח את הצנתר לשופכה. קצרו את שלפוחית השתן והשופכה והצמידו אותם לכרית מחזיק גומי סיליקון הטובלת בתמיסת ההקלטה. יש להפריד את רירית שלפוחית השתן מהשכבה השרירית שמתחתיה בעזרת מלקחיים עדינים.חתכו את רירית שלפוחית השתן והצמידו אותה כלפי מטה כשהאורותליום פונה כלפי מעלה לאלסטומר סיליקון בתחתית צלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מילימטר. הרכיבו את צלחת תרבית הרקמה עם רירית שלפוחית השתן המוצמדת בשלב המיקרוסקופ המצוידת באינקובטור צלחת תרבית עם גופי חימום התנגדותיים. מחוררים את צלחת תרבית התאים ברציפות בקצב של 1.7 מיליליטר לדקה עם תמיסת הקלטה המחוממת ב 37 מעלות צלזיוס עם תנור בתוך השורה.שמור על הטמפרטורה של אינקובטור צלחת הרקמה ותמיסות על כ 37 מעלות צלזיוס עם בקר טמפרטורה דו קוטבי דו-ערוצי. כדי להקליט מעברי יוני סידן המושרים באופן מכני, השקיעו את המיקרופיפטה בתמיסת ההקלטה. תחת תאורת שדה בהיר, באמצעות מטרת סריקה בהגדלה נמוכה, הזז את המיקרופיפטה למרכז השדה.הזז את המיקרומניפולטור במישור האנכי וכוונן את המיקוד כדי להזיז את פיפטה קרוב לפני השטח של רקמת השתן. עבור למטרה עם הגדלה גבוהה יותר וצמצם מספרי המתאים לאימונופלואורסצנציה. הגדר את המיקרומניפולטור לדק והזז את פיפטה קרוב לחלק העליון של תא היעד.במידת הצורך, להתאים את המוקד ואת המיקום של פיפטה. פתח את פרוטוקול הגירוי בתוכנת האלקטרופיזיולוגיה והגדר אותו להפעלה. התאם את המוקד ולחץ על התחל במנהל הניסוי כדי להתחיל באיסוף נתונים.זה מניע את המפעיל הפיזואלקטרי ומייצר קובץ עם התמונות של הניסוי. כאשר התא מגורה, נצפתה עלייה בפלואורסצנטיות. לכימות עוצמת הפלואורסצנט, פתחו את קובץ התמונה בתוכנת ההדמיה ובחרו בחלון הספירה והמדידה.הפעל את הסרט כדי לזהות את התא המגורה. בחר בכלי מצולע וצייר החזר השקעה על גבולות התא שנדקר. עבור אל חלון המדידה, בחר פרופיל עוצמה, הגדר את המדידה לשעות נוספות, את התוצאות לממוצע, את חיסור הרקע לאפס ולאחר מכן לחץ על הפעל.עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת תחושב לאורך זמן. כדי לייצא את נתוני פרופיל העוצמה, לחץ על סמל Excel בחלון התוצאות של פרופיל העוצמה ובצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת גרפים וניתוח נתונים מדעית. במחקר זה, תא המטריה נדקר כדי להעריך מעברי סידן המתעוררים באופן מכני.התמונה שצולמה לאחר 10 שניות מראה תצוגה פלואורסצנטית של פיפטה מגרה הממוקמת על גבי תא מטריה המבטא חיישן סידן פלואורסצנטי GCaMP5G. גירוי מכני של תא המטריה המבטא חיישן סידן גורם לעיוות ואחריו עלייה מהירה בפלואורסצנטיות. הגרף מדגים שינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות המתוארת כפונקציה של זמן עבור מספר תאים.חיטוט מעורר תגובת סידן ברוב תאי המטריה המומרים באמצעות חיישן סידן פלואורסצנטי. השלב החשוב ביותר הוא קצירת שלפוחית השתן והשופכה, ולאחר מכן הצמדתם לכרית מחזיק גומי מסיליקון. הימנע נזק לרקמות בעת הפרדת רירית שלפוחית השתן מן השכבה השרירית הבסיסית.שיטות הדמיה כמו זו המתוארת כאן יכולות לספק תובנה ייחודית כיצד ערוצים המופעלים על ידי מכנו שולחים שינויים בסביבתם הטבעית ויוצרים תגובות פיזיולוגיות.

ex-vivo-analysis-mechanically-activated-ca2-transients-urothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה...

