יצירת אורגנואידים פונקציונאליים בכבד אנדודרמלי

מטרת המחקר שלנו היא לפתח מודלים רלוונטיים לכבד במבחנה לבדיקות יעילות ובטיחות תרופות, תוך חיקוי הדוק של רקמות כבד בריאות וחולות במחקרים פרה-קליניים. שכפול מורכבות כבד מלאה, השגת פונקציונליות לטווח ארוך, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים והרחבת ייצור האורגנואידים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה נותרו אתגר ניסיוני מרכזי במחקר אורגנואידים. לאחרונה דגמנו פיברוזיס בכבד מאורגנואידים בריאים בכבד וביססנו מודלים של מחלות נדירות בכבד, כולל ציטרולינמיה ומחסור בפירובט קרבוקסילאז, מתאים שמקורם בחולה. בניגוד לשיטות אחרות, פרוטוקול ה-eHEPO שלנו מספק אורגנואידים פונקציונליים בכבד במהירות ובקנה מידה גדול, ותומך בפונקציונליות ארוכת טווח ובבדיקות מרובות מאוכלוסייה התחלתית עקבית אחת.

[קריין] כדי להתחיל, הוסף 6 מיליליטר DMEM/F-12 קר לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף מיד 80 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף FOD או BMM לצינור וערבב היטב. מצפים צלחת באר שטופלה בתרבית רקמות בתמיסת BMM ומוציאים את התמיסה לכיסוי פני צלחת הבאר. דגרו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. קח תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה או צלחת IPSC ושאף את המדיום הספציפי ל-IPSC. שטפו את הצלחת עם DMEM/F-12 או DPBS והוסיפו 1 מיליליטר של האנזים הספציפי לבאר אחת של צלחת של 6 בארות. לאחר דגירה של דקה אחת, שאפו את האנזים ודגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שבע דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של מדיום IPSC מחומם מראש לצלחת והקש בעדינות על הצד כדי לנתק את אגרגטים המושבות הלא מובחנים מפני השטח של הצלחת. מערבבים בעדינות את התרחיף עם פיפטה סרולוגית של 5 מיליליטר, ולאחר מכן זורעים את תרחיף התאים בצפיפות הרצויה על הבאר המצופה BMM. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים כדי להגיע למפגש של 70%. החלף את מדיום ה-IPSC במדיום האנדודרם לפני תחילת ההתמיינות. התאים מקבלים צורה קוצנית לאחר ההתמיינות, מה שמעיד על אינטראקציה בין תא לתא. שוטפים את תאי האנדודרם עם PBS. מוסיפים 300 מיקרוליטר טריפסין. ודגרו על התאים במשך חמש דקות בחממה. הוסף 3 מיליליטר DMEM/F-12 קר לתאים ופיפטה עם קצות מסנן של 1,000 מיקרוליטר ליצירת תאים בודדים. אוספים את תרחיף התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומצנטריפוגה את התאים ב-300 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם 10 מיליליטר של מאגר FACS. כדי ליצור מתלה חד-תא, סנן את התאים עם מסננת רשת של 100 מיקרומטר ולאחר מכן עם מסננת רשת של 40 מיקרומטר לפני צנטריפוגה של מתלה התא למשך חמש דקות. השעו מחדש 15 מיליון תאים עם 105 מיקרוליטר של מאגר FACS והוסיפו 45 מיקרוליטר של FcR ו-15 מיקרוליטר של EpCAM למתלים. דגרו על התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והגנו על הצינור מפני אור. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר FACS כדי לשטוף את מתלה התא. לאחר צנטריפוגה של התאים, השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS והוסיפו 0.5 מיקרו-מולרית למיליליטר DAPI לתרחיף התאים כדי לכמת את התאים המתים. לאחר מיון התאים, צנטריפוגה את התאים ב-300 x גרם למשך חמש דקות. הסר את ה-supernatant. ולהשעות מחדש 3,000 עד 5,000 תאים ב-20 מיקרוליטר של BMM. זרעו את התאים על ידי הוספת טיפת BMM למרכז כל צלחת של 48 בארות, ודגרו על התאים במשך שתי דקות ב-37 מעלות צלזיוס עד שה-BMM מתמצק. שכבו את הטיפה עם מדיום ההרחבה. כדי לפצל את טיפת האורגנואיד, השליכו את המדיום האורגנואיד והוסיפו לבאר 500 מיקרוליטר של Ad-DMEM/F-12 קר. השתמש בקצות מסנן של 1,000 מיקרוליטר כדי להזרים את טיפות ה-BMM במרץ. אסוף מקסימום 10 טיפות BMM לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר והוסף 5 מיליליטר Ad-DMEM/F-12 קר. הניחו את הצינור על קרח למשך שלוש עד חמש דקות. צנטריפוגה של התאים ב-200 x g למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט עד שנותר מיליליטר אחד של הסופרנטנט. פיפטה נמרצת את כדור התא 30 עד 40 פעמים באמצעות קצות סינון של 200 מיקרוליטר. לאחר דיסוציאציה מכנית, הוסף 5 מיליליטר של Ad-DMEM/F-12 קר לפני צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט. והניחו את המתלה על קרח. זרע טיפת BMM של 50 מיקרוליטר. ולהוסיף 25 ננוגרם למיליליטר BMP7 למדיום ההתפשטות. לאחר תרבית של שלושה ימים, החלף את המדיום במדיום ההתמיינות ותרבית את התאים למשך 14 יום לפחות. בוצע ניתוח צביעה חיסונית כדי לאמת אם האורגנואידים שמקורם בתאי EpCAM+ מחויבים לשושלת הכבד. נוכחותם של תאי CK19+ ו- HNF4ɑ+ מצביעה על כך שתאי אב של הפטובלסט ודרכי המרה נמצאים באורגנואידים. בנוסף, אורגנואידים המבטאים סמני רקמת אפיתל, כגון תאי E-CAD+ ותאי אפיתל קוביים או רב-ממדיים המבטאים ZO-1, מצביעים על נוכחות של צמתים הדוקים בין התאים. אימונוהיסטוכימיה גילתה שתאי E-CAD+ הראו מבנה אפיתל מצולע, המשקף פנוטיפ דמוי הפטוציטים. תמונות מיקרוסקופ אלקטרוני השידור של eHEPOs מוצגות כאן. העיגולים הלבנים מציינים את מתחמי הצומת הבין-תאיים. החצים השחורים מראים התמיינות פני השטח האפיקליים. והחץ האדום מראה חתך רוחבי של מיקרוווילי. ניתוח qPCR הראה כי אורגנואידים השיגו סמני הפטוציטים בוגרים כגון ALB, A1AT, CYP3A4 ו-CYP3A7. אזור מוכתם בוורוד בצביעת PAS מעיד על יכולת אחסון הגליקוגן של אורגנואידים. בנוסף, הניתוח שלנו הראה את יכולתם של האורגנואידים להפריש ALB למצע התרבית, לסלק אמוניה ממצע התרבית, פעילות האנזים CYP3A4 ויכולת הובלת חומצות מרה.