Name: חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: חקור שיטות TRAP ו-INTACT מותאמות לניתוח זוגי של האפיגנום והשעתוק בשחלות עכבר. גלה שינויים ספציפיים לתא הקשורים להזדקנות שחלתית ולבריאות הרבייה הנשית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), קרן BrightFocus (M2020207) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי פרס MERIT I01BX003906 ופרס תוכנית הערכת ציוד משותף (ShEEP) ISIBX004797 מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית. המחברים רוצים גם להודות למרכז הגנומיקה הקלינית (OMRF) ולמתקן הליבה של הדימות (OMRF) על הסיוע והשימוש במכשירים.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בקרן המחקר הרפואי של אוקלהומה (OMRF). עכברי הורים נרכשו ממעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME) וגודלו ושוכנו בתנאי SPF בסביבת מחסום HEPA במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות (אורות דולקים בשעה 6:00 בבוקר) ב- OMRF.
הערה: בהדגמה זו, אנו משתמשים בזכר Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) בשילוב עם נקבת NuTRAP (זן # 029899, מעבדת ג'קסון). צאצאי Cyp17-NuTRAP הרצויים (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) יבטא את אלל NuTRAP תחת שליטתו של מקדם Cyp17a1 בתאי סטרומה בשחלות. להכנת כתב היד השתמשנו בעכברות Cyp17-NuTRAP בנות 4 חודשים (n = 4). DNA הופק מדגימות ניקוב אוזניים של עכבר עבור גנוטיפ כדי לאשר את התורשה של טרנסגנים Cyp17iCre ו- NuTRAP ועבור זיהוי PCR של 1) Cre גנרי, 2) Cyp17iCre, ו -3) NuTRAP floxed באמצעות הפריימרים המפורטים בטבלת החומרים, כפי שתואר קודם לכן 7,8.
1. דיסקציה שחלתית עכבר
<ol><li>לבצע המתת חסד עכבר בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים ואישור המוסד, ולאחר מכן איסוף השחלות.</li>
	<li>לנתח את השחלות כדי להסיר כל רקמת שומן או חלקים של הביציות שעשויים להיות מחוברים לרקמת השחלה לפני הצבת השחלות בצינורות עם חיץ. המשך מיד לטכניקות TRAP או INTACT. הערה: פרוטוקול זה לא מוטב לשימוש עם רקמות קפואות. מומלץ להשתמש בשחלה אחת מאותו עכבר עבור כל טכניקה לצורך ניתוח סטטיסטי עתידי.</li>
</ol>2. בידוד גרעינים מסוגי תאי שחלה ספציפיים
<ol><li>הכנת חיץ<ol><li>חיץ טיהור גרעיני (NPB): כדי להכין 100 מ"ל של NPB, לשלב 2 מ"ל של 1 M HEPES (ריכוז סופי: 20 mM HEPES), 0.8 מ"ל של 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4.5 מ"ל של 2 M KCl (90 mM KCl), 0.4 מ"ל של 0.5 M EDTA (2 mM EDTA), 0.1 מ"ל של 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), ו-92.2 מ"ל מים נטולי נוקלאז. יש ליטול תוסף עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד הגרעינים. הערה: NPB יכול להיות מוכן ללא מעכב פרוטאז מראש ונמשך עד 3 שבועות ב 4 ° C.</li>
		<li>Nuclei lysis buffer (שלם): תוספת מאגר גרעיני ליזה עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד גרעינים.</li>
	</ol></li>
	<li>יצירת תרחיף הגרעינים הערה: הדגימות צריכות להישמר על קרח בכל עת, אלא אם צוין אחרת.<ol><li>יש לאסוף שחלה אחת מעכבר Cyp17-NuTRAP (או מ-Cre-NuTRAP רלוונטי אחר) ב-500 מיקרוליטר של מאגר גרעיני ליזה (שלם). חותכים את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים זעירים הנפתחים מעצמם.</li>
		<li>השתמש קצות פיפטה רחב משעמם להעביר את השחלה טחון 500 μL של חיץ ליזיס לתוך להקפיץ homogenizer על קרח. הומוגניזציה השחלה 10x-20x עם pestle רופף A. להוסיף 400 μL של חיץ ליזיס הומוגנייזר Dounce, כביסה pestle A.</li>
		<li>הומוגניזציה השחלה עם pestle הדוק B 10x-20x. מוסיפים 1,000 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, שטיפת מזיקים B. מעבירים את ההומוגנאט (1.9 מ"ל) לצינור בעל תחתית עגולה בנפח 2 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 1.5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר רקמות לא מנותקות וכלי דם14. הסופרנאטנט מכיל את הגרעינים; להשליך את הגלולה של רקמה לא מנותקת.</li>
		<li>לאחר הרטבה מוקדמת של מסננת תאים של 30 מיקרומטר עם 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, ומסננים את הסופרנאטנט דרך מסננת התא לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל. לאחר מכן, העבירו את התערובת המכילה גרעינים לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה את הדגימה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו להשליך את supernatant. הגלולה מכילה גרעינים.</li>
		<li>יש להשהות מחדש את הגלולה הגרעינית ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח על ידי מערבול קצר במהירות בינונית עד גבוהה. הבא את עוצמת הקול עד 1.75 מ"ל על-ידי הוספת 1.5 מ"ל של מאגר ליזיס. מערבבים בעדינות, ומניחים את המתלה הגרעיני על קרח למשך 5 דקות.</li>
		<li>גלולה את הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולה הגרעינית. השהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר אחסון קר כקרח, ומערבל לזמן קצר כדי להשהות מחדש לחלוטין את הגלולה הגרעינית.</li>
		<li>שמור 10% מהגלולה המרחפת מחדש (20 μL) כדגימת גרעיני קלט לניתוחים במורד הזרם.</li>
		<li>קח את גלולת הגרעינים המרחפים מחדש, והשלם את הנפח ל -2.0 מ"ל עם NPB קר כקרח. המשך לבודד את הגרעינים המסומנים באמצעות שיטת הטיהור מבוססת זיקה INTACT.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)<ol><li>מערבבים את חרוזי הסטרפטאבידין בבקבוקון במשך 30 שניות במהירות בינונית כדי להבטיח שהם מושהים מחדש במלואם. הוסף 30 μL של חרוזים מרחפים עבור כל דגימה לתוך צינור 2 מ"ל תחתית עגולה (חרוזים עבור עד 10 דגימות ניתן לשטוף בצינור אחד), להוסיף 1 מ"ל של NPB, ולהשהות היטב על ידי pipetting.</li>
		<li>הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנטנט, והוציאו את הצינור מהמגנט. להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים שטופים ב 1 מ"ל של NPB.</li>
		<li>חזרו על שלב השטיפה במשך שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של NPB (30 μL לדגימה).</li>
		<li>הוסף 30 μL של חרוזים שטופים להשעיה גרעינית 2 מ"ל משלב 2.2.10. מרחפים היטב את תערובת גרעיני החרוזים על ידי פיפטינג והיפוך עדין של הצינור.</li>
		<li>מניחים את הצינורות על מיקסר מסתובב בחדר קר או מקרר למשך 30 דקות במהירות נמוכה. לדגור על דגימות הקלט ללא חרוזים באותם תנאים.</li>
		<li>מניחים את הצינורות עם התרחיף הגרעיני והחרוזים על המגנט, ומפרידים את גרעיני הביוטינילציה הקשורים לחרוזי סטרפטווידין (חלק חיובי) מהחלק השלילי של הגרעינים. הניחו לחרוזים להיפרד על המגנט למשך 3 דקות.</li>
		<li>מוציאים את הסופרנטנט, מעבירים את החלק השלילי לצינור טרי של 2.0 מ"ל, ושומרים על קרח. עבור כל צינור שבר חיובי, הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את התוכן ב -1 מ"ל של NPB.</li>
