חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

שיטה זו מספקת טכניקה לבידוד חומצות גרעין מאוכלוסיות תאי שחלה ספציפיות מאותו עכבר ללא צורך במיון תאים. טכניקה זו יכולה לסייע בזיהוי האופן שבו אוכלוסיות תאים מסוימות משתנות במגוון תנאים. לדוגמה, עם הזדקנות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח אפיגנומי ושעתוק זוגי מסוג תאי שחלה ספציפי ללא צורך במיון תאים. זה מגדיל באופן משמעותי את התפוקה, מקטין את העלות, ומבטל את הצורך בציוד מיוחד בעת ביצוע ניתוח ספציפי סוג התא מרקמת השחלות. כאן, המטרה שלנו היא לזהות את השינויים הספציפיים לסוג התא המתרחשים עם הזדקנות השחלות לפני הזדקנות הרבייה, שיש להם השלכות בטיפול באי פוריות נשית.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא במערכות גוף שעבורן זמין מנהל התקן Cre ספציפי לסוג התא. החלק הקשה ביותר בטכניקה זו הוא בחירת קו Cre מתאים לסוג התא שלך. מומלץ לבצע אימות נרחב של ספציפיות התא.

כדי להתחיל, לאסוף שחלה אחת מהעכבר המתת חסד ב 500 מיקרוליטר של חיץ גרעיני ליזה ולקצוץ את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים מיקרו פתיחה עצמית. מעבירים את השחלה הטחונה ואת חיץ הליזיס לכוס מקפיצים הומוגנייזר על קרח והומוגניים את השחלה 10 עד 20 פעמים עם המזיק הרופף A.מוסיפים 400 מיקרוליטר של חיץ ליזיס למזיק ההומוגנייזר לשטוף את המזיק A.ואז הומוגניזציה של השחלה עם מזיק הדוק B 10 עד 20 פעמים. מעבירים את ההומוגנט לצינור תחתון עגול של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 גרם למשך 1.5 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הרקמה וכלי הדם הלא מנותקים.

לאחר הרטבה מוקדמת של מסננת תאים באורך 30 מיקרומטר עם חיץ ליזה של 100 מיקרוליטר, סננו את הסופרנאטנט דרך המסננת לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. מעבירים את הגרעינים המכילים תערובת לצינור תחתון עגול של שני מיליליטר. צנטריפוגה את הדגימה ב 500 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.

יש להשהות מחדש את כדורית הגרעינים ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח על ידי מערבול קצר במהירות בינונית עד גבוהה. הגדל את עוצמת הקול ל- 1.75 מיליליטר על-ידי הוספת 1.5 מיליליטר של חיץ ליזיס. מערבבים בעדינות ומניחים את תרחיף הגרעינים על קרח למשך חמש דקות.

משחררים את הגרעינים בצנטריפוגה ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. ובזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע את גלולת הגרעינים. השהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של חיץ אחסון קר כקרח ומערבולת לזמן קצר כדי להשהות מחדש לחלוטין את גלולת הגרעינים.

שמור 10% מהגלולה המרחפת מחדש כדגימת גרעיני קלט לניתוח במורד הזרם. קח את משטח הגרעינים המרחף מחדש והשלם את הנפח לשני מיליליטר עם חיץ טיהור גרעיני קר כקרח, או NPB. הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזים מרחפים עבור כל דגימה לתוך צינור תחתון עגול של שני מיליליטר.

לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של NPB ולהשעות היטב על ידי pipetting. הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנאטנט והוציאו את הצינור מהמגנט.

להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים שטופים במיליליטר אחד של NPB. חזרו על שלב השטיפה במשך שלוש כביסות בסך הכל. ואחרי הכביסה הסופית, להשעות מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של NPB.

מוסיפים 30 מיקרוליטר מהחרוזים השטופים לשני מיליליטר של התרחיף הגרעיני ומרחפים היטב את תערובת גרעיני החרוזים על ידי פיפטציה והיפוך עדין של הצינור. מניחים את הצינורות על מיקסר מסתובב בחדר קר או מקרר למשך 30 דקות במהירות נמוכה ודגרים על דגימות הקלט ללא חרוזים באותם תנאים. הניחו את הצינורות עם תרחיף הגרעינים והחרוזים על המגנט למשך שלוש דקות כדי להפריד את גרעיני הביוטינילציה הקשורים לחרוזי סטרפטווידין מהחלק השלילי של הגרעינים.

הסר את supernatant. מעבירים את החלק השלילי לצינור שני מיליליטר טרי ושומרים אותו על קרח. עבור כל צינור שבר חיובי, הסר את הצינור מהמגנט והשהה מחדש את התוכן במיליליטר אחד של NPB.

מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת ומשליכים את הסופרנטנט. השהה מחדש את תערובת גרעיני החרוזים של החלק החיובי ב -30 מיקרוליטר של NPB. מעבירים את השחלה ו-100 מיקרוליטר של חיץ הומוגניזציה לתוך זכוכית מקפיצים הומוגנייזר והומוגניזציה 10 עד 20 פעמים עם המזיק הרופף A.מוסיפים 400 מיקרוליטר של חיץ הומוגניזציה TRAP לשטיפה פסטל A ומעבירים את ההומוגנט לצינור תחתון עגול של שני מיליליטר.

שטפו את ההומוגנייזר עם מיליליטר נוסף של חיץ הומוגניזציה TRAP והעבירו את הנפח השטוף לצינור התחתון העגול של שני מיליליטר. צנטריפוגה הומוגנט ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ומעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור תחתון עגול טרי של שני מיליליטר.

לאחר השלכת הכדור, העבירו 100 מיקרוליטר של ההומוגנט המפונה לצינור תחתון עגול טרי של שני מיליליטר ושמרו אותו כקלט על קרח. דוגרים על שארית ההומוגנט המפונה עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר נוגדן נגד GFP למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. דגרו על דגימת הקלט באותו מצב.

מעבירים 50 מיקרוליטר של חרוזי החלבון G מגנטיים לכל דגימה לתוך צינור תחתון עגול של שני מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה דל מלח לחרוזים ולפיפטה בעדינות לערבוב. הכניסו את הצינור למעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף מיליליטר אחד של חיץ שטיפה דל מלח לצינור. פיפטה בעדינות לערבב. שוב, הכניסו את הצינור למעמד המגנטי וחזרו על השלב במשך שלוש כביסות בסך הכל.

לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של מאגר כביסה דל מלח. מעבירים את החרוזים השטופים המרחפים לתערובת נוגדני דגימת האנטיגן ודגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. לדגור על דגימות הקלט במשך הלילה בתנאים המקבילים.

לאחר מכן, להפריד את החלק החיובי או את החרוזים המגנטיים עם RNA ריבוזומים המטרה מן החלק השלילי או supernatant באמצעות מעמד מגנטי במשך 2.5 עד 3 דקות. שאפו את החלק השלילי. מניחים אותו בצינור תחתון עגול טרי של שני מיליליטר, ומניחים אותו בצד על קרח.

מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ שטיפה עתיר מלח לצינור עם החלק החיובי ופיפטה עדינה לערבוב. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי הנשמר על קרח למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוציאו את הצינור מהמגנט וחזרו על השלב במשך שלוש שטיפות בסך הכל.

לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש את החרוזים ב 350 מיקרוליטר של חיץ RNA ליזה בתוספת 3.5 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול. דוגרים על הצינורות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב במשך 10 דקות ב-900 סל"ד בשייקר דיגיטלי. הפרידו את החרוזים מהתמיסה שמכילה כעת את RNA ריבוזומי המטרה עם מעמד מגנטי למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

אסוף את החלק החיובי המדולל בצינור טרי של 1.5 מיליליטר. הדמיית אימונופלואורסנציה בוצעה על השחלות הפרפיניות של עכברי NuTRAP flox חיוביים של Cyp17-Cre ו- Cyp17-Cre שליליים NuTRAP flox. חלבון EGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני אלקסה 488 חמור נגד עזים, והגרעינים הוכתמו ב- DAPI.

התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 20. הקלט והשבר החיובי TRAP RNA בודדו משחלות עכבר NuTRAP flox חיוביות של Cyp17-Cre ורוצפו באופן קצה זוגי. ניתוח המרכיבים העיקרי של כל הגנים המבוטאים הראה הפרדה בין קלט ה- TRAP לבין שברים חיוביים ברכיב הראשון.

תרשים הר הגעש של גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין הקלט לבין השברים החיוביים מוצג כאן. ההשוואה בין החלק החיובי של TRAP לקלט הראתה העשרה כוללת של הגנים של סמן תאי סטרומה/תקה ודלדול הגנים של סמן הביציות, הגרנולוסה, מערכת החיסון ותאי השריר החלק בחלק החיובי של TRAP. לאחר הצנטריפוגה הראשונה של ההשעיה הגרעינית כדי להסיר כלי דם לא מנותקים, הגרעינים נמצאים בסופרנטנט.

הקפידו לשמור על הסופרנאטנט ולהשליך את הגלולה בשלב זה. בעקבות השיטה השלמה, ניתן לבצע מספר טכניקות אפיגנומיות, כולל בדיקות לנגישות כרומטין או שינויים ב- DNA בין היתר. בעקבות שיטת TRAP, ניתן לבצע ריצוף RT-qCPR או RNA כדי להעריך את הטרנסלטום.

זהו היישום הראשון של שיטת NuTRAP בשחלה העכבר. זה מאפשר ניתוח אפיגנומי ושעתוק בתפוקה גבוהה מסוגי תאי שחלה ספציפיים, אשר עשויים לשמש לחקר הזדקנות השחלות או סרטן.