יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus
24 במרץ 2023
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.
פרוטוקול זה מייצר עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ומערכת RNA חד-מנחה הקשורה לווירוסים הקשורים לאדנו. הוא כולל טכניקה כירורגית כדי לנהל בבטחה AAV לתוך השומן החום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה ליצור במהירות נוקאאוטים ספציפיים לרקמות ללא צורך לגדל עכברים באופן סלקטיבי.
הגישה להכנת נוקאאוט ספציפי לרקמות או הפלות יכולה להיות מותאמת לרקמות אחרות אם ההליך הכירורגי להזרקת AAV משתנה על בסיס איבר היעד. כדי להתחיל, לנהל את משכך כאבים תת עורית לעכבר UCP1 Cre Cas9 מורדם כדי למזער ולמנוע כאב ומצוקה לאחר הניתוח. לאחר מכן יש לגלח את הפרווה על האזור הבין-סקפולרי שלה באמצעות מכונת גילוח, ולעקר את אזור הניתוח עם לפחות שלושה סיבובים לסירוגין של פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין, ואחריו 70% אתנול.
באמצעות אזמל, לבצע חתך של שני סנטימטרים בעור מעל רקמת השומן החומה בין עצם השכמה כדי לחשוף את השומן interscapular. לאחר ביצוע חתך יחיד, לחתוך את רקמות השומן על הגבול בין האזור הדיסטלי של רקמות השומן והשרירים. לאחר מכן בעזרת המספריים הכירורגיים ביד הדומיננטית, מקלפים את רקמות השומן בצורה בוטה ואנכית כדי לחשוף את רקמת השומן החומה תוך צביטת רקמות השומן, כולל רקמת השומן החומה, ביד הלא דומיננטית.
השתמש בווריד של זולצר כציון דרך כדי לציין את המיקום המדויק של רקמת השומן החומה. לאחר מכן, עבור כל עכבר, הזריקו 20 מיקרוליטר של וירוס הקשור לאדנו או AAV באיטיות לכל אונה של שתי רקמות השומן החומות באמצעות מחט חדה, 32 מד, המחוברת למזרק המילטון 100 מיקרוליטר. יש לוודא שההזרקה המוצלחת מסומנת בכך שאין דליפות מהאתר המוזרק במהלך מתן ה-AAV.
לאחר הבטחת הומאוסטזיס, החזירו את רקמות השומן החשופות למקומן הרגיל כדי לתפור את קצה רקמות השומן והשריר באמצעות חוט מונופילמנט נספג 5-0. לבסוף, תפרו את העור הפתוח בחוטים קלועים לא צבועים 5-0 VICRYL מצופים. לא ניתן לזהות את מיקומה המדויק של רקמת השומן החום מבלי לחשוף אותה, אולם חשיפה עודפת פוגעת ברקמה.
הפגמים הפוטנציאליים שאולי הובילו להזרקות לא מוצלחות כללו הזרקת תמיסת AAV לאזור הלא נכון, חדירת מחט דרך הרקמה, ובלון רקמה עקב נפח מוגזם של תמיסת AAV. ההעברה המדויקת של RNA מנחה יחיד AAV לרקמת השומן החומה הייתה חיונית להצלחת הפרוטוקול. המפתח להצלחה בחשיפת רקמת השומן החומה הוא טכניקת מספריים כירורגית, כולל כיוון ועומק המספריים, ומיקום מזרק המילטון.
לטכניקה זו יש חיות נוקאאוט ספציפיות לרקמות המייצרות עומסים כדי להבין את הרגולטורים המולקולריים של מטבוליזם האנרגיה הקשור לשומן חום.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת עכברים עם נוק-אאוט (knockout) ספציפי לרקמה שומנית חומה (BAT), תוך שימוש בשילוב של טכניקות Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-single-guide RNA המועבר באמצעות נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV). באמצעות שימוש בשיטות אלו, חוקרים יכולים ליצור במהירות נוק-אאוט ספציפי לרקמה ללא צורך ברבייה סלקטיבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- גנטיקה
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- רקמה שומנית חומה היא חיונית למטבוליזם של אנרגיה.
- יצירת נוק-אאוטים (knockouts) ספציפיים לרקמה מסייעת בהבנת תהליכים ביולוגיים.
- ניתן להתאים שיטה זו פוטנציאלית לרקמות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יישום של גישות Cre-LoxP ו-CRISPR-Cas9.
- מודל עכבר שנעשה בו שימוש: עכברי UCP1 Cre Cas9.
- מתן AAV-sgRNA באמצעות מיקרו-הזרקה כירורגית.
תוצאות עיקריות
- מיקוד מוצלח וביטול (knockout) של רקמת שומן חומית.
- הוכחת יעילות של AAV בעריכה גנטית ספציפית לרקמה.
- תיקוף טכניקות כירורגיות מרכזיות להחדרה מדויקת.
מסקנות
- המחקר מציג טכניקה מהירה ליצירת מודלים של נוק-אאוט (knockout) הרלוונטיים למטבוליזם של שומן חום.
- הוא משפר את ההבנה של רגולטורים מולקולריים במטבוליזם של אנרגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
יצירה מהירה של עכברי knockout ספציפיים לרקמה שומנית חומה (BAT) באמצעות שילוב של טכנולוגיות Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA מאפשרת האצה של גנומיקה פונקציונלית במחקר מטבולי. גישה זו מייעלת את התיקוף של המטרות ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים עבור גנים המעורבים בוויסות אנרגיה, ומקצרת את זמני המחזור בהשוואה להכלאה מסורתית. השיטה תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת תובנות ספציפיות לרקמה, החיוניות לשלבי הגילוי המוקדמים ולהמשכיות תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של תפקוד גנים ב-BAT לקבלת בהירות מכניסטית.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד השפעות גנטיות ברקמה הרלוונטית למחלה.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרות להפרעות מטבוליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מודלים מאושרים של knockout לסריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מייצב רקעים גנטיים לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאיץ את פיתוח הבדיקה על ידי עקיפת מחזורי רבייה ממושכים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרנת מודלים פרה-קליניים עם מנגנוני מחלות מטבוליות בבני אדם באמצעות עריכה גנטית ספציפית לרקמת BAT.
- מאפשר קידום מותאם סיכון באמצעות הבהרת התרומה של הגן למטבוליזם של אנרגיה.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במחקר מטבולי.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת בשלבים המוקדמים של הגילוי ותיקוף המטרה, ומספקת גשר לפיתוח מודלים פרה-קליניים עבור פורטפוליו של מחקרים מטבוליים ואנדוקריניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בבקרת אנרגיה המתווכת על ידי BAT.
- סריקה: מספק מודלי knockout הניתנים לשחזור עבור בדיקות פנוטיפיות כמותיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של השפעות ספציפיות לגנים על תפוקות מטבוליות in vivo.
- מחקר תרגומי: מסייע בהתאמת מודלים פרה-קליניים לביולוגיה של BAT בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול ניתן להתאמה לרקמות אחרות על ידי שינוי ההגשה של AAV, מה שתומך בתועלת רחבה יותר עבור מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את יצירת המודלים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) והקצאת משאבים יעילה מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מטרות מטבוליות ואנדוקריניות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית כירורגית ובמיקום אנטומי של BAT.
- נדרשת גישה לתשתיות לייצור AAV ולהנדסה גנטית באמצעות CRISPR-Cas9.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך שחזור התוצאות.
- נדרשת התאמה של הפרוטוקול עבור מיקוד ברקמות או באיברים אחרים.
- ההצלחה תלויה בהחדרה מדויקת של AAV ובצמצום נזקי הרקמה.