		<li>מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת, ומשליכים את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את תערובת גרעיני החרוזים שנשטפו ב -1 מ"ל של NPB.</li>
		<li>חזור על שלב 2.3.8 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השלמת שלוש שטיפות, להשעות מחדש את תערובת גרעיני חרוזי החלק החיובי ב 30 μL של NPB.</li>
		<li>עבור כל צינור שבר שלילי, צנטריפוגה את המתלה הגרעיני משלב 2.3.7 ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת גרעיני השבר השלילי ב- 30 μL של NPB.</li>
		<li>אחסנו את הגרעינים מהקלט (שלב 2.2.9), מהשבר השלילי (שלב 2.3.10) ומהשבר החיובי (שלב 2.3.9) במקפיא של -80°C עד שיהיו מוכנים לבידוד DNA גרעיני או RNA. הערה: אין להקפיא את הגרעינים עבור פרוטוקולים הדורשים גרעינים שלמים כקלט (כלומר, בדיקה עבור כרומטין, כרומטין נגיש למשקעים).</li>
	</ol></li>
</ol>3. בידוד mRNA מסוגי תאי שחלה ספציפיים
<ol><li>הכנת המאגרים<ol><li>בסיס חיץ מלכודת: הכינו 100 מ"ל של בסיס חיץ TRAP על ידי שילוב של 78.8 מ"ל מים נטולי RNase, 5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (ריכוז סופי: 50 mM Tris [pH 7.5]), 5 מ"ל של 2 M KCl (100 mM KCl), 1.2 מ"ל של 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2), ו-10 מ"ל של 10% NP-40 (1% NP-40). יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד.</li>
		<li>בסיס חיץ מלח גבוה: הכינו 100 מ"ל של בסיס חיץ מלח גבוה על ידי שילוב של 68.8 מ"ל מים נטולי RNase, 5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (ריכוז סופי: 50 mM Tris [pH 7.5]), 15 מ"ל של 2 M KCl (300 mM KCl), 1.2 מ"ל של 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2), ו-10 מ"ל של 10% NP-40 (1% NP-40). יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד.</li>
		<li>חיץ הומוגניזציה TRAP (מלא): הכינו 1.5 מ"ל לכל דגימה ביום איסוף הרקמות. הכן 10 מ"ל של מאגר הומוגניזציה של TRAP על ידי שילוב של 10 מ"ל של בסיס מאגר TRAP (משלב 3.1.1) עם 10 μL של 100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד), 10 מ"ג נתרן הפרין (1 מ"ג/מ"ל נתרן הפרין), 20 מיקרוליטר של 0.5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL של 40 U/μL מעכב RNase (200 U/mL RNase inhibitor), 200 μL של 0.1 M ספרמידין (2 mM זרע), וטבליה אחת ללא מעכבי פרוטאז ללא EDTA (1x).</li>
		<li>חיץ שטיפת מלח נמוך (שלם): יש לייצר 1.5 מ"ל לדגימה ביום איסוף הרקמות. כדי ליצור 10 מ"ל של חיץ שטיפת מלח נמוך, ערבבו 10 מ"ל של בסיס חיץ TRAP (משלב 3.1.1) עם 10 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד) ו-20 מיקרוליטר של 0.5 מ"מ DTT (1 מ"מ DTT).</li>
		<li>חיץ שטיפת מלח גבוה (מלא): יש לייצר 1.5 מ"ל לדגימה ביום השני לבידוד TRAP. כדי ליצור 10 מ"ל של חיץ שטיפת מלח גבוה, שלב 10 מ"ל של בסיס חיץ מלח גבוה (משלב 3.1.2) עם 10 μL של 100 מ"ג / מ"ל cycloheximide ו 20 μL של 0.5 M DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>ביצוע טיהור זיקה ריבוזומי מתרגם (TRAP)<ol><li>אסוף את השחלה השנייה מעכבר Cyp17-NuTRAP (או מ- Cre-NuTRAP רלוונטי אחר) והנח אותה בצינור ללא RNase בנפח 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של מאגר הומוגניזציה של TRAP קר כקרח (משלב 3.1.3). חותכים את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים זעירים הנפתחים מעצמם.</li>
		<li>השתמש בקצוות רחבים כדי להעביר את השחלה ואת 100 μL של חיץ הומוגניזציה לתוך זכוכית להקפיץ הומוגנייזר. הומוגניזציה 10x-20x עם המזיק הרופף A. הוסף 400 μL של חיץ הומוגניזציה TRAP, שטיפת מזיק A.</li>
		<li>מעבירים את ההומוגנט לצינור עגול בנפח 2 מ"ל. שטפו את ההומוגנייזר Dounce עם 1 מ"ל נוספים של מאגר הומוגניזציה TRAP, והעבירו את נפח השטיפה לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה הומוגנט ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור טרי בנפח 2 מ"ל בעל תחתית עגולה. השליכו את הכדור.</li>
		<li>מעבירים 100 μL של ההומוגנט המפונה לצינור טרי בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל, ושומרים כקלט על קרח.</li>
		<li>יש לדגור על שארית ההומוגנט המפונה (משלב 3.2.4) עם נוגדן אנטי-GFP (5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת ב-4°C תוך סיבוב מקצה לקצה. לדגור על דגימת הקלט באותם תנאים.</li>
		<li>ב-15 הדקות האחרונות של הדגירה, שטפו את החרוזים המגנטיים של חלבון G במאגר שטיפת המלח הנמוך באמצעות השלבים הבאים (3.2.8-3.2.11).</li>
		<li>מערבלים את בקבוקון החרוזים המגנטיים של חלבון G למשך 30 שניות כדי להשהות מחדש לחלוטין. מעבירים 50 μL של חלבון G חרוזים מגנטיים עבור כל דגימה (עד 10 דגימות ניתן לשטוף בצינור אחד) לתוך 2 מ"ל תחתית עגולה.</li>
		<li>מוסיפים 500 μL של חיץ שטיפה דל מלח לחרוזים, ופיפטה בעדינות לערבוב. הניחו את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור. הסר והשליך את הסופר-נטנט.</li>
		<li>הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף 1 מ"ל של חיץ שטיפת מלח נמוך לצינור. פיפטה בעדינות לערבב. הניחו את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור. הסר והשליך את הסופר-נטנט.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.10 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, הסר את הצינור מהמדף המגנטי, והשהה מחדש את החרוזים בנפח ההתחלתי של חיץ שטיפת מלח נמוך (50 מיקרוליטר לדגימה).</li>
		<li>מעבירים את החרוזים השטופים המרחפים (50 μL) לתערובת דגימת האנטיגן/נוגדנים, ודגרים ב-4°C למשך הלילה תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. דגרו על דגימות הקלט המסתובבות מקצה לקצה ב-4°C למשך הלילה כדי לשמור על תנאים שווים.</li>
		<li>לאחר הדגירה בלילה, הסר את הצינורות מהמסובב, והפרד את החרוזים המגנטיים עם ריבוזומי המטרה / RNA (חלק חיובי) מהסופרנאטנט (שבר שלילי) באמצעות המעמד המגנטי למשך 2.5-3 דקות. שאפו את החלק השלילי, הניחו אותו בצינור עגול טרי של 2 מ"ל, והניחו אותו בצד על קרח תוך כדי עיבוד החלק החיובי.</li>
		<li>הוסף 500 μL של חיץ שטיפת מלח גבוה (משלב 3.1.5) לצינור עם החלק החיובי, ופיפטה עדינה כדי לערבב. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי שנשמר על קרח למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנטנט, והוציאו את הצינור מהמגנט.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.14 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, יש להשהות מחדש את החרוזים ב-350 מיקרוליטר של חיץ RNA ליזה בתוספת 3.5 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול (BME). דוגרים על הצינורות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב במשך 10 דקות ב-900 סל"ד בשייקר דיגיטלי.</li>
		<li>הפרידו את החרוזים מהתמיסה שמכילה כעת את ריבוזום/רנ"א המטרה עם מעמד מגנטי למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאסוף את החלק החיובי המדולל (supernatant) בצינור טרי 1.5 מ"ל, ולהוסיף 350 μL של 100% אתנול. הפוך כדי לערבב. המשך לבידוד RNA.</li>
