השתלת צינורית תוך גולגולתית עבור קולטן אנטיגן כימרי טורי (CAR) עירוי תאי T בעכברים
February 24th, 2023
גידולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן בקרב ילדים, וטיפולים מבוססי מערכת החיסון נבדקים יותר ויותר עבור חולים בניסויים קליניים. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשתלת צינורית לוקו-אזורית בעכברים לצורך הערכה פרה-קלינית של עירויים אימונותרפיים המכוונים לגידולים במערכת העצבים המרכזית.
פרוטוקול זה משכפל מערכת צנתרים תוך-חדרית המשמשת בניסויים קליניים מתמשכים לבדיקת אספקה אזורית מקומית של טיפול CAR T-cell המכוון נגד גידולים במערכת העצבים המרכזית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לספק מינונים חוזרים מרובים של טיפול מקומי אזורי CAR T-cell מבלי לבצע הליכים כירורגיים פולשניים מרובים. מערכת זו יכולה לשמש לחקר טיפולים שונים באתרי לידה שונים, ובכך עשויה לספק תובנה למספר עצום של תחומי מחקר במדעי המוח.
כדי להתחיל, הניחו את העכבר המרדים עם הראש המגולח על שולחן הניתוחים ופתחו בעדינות את תחתית הזרוע הסטריאוטקטית באמצעות מרית. מכניסים את הצינורית במלקחיים ומהדקים אותה על ידי הידוק הבורג על הזרוע עד שחצי עד שני שלישים מחלק הפלסטיק הלבן וחמישה מילימטרים של הצינורית בולטים מתחתית הפתח. הכנס ואבטח את שיניו העליונות של העכבר בסרגל הנשיכה של המנגנון הסטריאוטקסי.
משוך את חרוט האף קדימה והדק אותו, וודא שהעכבר שואף איזופלורן. לאחר מכן, הרכיבו את העכבר על המנגנון הסטריאוטקסי המחומם באמצעות אזיקי אוזניים או מוטות אוזניים, תוך הימנעות מלחץ מוגזם. לחטא את אתר הניתוח ולבצע חתך מקביל לגולגולת כמתואר בכתב היד.
השתמשו במקלוני צמר גפן כדי להרחיק את הפאשיה. זהה את ציוני הדרך, bregma ו lambda על הגולגולת המתאימה סימנים קדמיים ואחוריים שבו לוחות הגולגולת נפגשים. כדי ליצור משטח לחיבור האקריל, צרו בעדינות מספר חריצים לרוחב הגולגולת באמצעות אזמל.
באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית, למקם את הצינורית לנקודת ציון של עניין. הרם את קצה הצינורית מילימטר עד שני מילימטרים מעל פני הגולגולת ועבור לקואורדינטות הרצויות. באמצעות מחט 18 מד או מקדחה כירורגית, לעשות שני חורי בורג על הגולגולת החשופה הרחק מהמקום שבו הצינורית נכנסת, להבטיח מספיק מקום עבור הצינורית.
סובבו את המקדחה דרך חור הבורג עד שהיא מתחברת לגולגולת. בעזרת מברג בעל קצה שטוח, הכנס והדק שני ברגים לתוך החורים. לאחר מכן, משכו בעדינות את הבורג כלפי מעלה כדי לוודא שהוא מאובטח.
להחדרת צינורית יש ליצור חור בגולגולת בקואורדינטות שזוהו באמצעות מחט 18 מד או מקדחה כירורגית. באמצעות הזרוע הסטריאוטקטית, מורידים את הצינורית לקואורדינטת DV הרצויה. בכ-0.3 גרם אבקת שרף אקרילי ו-10 עד 15 טיפות נוזל בצלחת חרסינה בעלת 12 בארות, מעמיסים את החומר הצמיגי המוכן בצבע לבן לתוך מזרק של מיליליטר.
מצפים את הגולגולת וממלאים את החללים סביב הצינורית והבורג. שחררו את הבורג על הזרוע הסטריאוטקטית בזמן שהמלט גמיש. השתמש בעדינות במרית כדי לשחרר את הצינורית מהמחזיק בפתח התחתון ולמשוך את הזרוע הסטריאוטקטית הרחק מהעכבר.
לאחר ייבוש הצמנט, הכניסו את צינורית הדמה לצינורית המנחה וסובבו עם כיוון השעון כדי לאבטח אותה היטב. לאחר השלמת ההליך, להחזיר את העכבר לכלוב הביתי המחומם שלו להתאוששות. כדי להכין את צינורית הטיפול, הכנס את החלק העליון שלה לתוך צינורות PKG.
לאחר מכן, מלא את מזרק הטיפול בתרחיף תאי CAR T והכנס אותו דרך הקצה השני של צינור PKG, המכסה את החלק העליון של צינורית הטיפול. לאחר הרדמת העכבר, תקן את צינורית המדריך בבסיס באמצעות מלקחיים. שחררו את הברגים והוציאו את צינורית הדמה, ואפשרו גישה לצינורית המנחה.
