Name: בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: למדו שיטה יעילה לבידוד תאי אפיתל קשבי ראשוניים מרקמת ריאה אנושית לצורך הקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל. השיטה מאפשרת מחקר מדויק של תפקודי תאי דרכי הנשימה במחלות ובבריאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקרים המשתמשים במודל המתואר בתרומה זו נתמכו על ידי מגוון ארגוני מימון, כולל קרן הריאות הולנד, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות (ZonMw, מענק MKMD COVID-19), האגודה ההולנדית להחלפת ניסויים בבעלי חיים (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), כמו גם מענקי מחקר מחברות כמו Boehringer Ingelheim ו- Galapagos. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים רלוונטיים.

תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה במגוון מחלות ריאה חריפות וכרוניות תואר בסקירות שונות 1,2,3,4,5,6,7. תרביות ממוינות היטב של תאי אפיתל בדרכי הנשימה הן כלי חשוב לפענוח תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה. ממשק אוויר-נוזל (ALI) תרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה מיושמת באופן נרחב כדי לקדם את ההתמיינות של תאי אפיתל בסיסיים של דרכי הנשימה ובכך לחקור את אפיתל דרכי הנשימה באופן אמין במבחנה 8,9. בשנים האחרונות, השימוש במודלים כאלה גדל עוד יותר כתוצאה מיוזמות מחקר חדשות הקשורות למגפת הקורונה ומעבר עולמי למחקר ללא בעלי חיים. לכן, השימוש המוגבר בקו תאי מודל זה מדגיש את הצורך בשיתוף נהלים וחוויות כדי להשיג תוצאות חזקות. זה יאפשר גם השוואת תוצאות בין קבוצות מחקר. החוסן של ההליך הוא מאפיין המפתח ולכן צריך להיות נתון לבקרת איכות. מספר מעבדות השקיעו בפיתוח פרוטוקולים לגידול תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה ב-ALI. ניתן להפחית את הזמן, המאמץ והתקציב הנדרש כאשר נהלים אלה משותפים בפירוט. פרטים אלה כוללים, למשל, את הבחירה של פלסטיק תרבית תאים ומדיה שסופקו על ידי יצרנים שונים, שכן זה נמצא להשפיע על המאפיינים של התרביות שהתקבלו10,11,12. זה מדגיש את החשיבות של שיתוף חוויות ופרטים של נהלי תרבות, שכן בהיעדר תובנות כאלה, התוצאות עשויות להיות מושפעות ו / או מאמצי אימות במעבדות שונות עלולים להיפגע.
אפיתל הריאה האנושי מורכב מסוגי תאים שונים, כולל סוגים עיקריים כגון תאי בסיס, תאים ריסונים, תאי גביע ותאי מועדון. על מנת לחקות באופן אמין את שכבת תאי האפיתל בדרכי הנשימה במבחנה, סוגי תאים אלה צריכים להיות מיוצגים במודלים של תרבית, והקיטוב והתפקוד שלהם נשמרים13,14,15,16. ההבנה כי מאפייני התורם (כולל מצב המחלה) והמקור האנטומי של התאים (כלומר, האף, קנה הנשימה, דרכי הנשימה הגדולות והקטנות) עשויים להשפיע על הרכב התאים ועל התגובות התפקודיות של תרבית התאים חשובה לא פחות. מומחיות ופרקטיקה רלוונטיות הן תנאי מוקדם לתרבית מוצלחת של תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה ולהעריך את איכות התרבית הן באופן אינטואיטיבי (על ידי בדיקה חזותית במהלך התרבית) והן כמותית. מטרת תרומה זו היא לספק שיטה חסכונית וחסכונית בזמן לבידוד ולתרבית של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות האנושיים (PBECs) שניתן ליישם גם בתרבית של תאי אפיתל קנה הנשימה ודרכי נשימה קטנות. בנוסף לתיאור שיטה לבידוד תאים כאלה מרקמת ריאה שנכרתה, מוצגת ונדונה שיטה להרחבה וביו-בנקאות, ולבסוף להקמה ואפיון של תרבית ALI מובחנת היטב בתוך עלות ופרק זמן סבירים.