		<li>אופציונלי: כדי לבודד RNA מדגימת הקלט (שלב 3.2.5) ומחלק שלילי (שלב 3.2.13), העבר 100 μL של הקלט ושברים שליליים לצינורות טריים של 1.5 מ"ל. הוסף 350 μL של חיץ RNA lysis בתוספת 3.5 μL של BME לכל דגימה. הפוך כדי לערבב. מוסיפים 250 μL של 100% אתנול לכל צינור, והופכים כדי לערבב. המשך לבידוד RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד RNA<ol><li>העבר 700 μL של החלק החיובי, ולחלופין, את הקלט ו / או החלק השלילי לעמודת ספין RNA. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לבודד RNA מעמודת הסחיטה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+aging%3A+Mechanisms+and+clinical+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences.</a> Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+Theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Morris, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+cycling+murine+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the cycling murine ovary.</a> eLife. 11, 77239(2022).</li>
<li>Kendrick, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+mammary+epithelial+subpopulations+identifies+novel+determinants+of+lineage+commitment+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate.</a> BMC Genomics. 9, 591(2008).</li>
<li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+FACS+perturb+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Ocanas, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BSIT%26%2334%3B+with+Emx1-NuTRAP+mice%3A+Simultaneous+INTACT+and+TRAP+for+paired+transcriptomic+and+epigenetic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">34;SIT&#34; with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing.</a> Current Protocols. 2 (10), 570(2022).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatomic+response+of+retinal+Muller+glia+to+acute+and+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Disease%22%5BJournal%5D)">Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress.</a> Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
<li>Briley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+age-associated+fibrosis+in+the+stroma+of+the+mammalian+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary.</a> Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+reproductive+life+span+is+extended+by+targeted+removal+of+fibrotic+collagen+from+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary.</a> Science Advances. 8 (24), (2022).</li>
<li>Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+analysis+in+the+vertebrate+brain+using+immunolabeled+fresh+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei.</a> Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).</li>
<li>Saccon, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+follicle+reserve%2C+DNA+damage+and+macrophage+infiltration+in+the+ovaries+of+the+long-living+Ames+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice.</a> Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).</li>
<li>Kinnear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ovarian+stroma+as+a+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The ovarian stroma as a new frontier.</a> Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).</li>
<li>Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+the+estrous+cycle+and+induction+of+estrus+in+experimental+rodents%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update.</a> Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+droplet-based+ultra-high-throughput+single-cell+RNA-Seq+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems.</a> Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).</li>
<li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+by+shrinking%3A+Empowering+single-cell+%27omics%27+with+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoBATCH+for+high-throughput+single-cell+epigenomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-cell+DNA+methylome+profiling+with+snmC-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2.</a> Nature Communications. 9, 3824(2018).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).</li>
<li>Yamawaki, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+high-throughput+single-cell+RNA-seq+methods+for+immune+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling.</a> BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Natarajan, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+tagged+reverse+transcription+%28STRT-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics comes of age.</a> Nature Communications. 11, 4307(2020).</li>
<li>Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+Powerful+new+methods+for+understanding+gene+regulation+and+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity.</a> Genome Biology. 17, 72(2016).</li>
<li>Christensson, E., Lewan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermidine+for+the+isolation+of+nuclei+from+mouse+liver.+Studies+of+purity+and+yield+during+different+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fu%CC%88r+Naturforschung.+Section+C%2C+Biosciences%22%5BJournal%5D)">The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions.</a> Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).</li>
<li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+accelerates+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Menopause accelerates biological aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).</li>
<li>Ossewaarde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+menopause%2C+cause-specific+mortality+and+total+life+expectancy%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy.</a> Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).</li>
<li>Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+menopause+predicts+future+coronary+heart+disease+and+stroke%3A+the+Multi-Ethnic+Study+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis.</a> Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).</li>
<li>Camaioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+ovarian+aging%3A+It+is+not+just+about+oocytes+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