החדירו את תאי ה-CAR T למשך דקה אחת והחזיקו את צינורית הטיפול במקומה למשך דקה נוספת. לאחר הסרת צינורית הטיפול, יש להבריג חזרה צינורית דמה בחוזקה. לאחר מכן, לנהל meloxicam תת עורית עבור שליטה בכאב.
הטיפול בתאי CAR T המכוון GPC2 גרם לרגרסיה משמעותית של הגידול במדולובלסטומה והאריך משמעותית את ההישרדות במודל גליומה של קו האמצע התלמי. בעת החדרת הצינורית המנחה למיקום תוך גידולי, חשוב להבין כי הקואורדינטות הגב-גחון עשויות להיות שטחיות יותר מהזרקת הגידול על מנת להסביר את אורכי הקרנת הצינורית הדמה והטיפול.
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה להשתלת קנולה לוקו-אזורית בעכברים, המאפשרת הערכה פרה-קלינית של חדירות אימונותרפיות הממוקדות לגידולי מערכת העצבים המרכזית. הטכניקה מאפשרת מתן מינונים חוזרים של טיפול בתאי T-CAR ללא צורך בניתוחים פולשניים מרובים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- אימונותרפיה
רקע
- גידולי מערכת העצבים המרכזית הם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן אצל ילדים.
- טיפולים חיסוניים מקומיים מאזוריים נבדקים בניסויים קליניים.
- טיפול בתאי T-CAR מראה הבטחה במיקוד לגידולי מערכת העצבים המרכזית.
- פרוטוקול זה משכפל מערכת קטטר תוך-חדרי המשמשת בניסויים קליניים מתמשכים.
מטרת המחקר
- להעריך את היעילות של טיפול בתאי T-CAR במודל פרה-קליני.
- לספק שיטה למתן מקומי אזורי של טיפולים.
- כדי למזער את הפולשניות של טיפולים חוזרים במודלי בעלי חיים.
שיטות ששימשו
- השתלת קנולה באמצעות מנגנון סטריאוטקטי.
- מתן טיפול בתאי T-CAR דרך הקנולה המושתלת.
- שימוש בהרדמה וטכניקות כירורגיות כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים.
- מעקב אחר תגובת הגידול והתוצאות לגבי הישרדות לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- הטיפול בתאי T-CAR שמופנה ל-GPC2 גרם לנסיגה משמעותית של הגידול.
- ניתן היה להבחין בהארכת הישרדות משמעותית במודל הגליומה המפוזרת התלמית.
- השיטה מאפשרת מתן מדויק של הטיפול לאזורים ממוקדים.
- התובנות שהושגו עשויות להעיד על מחקרים עתידיים במדעי המוח ובאונוקולוגיה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק כלי חשוב לחקר גידולי מערכת העצבים המרכזית.
- הוא משפר את ההבנה של יעילות טיפול בתאי T-CAR.
- הגישה עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות לגידולי מערכת העצבים המרכזית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Serial intracranial cannula implantation enables repeated locoregional CAR T cell delivery in preclinical CNS tumor models, directly addressing the challenge of evaluating immunotherapies in anatomically relevant, disease-relevant systems. This approach increases predictive confidence for translational advancement by mirroring clinical catheter-based delivery and supporting robust, quantitative assessment of therapeutic regimens. The platform is strategically positioned to inform target validation and dosing strategies for pediatric and adult CNS oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of CAR T cell efficacy against validated CNS tumor antigens in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by isolating locoregional effects and minimizing systemic confounders.
- Facilitates iterative hypothesis testing for target engagement and tumor response.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for serial dosing and response measurement.
- Enables quantitative assessment of tumor regression and survival following repeated CAR T cell infusions.
- Supports assay development for evaluating delivery site-specific therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical delivery methods with clinical catheter-based protocols for translational continuity.
- Allows for risk-adjusted advancement decisions based on robust, serial in vivo data.
- Supports biomarker and pharmacodynamic studies in orthotopic CNS tumor models.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling serial, site-specific immunotherapy delivery in orthotopic CNS tumor models, supporting lead identification and translational assessment.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of CAR T cell constructs and tumor antigen targets in vivo.
- Screening: Standardizes repeated dosing and quantitative tumor response measurement for candidate prioritization.
- Analytics: Provides survival and tumor regression data for comparative analysis across regimens and delivery sites.
- Translational Research: Mirrors clinical catheter-based delivery, supporting preclinical-to-clinical workflow alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable for testing diverse cell therapies and novel agents in CNS disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS immunotherapy studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable serial dosing in preclinical models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency for CNS oncology programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and small animal CNS procedures.
- Demands access to stereotactic apparatus, surgical tools, and analytical infrastructure for tumor monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dosing, infusion protocols, and response criteria.
- Adaptable to various CNS tumor models and delivery coordinates with protocol optimization.
- Dependent on precise anatomical targeting and post-surgical animal care for reproducibility.