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

endomicroscopy הליזר confocal בדיקה מבוססת מאפשר מיקרוסקופיה בזמן האמת של מערכת השתן האנושית במהלך ציסטוסקופיה, ומספק הדמיה דינמית, intravital של מצבים פתולוגיים כגון סרטן שלפוחית ​​שתן עם רזולוציה סלולרית. Endomicroscopy עשוי להגדיל את הדיוק האבחנתי של האור הלבן אנדוסקופיה סטנדרטית ומספק הנחיות לשיפור תדמית במהלך ניתוח כריתה כירורגית.

Endomicroscopy בדיקה מבוסס Confocal ליזר בדרכי השתן: הטכניקה

אנו מתארים את השימוש באולטרסאונד בתדר גבוה עם הדמיה בניגוד כשיטה למדוד את עוצמת השלפוחית, עובי הקיר שלפוחית השתן, שמני מהירות, נפח ריק, משך הריק, וקוטר השופכה. אסטרטגיה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את תפקוד המעיים ויעילות הטיפול בדגמי העכבר השונים של תפקוד בדרכי השתן התחתון (LUTD).

Ultrasonography של בוגרים זכר בדרכי השתן עבור בדיקות פונקציונליות השתן

מודל שלפוחית השתן מאפשר גישה ישירה לסובורוטנום כדי ללמוד מנגנונים מקומיים לוויסות זמינות מגשרת פעילה ביולוגית בסווברואלינום/לאמה קינאה במהלך אחסון ובדיקת שתן. ההכנה דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן והיא מאפשרת לבצע מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו ללא השפעות מערכתיות.

מבוזרים (Ex Vivo) מורלין מודל שלפוחית השתן עם השריר הדטראאור הוסר עבור גישה ישירה Suburothelium במהלך מילוי שלפוחית השתן

מודל עכברי של חיסון אורופתוגני E. coli (UPEC) טרנס-urethral כדי ליצור מאגרי שלפוחית שתן תוך-תאיים סמויים וחשיפה שלפוחית השתן לאחר מכן ל - G. vaginalis כדי לגרום ל- UPEC UTI חוזר ונשנה מודגם. כמו כן הודגמו ספירה של חיידקים, ציטולוגיה של שתן, וקיבוע ועיבוד שלפוחית השתן באתרם לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך למדידת ריכוזי ATP בלומן של שלפוחית השתן במכרסם מורדם.

ב Vivo מדידה לומינלית של שחרור ATP אורותלי מעורר התנפחות במכרסמים

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

פרוטוקול זה מספק מדריך לאיטום העור עם ציאנואקרילט למניעת ספיגת שתן על ידי פרווה ועור. הוא כולל הוראות למריחת הדבק על העור, השתלת קטטר שלפוחית השתן ואלקטרודות לציסטומטריה ורישום אלקטרומיוגרפיה של סוגר שופכה חיצוני בעכברים ערים.

אופטימיזציה של טכניקות אורודינמיות בעכבר לשיפור הדיוק 

המאמר מציג שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לאלקטרופורציה של סידן דרך השופכה באמצעות אלקטרודה אנדוסקופית חדשה התואמת לציוד אורולוגי סטנדרטי. המחקר מהווה התקדמות משמעותית לקראת יישום אלקטרופורציה דרך השופכה וסולל את הדרך להרחבת הטיפול החדשני והמינימלי פולשני בגידולי שתן.

אינטגרציה של אלקטרופורציה בפרקטיקה אורולוגית: תכנון והערכה של אלקטרודה טרנס-שופכה חדשה

פרוטוקול זה מציג שיטה אופטימלית לבידוד רירית האפיתל של שופכת השופכה של נקבת העכבר הבוגרת לניתוחים במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה, צביעת חיסון ותרבות אורגנואידים. השיטות הניבו תאי אפיתל שופכה מעשירים ובריאים, כפי שמעידים ניתוח ציטומטריית זרימה, הדמיה שלמה ויצירת אורגנידים יעילה.

שיטה אופטימלית לבידוד אפיתל שופכה של נקבות עכבר לניתוח תא יחיד ואימונופלואורסצנציה

למדו ניתוח אקס ויוו של אירועי סידן בתאי השתן בעכברים באמצעות חיישן GCaMP5G. הטכניקה מאפשרת חקר תעלות יונים מופעלות מכנית ומספקת כלי יעיל למחקר מנגנוני התמרה מכנית ברקמות נוספות.

אקס ויוו ניתוח של Ca²⁺ transients מופעל מכנית בתאי השתן

גלה סרטונים נוספים