עכבר NuTRAP מודל6 הוא גישת תיוג מהונדס רבת עוצמה לחקירה זוגית של התמליל והאפיגנום מסוגי תאים ספציפיים שניתן להתאים לכל סוג תא עם מנהל התקן Cre זמין. כאן, אנו מדגימים את הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP בהתמקדות בתאי תקה וסטרומה בשחלות. ניתן להשתמש במודל Cyp17-NuTRAP כדי להבהיר עוד יותר את המנגנונים האפיגנטיים הספציפיים לתאי תקה וסטרומה המעורבים בהזדקנות השחלות, סרטן ומחלות.
בעת בחירת מנהל התקן Cre, מומלץ לאמת את ספציפיות התא של ביטוי NuTRAP בתיווך Cre באמצעות מספר ג...

השחלות הן שחקניות מרכזיות בהזדקנות סומטית1, עם תרומות שונות מאוכלוסיות תאים ספציפיות. ההטרוגניות התאית של השחלה מקשה על פירוש התוצאות המולקולריות מבדיקות שחלה שלמות בתפזורת. הבנת התפקיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהזדקנות השחלות היא המפתח לזיהוי הגורמים המולקולריים האחראים לפוריות ולירידה בבריאות אצל נשים מזדקנות. באופן מסורתי, ההערכה הרב-אומית של סוגי תאי שחלה ספציפיים הושגה על ידי טכניקות כגון מיקרודיסקציה לייזר2, גישות חד-תאיות3 או מיון תאים4. עם זאת, מיקרודיסקציה יכולה להיות יקרה וקשה לביצוע, ומיון תאים יכול לשנות פרופילים פנוטיפיים תאיים5.
גישה חדשנית להערכת פרופילים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג תאי השחלות משתמשת במודל העכבר NuTRAP (ראשי תיבות של Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification). מודל NuTRAP מאפשר בידוד של חומצות גרעין ספציפיות לסוג התא ללא צורך במיון תאים באמצעות שיטות טיהור הזיקה: תרגום טיהור זיקה ריבוזומים (TRAP) ובידוד גרעינים המסומנים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)6. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. על ידי חציית עכבר NuTRAP עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הסרת קלטת STOP גורמת לתיוג eGFP של הקומפלקס הריבוזומלי ותיוג ביוטין/mCherry של הגרעין באופן תלוי Cre6. לאחר מכן ניתן להשתמש בטכניקות TRAP ו- INTACT כדי לבודד mRNA ו- DNA גרעיני מסוג התא המעניין ולהמשיך לניתוחים שעתוק ואפיגנומיים.
מודל NuTRAP שימש ברקמות שונות, כגון רקמת שומן6, רקמת מוח 7,8,9 ורשתית10, כדי לחשוף שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא שעשויים שלא להיות מזוהים בהומוגנט של רקמה שלמה. היתרונות של גישת NuTRAP על פני טכניקות מסורתיות של מיון תאים כוללים: 1) מניעת ממצאים אקטיבציוניים של ex vivo 8, 2) הצורך הממוזער בציוד מיוחד (כלומר, ממייני תאים), ו -3) התפוקה המוגברת והעלות המופחתת של ניתוחים ספציפיים לסוג התא. בנוסף, היכולת לבודד דנ"א ורנ"א ספציפיים לסוג התא מעכבר בודד מאפשרת ניתוחים זוגיים המגבירים את הכוח הסטטיסטי. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת 11,12,13, כיוונו את מערכת הביטוי NuTRAP לתאי סטרומה ותקה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. כאן, אנו מראים כי השראת מבנה NuTRAP היא ספציפית לתאי סטרומה ותקה בשחלות, ומספיק DNA ו- RNA למחקרי ריצוף מתקבלים משחלה אחת. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם כל קו Cre זמין.
ליצירת קו עכברי NuTRAP ספציפי לסוג התא, אלל התיוג והתרגום הגרעיני של טיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) כולל קודון STOP floxed השולט בביטוי של BirA, פפטיד זיהוי ליגאז ביוטין (BLRP) המתויג mCherry/mRANGAP1 ו-eGFP/L10a. כאשר חוצים אותו עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הביטוי של קלטת NuTRAP מתייג את החלבון הגרעיני mRANGAP1 עם ביוטין/mCherry ואת החלבון הריבוזומלי L10a עם eGFP באופן תלוי Cre. זה מאפשר בידוד של גרעינים ו-mRNA מסוגי תאים ספציפיים ללא צורך במיון תאים. ניתן להתאים אתNuTRAP flox/flox עם Cre ספציפי לסוג התא הרלוונטי לסוגי תאי השחלות כדי להעריך זאת.