<table><tbody><tr><td>נגד בדיקה של 1,000 אוהם</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>משמש לכיול EVOM2 Epithelial Voltohmmeter</td></tr><tr><td>4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23)</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>בשימוש במדיום cBD</td></tr><tr><td>6-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>משמש בשלב הראשון לגידול התאים המבודדים מהסימפונות טבעת&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת מדיום לצמיחת תאי אפיתל בדרכי הנשימה</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>משמש להשוואה לאמבט</td></tr><tr><td>חרוזים בינוני cBD 20 ליטר</td><td>שריון מעבדה</td><td>74220-720</td><td>משמש לחימום מראש של פתרונות תרבית תאים</td></tr><tr><td>BEGM BEGM Bynchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>משמש להשוואה ל-cBD בינוני</td></tr><tr><td>אלבומין בקר שבר V (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>משמש בתמיסת ציפוי</td></tr><tr><td>תמצית יותרת המוח בקר (BPE)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td> משמש בתוסף צמיחת תאי אפיתל <td>הסימפונות c-KSFM</td></tr><tr><td>(BEpiCGS)</td> <td>מעבדות מחקר ScienCell</td><td>3262</td><td>בשימוש במדיום cBD</td></tr><tr><td>תאי אפיתל סימפונות בינוני-בסיסי (BEpiCM-b)</td> <td>מעבדות מחקר ScienCell</td><td>SCC3211-b</td><td>בשימוש במדיום</td></tr> <tr><td>cBDמוסיף תרבית תאים; Transwell 12 מ"מ עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליאסטר קרום</td><td>הכנס קורנינג</td><td>3460</td><td>מוסיף תרבית תאים המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>מוסיף תרבית תאים; 12 בארות מוסיף, 0.4 ומיקרו; m PET clear</td><td>CellQART תוצרת SABEU</td><td>9310412</td><td>מוסיף תרבית תאים המשמש להשוואה עם מוסיף תרבית תאים של קורנינג</td></tr><tr><td>מוסיף תרבית תאים; 12 בארות ThinCert מוסיף תרבית תאים</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>מוסיף תרבית תאים המשמש להשוואה עם מוסיף תרבית תאים של קורנינג</td></tr><tr><td>בקבוק CELLSTAR, TC, PS, 250 מ"ל, 75 ס"מ2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>משמש להרחבת תאי המספר</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>תוכנה לניתוח נתוני qPCR שנוצרו עם מערכת CFX384</td></tr><tr><td>CFX384 מגע מערכת זיהוי PCR בזמן אמת</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484 מערכת</td><td>זיהוי qPCR</td></tr><tr><td>סט אלקטרודות צ'ופסטיק</td> World <td>Precision Instruments</td><td>STX2</td><td>משמש למדידת התנגדות חשמלית בחממת ALI-PBEC</td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>חממת תרבית תאים המשמשת לתרביות תאים חופשיות ממיקופלזמה</td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>חממת תרבית תאים המשמשת לתרביות תאים נגועות במיקופלזמה</td></tr><tr><td>מיכל Coolcell</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>משמש לשימור תאים בהקפאה ב-80 מעלות; C לפני העברה לנוזל N2</td></tr><tr><td>Countess 3 מונה תאים אוטומטי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>משמש לספירת תאים וקביעת ריכוז</td></tr><tr><td>התאים Cryovials</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td>משמש להקפאת תאים</td></tr><tr><td>ב-D-Glucose</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>משמש בטריפסין רך</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>משמש במדיום הקפאת תאים</td></tr><tr><td>dNTP (10 מ"מ)</td> <td>Promega</td><td>U1515</td><td>משמש בסינתזה של מדיום</td></tr><tr><td>הנשר השונה של cDNA Dulbecco (DMEM) + 4500 מ"ג/ליטר D-גלוקוז</td><td>טכנולוגיות STEMCELL</td><td>36250</td><td>בשימוש במדיום cBD</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם L-גלוטמין</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td><td>משמש במדיום cBD להשוואה עם DMEM מיצרנים אחרים&nbsp;</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>41966029</td><td>משמש במדיום cBD להשוואה עם DMEM מיצרנים אחרים&nbsp;</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>בשימוש בחומצה c-KSFM</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)</td> <td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>בשימוש בטריפסין רך</td></tr><tr><td>EVOM2 Epithelial Voltohmmeter</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>בשימוש עם אלקטרודת צ'ופסטיק למדידת התנגדות חשמלית בתמיסת פיברונקטין ALI-PBEC</td></tr><tr><td>, אנושי&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>משמש בתמיסת ציפוי</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>בשימוש במדיום cBD</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>ScienCell מעבדות מחקר</td><td>SCC0313</td><td>משמש להמסת פרוטאז XIV&nbsp;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>qPCR מגיב</td></tr><tr><td>איזופרוטרנול הידרוכלוריד, (-)-</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I-6504</td><td>בשימוש ב-c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>בשימוש ב-c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>מערכת בידוד RNA אוטומטית</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA ערכת רקמות</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>משמש לבידוד RNA כולל עם מכשיר Maxwell RSC</td></tr><tr><td>M-MLV Reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>משמש בסינתזה של cDNA</td></tr><tr><td>M-MLV REVERSE TRANSCRIPTASE 5X מאגר תגובה</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>משמש בסינתזה של cDNA</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>משמש לאיתור נוכחות של מיקופלזמה בדגימות תרבית תאים</td></tr><tr><td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>בשימוש במדיום cBD</td></tr><tr><td>Oligo(dT)15</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>משמש בסינתזה של תמיסת cDNA</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (Pen/Strep)</td><td>מעבדות המחקר של ScienCell</td><td>SCC0513</td><td>משמש כאנטיביוטיקה ב-c-KSFM ו-cBD מדיום</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS)</td><td>LUMC בית מרקחת</td><td>N/A</td><td>משמש בשלבים שונים של הפרוטוקול</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td><td>משמש לגידול תאים בשלב ההתמיינות להשוואה למדיום cBD</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td><td>משמש לגידול תאים בשלב השקוע להשוואה למדיום cBD</td></tr><tr><td>פריימר, ATP5B, קדימה</td><td>DNA משולב טכנולוגיות</td><td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטידים: פריימר TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>, ATP5B,</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> הפוכות <td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>פריימר, FOXJ1, קדימה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1,</td><td>הפוך טכנולוגיות DNA משולבות</td> N<td>/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: פריימר TTGGTCCCAGTAGTTCCAGG</td></tr>, <tr><td>MUC5AC, קדימה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>פריימר, MUC5AC,</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> הפוכות N<td>/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: פריימר TCTCGGTGACAACGAAAG</td></tr><tr><td>, MUC5B, קדימה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> N<td>/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: פריימר GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>, MUC5B, </td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> הפוכות <td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: AGGATGGTCGTGTTGATGCG</td></tr><tr><td>פריימר, RPL13A, קדימה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>פריימר, RPL13A,</td><td>הפוך טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: CGGGAAGGGTTGGTGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>פריימר, SCGB1A1, קדימה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td>רצף נוקלאוטידים N/A: פריימר ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>, SCGB1A1, הפוך</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>פריימר, TP63, טכנולוגיות</td><td>DNA משולבות</td> קדימה <td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>פריימר, TP63,</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> הפוכות <td>N/A</td><td>רצף נוקלאוטיד: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>משמש כחומר אנטי-מיקרוביאלי נגד חיידקים, מיקופלזמה ופטריות במדיום c-KSFM</td></tr><tr><td>פרוטאז XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>משמש לטיפול אנזימטי במעכב</td></tr><tr><td>RNAsin Recombinant Ribonuclease</td><td>טבעת</td> הסימפונות Promega <td>N2515</td><td>משמש בסינתזה של</td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה cDNA ( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>משמש לעיכוב פעולתו של טריפסין רך</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>משמש בסינתזה של</td></tr><tr><td>רקמת cDNA SAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>מערכת העברת ואקום לדגימות ביולוגיות</td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפאן</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>משמש לספירת תאים חיים ומתים&nbsp;</td></tr><tr><td>טריפסין 1:250</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>27250-018</td><td>משמש בתמיסת קולגן טריפסין רכה</td></tr><tr><td>מסוג I (PureCol)</td> <td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>משמש בתמיסת ציפוי</td></tr><tr><td>מיכל אוניברסלי, PP, עם מכסה בורג PE</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>משמש בפרוטוקול לטיפול בפרוטאז XIV בטבעת הסימפונות</td></tr></tbody></table>

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

שכבת תאי האפיתל של דרכי הנשימה מהווה את המחסום הראשון בין רקמת הריאה לסביבה החיצונית ולכן היא חשופה כל הזמן לחומרים נשאפים, כולל גורמים זיהומיים ומזהמי אוויר. שכבת האפיתל של דרכי הנשימה ממלאת תפקיד מרכזי במגוון רחב של מחלות ריאה אקוטיות וכרוניות, וטיפולים שונים המכוונים לאפיתל זה ניתנים בשאיפה. הבנת תפקידו של אפיתל בפתוגנזה וכיצד ניתן למקד אותו לטיפול דורשת מודלים חזקים ומייצגים. מודלים של תרביות אפיתל חוץ גופיות נמצאים בשימוש הולך וגובר ומציעים את היתרון של ביצוע ניסויים בסביבה מבוקרת, חשיפת התאים לסוגים שונים של גירויים, רעלים או גורמים זיהומיים. לשימוש בתאים ראשוניים במקום בקווי תאים אימורטליים או סרטניים יש יתרון בכך שתאים אלה מתמיינים בתרבית לשכבת תאי אפיתל מקוטבת פסאודוסטראטית עם ייצוג טוב יותר של האפיתל בהשוואה לקווי תאים.
מוצג כאן פרוטוקול חזק, שעבר אופטימיזציה בעשורים האחרונים, לבידוד ותרבית של תאי אפיתל בדרכי הנשימה מרקמת הריאה. הליך זה מאפשר בידוד מוצלח, הרחבה, תרבית והתמיינות ליחה של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות (PBECs) על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל (ALI) וכולל פרוטוקול לביו-בנקאות. כמו כן, מתואר אפיון תרביות אלה באמצעות גנים של סמן ספציפי לתא. תרביות ALI-PBEC אלה יכולות לשמש למגוון יישומים, כולל חשיפה לעשן סיגריות שלמות או מתווכים דלקתיים, ותרבית משותפת / זיהום עם וירוסים או חיידקים. 
הפרוטוקול המובא בכתב יד זה, הממחיש את ההליך באופן שלב אחר שלב, צפוי לספק בסיס ו/או התייחסות למעוניינים להטמיע או להתאים מערכות תרבות כאלה במעבדתם.