<table><tbody><tr><td>0.1 מ' ספרמידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>05292-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>1 מ' MgCl2</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>30 ומיקרו; מסננת תאים M&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>כל הכנת DNA / RNA מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Abcam</td><td>Ab290</td><td>עבור TRAP ו- IHC (ארנב פוליקלונלי ל- GFP)</td></tr> <tr><td>מאגר RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA מאגר ליזה בפרוטוקול</td></tr><tr><td>cOmplete, מיני, מעכב פרוטאז ללא EDTA טבלית</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>להומוגניזציה של TRAP </td></tr><tr><td>דגם עכבר Buffer Cyp17iCre</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>28547</td><td>B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)מגנט AJako/J</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Genotyping Primers</td><td>IDT</td><td>Custom</td><td>Generic Cre - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 22392, פריימרים: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Cyp17iCre - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 30847, פריימרים: 21218, 31704, 31705, 35663</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>NuTRAP - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 21509, פריימרים: 21306, 24493, 32625, 32626</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861278</td><td>עבור מאגר NPB</td></tr><tr><td>M-280 Streptavidin Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>2.8 ומיקרו; M קוטר חרוז</td></tr><tr><td>MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד גרעינים: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nuc101</td><td>מכיל מאגר ליזיס גרעינים ומאגר אחסון גרעינים</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>דגם עכבר NuTRAP</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>29899</td><td>B6; 129S6-GT (ROSA) 26Sortm2 (CAG-NuTRAP) Evdr / J</td></tr><tr><td>Pierce DTT ללא משקל פורמט</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>10004D</td><td>עבור TRAP</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הפרין</td><td>פישר מדעי</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>מסובב צינור VWR</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9854190</td><td></td></tr></tbody></table>

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome

הערכת שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא הם המפתח להבנת הזדקנות השחלות. לשם כך, האופטימיזציה של שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) בוצעה לצורך חקירה זוגית עוקבת של תעתיק השחלות והאפיגנום הספציפיים לתא באמצעות מודל עכבר NuTRAP מהונדס חדשני. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת, מערכת הביטוי NuTRAP התמקדה בתאי סטרומה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. השראת מבנה NuTRAP הייתה ספציפית לפיברובלסטים סטרומה בשחלות, והתקבלו מספיק DNA ו-RNA למחקרי ריצוף משחלה יחידה. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם קו Cre זמין.

סכמה של פרוטוקולי TRAP ו-INTACT מוצגת באיור 1. כאן הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP לתאי סטרומה/תקה בשחלות מודגמת על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית ו-RNA-Seq מ-RNA מבודד TRAP. ראשית, בוצעה הדמיה אימונופלואורסצנטית של אות eGFP בשחלה ולוקליזציה של אות eGFP לתאי התקה והסטרומה. בקצרה, 5 מקטעים מיקרומטר היו deparaffinized עם xylene ו אתנול הדרגתי. לאיתות eGFP טוב יותר, חלבון ה-eGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני נגד חמור אלקסה 488, והגרעינים הוכתמו ב-DAPI15<...

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

Assessing cell-type-specific epigenomic and transcriptomic changes are key to understanding ovarian aging. To this end, the optimization of the ...