התרחבות באמצעות תרבות שקועה באמצעות השיטה המוצגת כאן, ניתן להשיג בממוצע שמונה קריובלים עם 400,000 תאים/קריוביאליים מצלחת אחת בת 6 בארות לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי (איור 2A). כדי להשיג זאת, PBECs מבודדים מתורבתים בצלחות של 6 בארות למשך 7 ימים לפחות ומקסימום של 14 יום (איור 2B) בנוכחות פרימוצין, כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי (במיוחד מיקופלסמה). איור 2A,B מספק תובנה לגבי מספרי התאים שהתקבלו וזמן התרבית הנדרש בין בידודים שונים מתורמים שונים. לפני קצירת התאים על ידי טריפסיניזציה לאחסון בחנקן נוזלי, המפגש חייב להיות מעל 80%. אם זה לא מושג בתוך 14 ימים, התאים לא צריך להיות cryopreserved. חשוב לציין, בעת קציר לאחסון ומעבר, המפגש של שכבת התא לא יעלה על ~95% (איור 2C). לאחר אחסון בחנקן נוזלי, ניתן להפשיר את התאים ולגדל אותם בתרבית לצורך התרחבות עד לקבלת מספר תאים מספיק עבור תרביות ALI. התווך המשמש להרחבת התאים בשלב זה הוא c-KSFM, בדומה לתרבית הראשונית לאחר הקציר מטבעת הסימפונות18. עם זאת, אין צורך בפרימוצין בשלב זה, מכיוון שהסיכון לזיהום מיקרוביאלי נוסף שמקורו ברקמת הריאה אינו קיים, ולכן ניתן להחליף פרימוצין בפניצילין/סטרפטומיצין. מדיום זה מעדיף תאי אפיתל על פני פיברובלסטים ולכן מונע צמיחת יתר אפשרית של התרבית על ידי פיברובלסטים מתרבים מהר יותר 19,20,21. באמצעות תווך c-KSFM, התאים מפוזרים בבקבוק ואינם מתחברים זה לזה, דבר השונה במידה ניכרת מהמורפולוגיה של תאים בתרבית השקועים בשלב זה בתווך cBD (איור 2D,E). לאחר 5 או 6 ימים של תרבית התאים המופשרים בצלוחית T75, שכבת התא צריכה להיות 80%-95% במפגש, מה שמתורגם לכ-3 x 106 תאים בסך הכל (איור 2F). מכאן, ניתן להפיק כ -75 תוספות (גודל צלחת 12 בארות) לתרבות ALI.
שיטת הבידוד והתרבית המתוארת בתרומה זו יכולה להיות מותאמת גם לשימוש עם ביופסיות סימפונות או מברשות סימפונות כחומר מוצא.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> איור 2: התרחבות תאי הבסיס לפני ואחרי שימור בהקפאה. התאים בודדו על פי הפרוטוקול המתואר וגודלו בתרבית באמצעות c-KSFM. מספר התאים שנוצרו לכל תורם נוטר, ספירת התאים החיים בוצעה באמצעות מונה תאים אוטומטי (A) בעת קצירת תאי המעבר 0 (P0) מלוחות 6 הקידוחים (שלב 2 של הפרוטוקול), n = 123 תורמים, ספירת התאים הוצגה כמספר התאים שנקצרו לכל באר; כל נקודה מייצגת תורם אחד והחציון מסומן בסרגל אופקי. (B) כחלק מבקרת איכות, הזמן הדרוש לתאי P0 כדי להגיע למפגש של 80% עד 90% בלוחות 6 הקידוחים נוטר והוצג כימים לאחר תחילת התרבית השקועה ב-c-KSFM (n = 127 תורמים שונים). כל תורם בודד מסומן על ידי נקודה, כל הנקודות השייכות ליום אחד מתמזגות לקו; ככל שהקו רחב יותר, כך הוא מייצג יותר תורמים; מספר הימים החציוני שבו נמצאים התאים בתרבית מסומן על ידי פס אופקי דק יותר. (C) תמונת שדה בהיר מייצגת של תאי P0 שגדלו שקועים ב-c-KSFM ברגע שבו התאים נקצרו לצורך שימור בהקפאה לטווח ארוך. (D) תמונת שדה בהיר מייצגת של תאי P1 שגדלו שקועים ב-c-KSFM ברגע שהתאים נקצרו והועברו לתוספות, ו-(E) תאי P1 שגדלו שקועים בתווך cBD. (F) מספר התאים החיים שנוצרו לכל תורם נוטר באמצעות מונה תאים אוטומטי בעת קצירת תאי P1 מבקבוק T75 (סעיף 4 לפרוטוקול), n = 63 תורמים שונים; ספירת התאים מוצגת כמספר התאים לכל צלוחיות T75, כל תורם מסומן בנקודה, וספירת התאים החציונית מסומנת על ידי פס אופקי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
תרבות ממשק אוויר-נוזל (ALI) 7 ימים לאחר תחילת תרבית ALI, ההתנגדות החשמלית של שכבת התא נמדדת וצריכה להיות יותר מ-300 Ω (איור 3A); אם זה לא מושג, התרבות נחשבת ככישלון בגלל חוסר אפשרי של היווצרות צומת הדוק. מומלץ לשלול את האפשרות לקבל ערכי TEER נמוכים הנגרמים כתוצאה מפגיעה בשכבת האפיתל בתוספות בודדות הנובעת, למשל, מפגיעה בשכבת התא במהלך שטיפה ושיפה. ניתן לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית חזותית של תוספות התרבית. מניסיוננו, השונות בין התורמים בהתנגדות החשמלית יכולה להיות משמעותית (איור 3B), אשר מדווח גם בספרות14, וכפי שנצפה הוא מושפע במידה ניכרת גם ממקורו של תווך העיט המעובד של דולבקו (DMEM) המשמש (איור 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> איור 3: התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל כבקרת איכות של תרביות ALI-PBEC. PBECs בודדו והורחבו, ותרבויות ALI-PBEC מובחנות היטב הוקמו. במספר נקודות זמן במהלך התרבית נמדדה התנגדות חשמלית, ולאחר מכן חושב ה-TEER (Ω· ס"מ2). (A) התנגדות חשמלית נמדדה במהלך 14 יום לאחר ALI. n = 4 תורמים שונים. הנתונים מתוארים כערך הממוצע ± סטיית תקן (SD). (B) כחלק מבקרת האיכות של תרביות תאים ALI-PBEC, נמדדה התנגדות חשמלית ביום 7 (n = 50) וביום 14 לאחר ALI (n = 25); כל נקודה מייצגת תורם אחד וה-TEER החציוני (Ω·cm2) מסומן על ידי סרגל אופקי. הנתונים נבדקו למובהקות באמצעות מבחן מאן-ויטני לא פרמטרי, ולא נמצא הבדל משמעותי. (C) מדיה משלושה ספקי DMEM שונים נבדקה כדי להעריך את ההשפעה על היווצרות TEER. n = 4 תורמים שונים; ערכים ממוצעים מתוארים ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
תוך ביסוס תרבות ALI-PBEC מובחנת היטב, מתחילת החשיפה לאוויר, ריכוז RA עולה22. בדרך זו, תאים עוברים מהתרבות להתמיינות ליחה, אשר נראית כבר 9 ימים (תלוי בתורם) לאחר חשיפה לאוויר באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. תנועה של ריסונים ראשונים נראית בנקודה זו, ומעט מוקדם יותר כאשר היא מבוססת על ביטוי גנים של סמנים של תאים לומינליים ממוינים23 (איור 4).