שיטה זו מספקת טכניקה לבידוד חומצות גרעין מאוכלוסיות תאי שחלה ספציפיות מאותו עכבר ללא צורך במיון תאים. טכניקה זו יכולה לסייע בזיהוי האופן שבו אוכלוסיות תאים מסוימות משתנות במגוון תנאים. לדוגמה, עם הזדקנות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח אפיגנומי ושעתוק זוגי מסוג תאי שחלה ספציפי ללא צורך במיון תאים. זה מגדיל באופן משמעותי את התפוקה, מקטין את העלות, ומבטל את הצורך בציוד מיוחד בעת ביצוע ניתוח ספציפי סוג התא מרקמת השחלות. כאן, המטרה שלנו היא לזהות את השינויים הספציפיים לסוג התא המתרחשים עם הזדקנות השחלות לפני הזדקנות הרבייה, שיש להם השלכות בטיפול באי פוריות נשית.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא במערכות גוף שעבורן זמין מנהל התקן Cre ספציפי לסוג התא. החלק הקשה ביותר בטכניקה זו הוא בחירת קו Cre מתאים לסוג התא שלך. מומלץ לבצע אימות נרחב של ספציפיות התא.כדי להתחיל, לאסוף שחלה אחת מהעכבר המתת חסד ב 500 מיקרוליטר של חיץ גרעיני ליזה ולקצוץ את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים מיקרו פתיחה עצמית. מעבירים את השחלה הטחונה ואת חיץ הליזיס לכוס מקפיצים הומוגנייזר על קרח והומוגניים את השחלה 10 עד 20 פעמים עם המזיק הרופף A.מוסיפים 400 מיקרוליטר של חיץ ליזיס למזיק ההומוגנייזר לשטוף את המזיק A.ואז הומוגניזציה של השחלה עם מזיק הדוק B 10 עד 20 פעמים. מעבירים את ההומוגנט לצינור תחתון עגול של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 גרם למשך 1.5 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הרקמה וכלי הדם הלא מנותקים.לאחר הרטבה מוקדמת של מסננת תאים באורך 30 מיקרומטר עם חיץ ליזה של 100 מיקרוליטר, סננו את הסופרנאטנט דרך המסננת לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. מעבירים את הגרעינים המכילים תערובת לצינור תחתון עגול של שני מיליליטר. צנטריפוגה את הדגימה ב 500 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.יש להשהות מחדש את כדורית הגרעינים ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח על ידי מערבול קצר במהירות בינונית עד גבוהה. הגדל את עוצמת הקול ל- 1.75 מיליליטר על-ידי הוספת 1.5 מיליליטר של חיץ ליזיס. מערבבים בעדינות ומניחים את תרחיף הגרעינים על קרח למשך חמש דקות.משחררים את הגרעינים בצנטריפוגה ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. ובזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע את גלולת הגרעינים. השהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של חיץ אחסון קר כקרח ומערבולת לזמן קצר כדי להשהות מחדש לחלוטין את גלולת הגרעינים.שמור 10% מהגלולה המרחפת מחדש כדגימת גרעיני קלט לניתוח במורד הזרם. קח את משטח הגרעינים המרחף מחדש והשלם את הנפח לשני מיליליטר עם חיץ טיהור גרעיני קר כקרח, או NPB. הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזים מרחפים עבור כל דגימה לתוך צינור תחתון עגול של שני מיליליטר.לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של NPB ולהשעות היטב על ידי pipetting. הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנאטנט והוציאו את הצינור מהמגנט.להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים שטופים במיליליטר אחד של NPB. חזרו על שלב השטיפה במשך שלוש כביסות בסך הכל. ואחרי הכביסה הסופית, להשעות מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של NPB.מוסיפים 30 מיקרוליטר מהחרוזים השטופים לשני מיליליטר של התרחיף הגרעיני ומרחפים היטב את תערובת גרעיני החרוזים על ידי פיפטציה והיפוך עדין של הצינור. מניחים את הצינורות על מיקסר מסתובב בחדר קר או מקרר למשך 30 דקות במהירות נמוכה ודגרים על דגימות הקלט ללא חרוזים באותם תנאים. הניחו את הצינורות עם תרחיף הגרעינים והחרוזים על המגנט למשך שלוש דקות כדי להפריד את גרעיני הביוטינילציה הקשורים לחרוזי סטרפטווידין מהחלק השלילי של הגרעינים.הסר את supernatant. מעבירים את החלק השלילי לצינור שני מיליליטר טרי ושומרים אותו על קרח. עבור כל צינור שבר חיובי, הסר את הצינור מהמגנט והשהה מחדש את התוכן במיליליטר אחד של NPB.מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת ומשליכים את הסופרנטנט. השהה מחדש את תערובת גרעיני החרוזים של החלק החיובי ב -30 מיקרוליטר של NPB. מעבירים את השחלה ו-100 מיקרוליטר של חיץ הומוגניזציה לתוך זכוכית מקפיצים הומוגנייזר והומוגניזציה 10 עד 20 פעמים עם המזיק הרופף A.מוסיפים 400 מיקרוליטר של חיץ הומוגניזציה TRAP לשטיפה פסטל A ומעבירים את ההומוגנט לצינור תחתון עגול של שני מיליליטר.שטפו את ההומוגנייזר עם מיליליטר נוסף של חיץ הומוגניזציה TRAP והעבירו את הנפח השטוף לצינור התחתון העגול של שני מיליליטר. צנטריפוגה הומוגנט ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ומעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור תחתון עגול טרי של שני מיליליטר.לאחר השלכת הכדור, העבירו 100 מיקרוליטר של ההומוגנט המפונה לצינור תחתון עגול טרי של שני מיליליטר ושמרו אותו כקלט על קרח. דוגרים על שארית ההומוגנט המפונה עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר נוגדן נגד GFP למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. דגרו על דגימת הקלט באותו מצב.מעבירים 50 מיקרוליטר של חרוזי החלבון G מגנטיים לכל דגימה לתוך צינור תחתון עגול של שני מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה דל מלח לחרוזים ולפיפטה בעדינות לערבוב. הכניסו את הצינור למעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור.לאחר השלכת הסופרנטנט, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף מיליליטר אחד של חיץ שטיפה דל מלח לצינור. פיפטה בעדינות לערבב. שוב, הכניסו את הצינור למעמד המגנטי וחזרו על השלב במשך שלוש כביסות בסך הכל.לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של מאגר כביסה דל מלח. מעבירים את החרוזים השטופים המרחפים לתערובת נוגדני דגימת האנטיגן ודגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. לדגור על דגימות הקלט במשך הלילה בתנאים המקבילים.לאחר מכן, להפריד את החלק החיובי או את החרוזים המגנטיים עם RNA ריבוזומים המטרה מן החלק השלילי או supernatant באמצעות מעמד מגנטי במשך 2.5 עד 3 דקות. שאפו את החלק השלילי. מניחים אותו בצינור תחתון עגול טרי של שני מיליליטר, ומניחים אותו בצד על קרח.מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ שטיפה עתיר מלח לצינור עם החלק החיובי ופיפטה עדינה לערבוב. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי הנשמר על קרח למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוציאו את הצינור מהמגנט וחזרו על השלב במשך שלוש שטיפות בסך הכל.לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש את החרוזים ב 350 מיקרוליטר של חיץ RNA ליזה בתוספת 3.5 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול. דוגרים על הצינורות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב במשך 10 דקות ב-900 סל"ד בשייקר דיגיטלי. הפרידו את החרוזים מהתמיסה שמכילה כעת את RNA ריבוזומי המטרה עם מעמד מגנטי למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.אסוף את החלק החיובי המדולל בצינור טרי של 1.5 מיליליטר. הדמיית אימונופלואורסנציה בוצעה על השחלות הפרפיניות של עכברי NuTRAP flox חיוביים של Cyp17-Cre ו- Cyp17-Cre שליליים NuTRAP flox. חלבון EGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני אלקסה 488 חמור נגד עזים, והגרעינים הוכתמו ב- DAPI.התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 20. הקלט והשבר החיובי TRAP RNA בודדו משחלות עכבר NuTRAP flox חיוביות של Cyp17-Cre ורוצפו באופן קצה זוגי. ניתוח המרכיבים העיקרי של כל הגנים המבוטאים הראה הפרדה בין קלט ה- TRAP לבין שברים חיוביים ברכיב הראשון.תרשים הר הגעש של גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין הקלט לבין השברים החיוביים מוצג כאן. ההשוואה בין החלק החיובי של TRAP לקלט הראתה העשרה כוללת של הגנים של סמן תאי סטרומה/תקה ודלדול הגנים של סמן הביציות, הגרנולוסה, מערכת החיסון ותאי השריר החלק בחלק החיובי של TRAP. לאחר הצנטריפוגה הראשונה של ההשעיה הגרעינית כדי להסיר כלי דם לא מנותקים, הגרעינים נמצאים בסופרנטנט.הקפידו לשמור על הסופרנאטנט ולהשליך את הגלולה בשלב זה. בעקבות השיטה השלמה, ניתן לבצע מספר טכניקות אפיגנומיות, כולל בדיקות לנגישות כרומטין או שינויים ב- DNA בין היתר. בעקבות שיטת TRAP, ניתן לבצע ריצוף RT-qCPR או RNA כדי להעריך את הטרנסלטום.זהו היישום הראשון של שיטת NuTRAP בשחלה העכבר. זה מאפשר ניתוח אפיגנומי ושעתוק בתפוקה גבוהה מסוגי תאי שחלה ספציפיים, אשר עשויים לשמש לחקר הזדקנות השחלות או סרטן.

cell-specific-paired-interrogation-mouse-ovarian-epigenome

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה בדנ"א. פרוטוקול שונה שלנו מאפשרת ניתוח מתילציה דנ"א ברמת מתחיל מתא בודד ותוכנן במיוחד עבור ביציות נפרדות. זה יכול לשמש גם המחשוף בשלב עוברי.

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת זקיקי השחלה בתרבית של עכברים צעירים ללא חלוקתה טורי. שימוש immunofluorescence כל איבר ורקמה ניקוי, חלוקתה הפיזי מוחלף עם חלוקתה אופטי. שיטה זו של הכנת הדוגמא והדמיה שומר על תקינות האיברים ואסטמה ומקילה על כימות אוטומטיות של תאים ספציפיים.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

מוצגת שיטה למיקרודיסקציה של oviduct העכבר המאפשרת איסוף של מקטעים בודדים תוך שמירה על שלמות RNA. בנוסף, הליך פירוק תאים oviductal לא אנזימטי מתואר. השיטות מתאימות לניתוח גנים וחלבון לאחר מכן של מקטעי oviductal שונים מבחינה תפקודית ותאי oviductal מנותקים.

ניתוח מיקרו-דיסקט וניתוק של אובידוקט מורין: זיהוי מקטע בודד ובידוד תא בודד

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

חקור שיטות TRAP ו-INTACT מותאמות לניתוח זוגי של האפיגנום והשעתוק בשחלות עכבר. גלה שינויים ספציפיים לתא הקשורים להזדקנות שחלתית ולבריאות הרבייה הנשית.

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

גלה סרטונים נוספים