כפי שמתואר בפרוטוקול, ניתן לראות ייצור ריר גם בעת שטיפת המשטח האפי במהלך השינוי הבינוני. RA רגיש מאוד לאור, מה שמוביל לפעילות משתנה מאוד באותו ריכוז מניות. מסיבה זו, RA מוחלף על ידי אנלוגי RA סינתטי EC 23 ומשמש באותו ריכוז, עם תוצאות דומות כפי שנקבע בניסוי. מסיבה זו וכדי להימנע משינוי הנוהל, ריכוז EC 23 שנבחר נשמר שווה לריכוז RA (כלומר, 50 ננומטר) ששימש בעבר24,25 (איור 5). איור 5A מתאר את ערכי ה-TEER שהושגו בעת שימוש בריכוזים שונים של EC 23, ומראה TEER מקסימלי ב-50 ננומטר בטווח הריכוזים הזה שנבדק. התוצאות המוצגות באיור 5B מאשרות כי ביטוי גנים של סמנים עבור תאים ריסניים ותאי גביע דומה בעת שימוש ב-50 ננומטר EC 23 או RA. EC 23 נדרש גם במהלך התרבית בשלב השקוע (אם כי בריכוז נמוך בהרבה), שכן השמטתו בשלב שקוע זה והוספתו רק בשלב ALI יוצרת תרבות שלעולם אינה מגיעה למפגש מלא. הזמן הדרוש ליצירת תרבית ALI-PBEC מובחנת היטב עם פעילות פעימות ריסניות נראות לעין וייצור ריר הוא בסביבות 14 יום, ולכן רוב הניסויים מתחילים בין תרביות ALI של 14-21 יום (איור 4). כל סוגי התאים העיקריים (תאי בסיס, ריסון, גביע וקלאב) נצפים במשך 14 יום של תרבית ALI, אם כי רמות הביטוי תלויות מאוד בתורם. זה מודגם על ידי הערכת ביטוי גנים של TP63, FOXJ1, MUC5AC, ו SCGB1A1 על ידי RT-qPCR, או ביטוי חלבון באמצעות נוגדנים המכוונים נגד p63, α-tubulin, Muc5AC, ו CC-16 על ידי צביעה פלואורסצנטית חיסונית (IF), כדי לזהות סמנים עבור תאי בסיס, ciliated, גביע ומועדון, בהתאמה25,26 . עם זאת, בעוד 14-21 ימים עשויים להיחשב ככלל אצבע עבור רוב הניסויים, עבור ניסויים נבחרים, משך זמן ארוך יותר של התמיינות עשוי להיחשב, כפי שנמצא עבור מטבוליזם קסנוביוטיקה, זיהום SARS-CoV-2, ואת הערכת פינוי ליחה27,28,29.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> איור 4: תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). PBECs בודדו והורחבו, ותרבויות ALI-PBEC מובחנות היטב הוקמו. תרביות ALI-PBEC נוטרו במשך 14 יום לאחר ALI. תרביות תאים נערכו לצורך בידוד RNA בימים 0, 7 ו-14 לאחר ALI. מוצגים נתונים משני תורמים שונים, כל נקודה מייצגת תורם בודד אחד המנוטר לאורך זמן, והחציון מסומן על ידי סרגל אופקי. ביטוי גנים של סמני תאי בסיס, ריסון, גביע ומועדון (TP63, FOXJ1, MUC5B ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור ביטוי גנים RPL13A ו-ATP5B (ראו הפניה 23 לפרטים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> איור 5: השוואה בין חומצה רטינואית (RA) לבין האנלוגיה הסינתטית שלה EC 23. PBECs בודדו והורחבו, ותרבויות ALI-PBEC מובחנות היטב הוקמו. עם תחילת החשיפה לאוויר של תרביות PTEC, RA (50 ננומטר) הוחלף בריכוזים שונים של EC 23. (A) התנגדות חשמלית נמדדה ביום ה-14 שלאחר ה-ALI ולאחר מכן חושב ה-TEER (Ω·cm 2), n =2 תורמים, העמודות מתארות את הערך הממוצע ±-SD. (B) ביום ה-14 שלאחר ה-ALI, תרביות תאים עברו ליזה לצורך בידוד RNA וניתוח ביטוי גנים עוקב של סמני תאים עבור תאי ריסון וגביע בהתאמה (FOXJ1, MUC5AC) באמצעות qPCR, ומנורמל עבור RPL13A (n = 3 תורמים). גידול בקיפול מוצג כנגד ALI-PBEC בתרבית עם 50 ננומטר RA ומתואר כערך הממוצע ± SD. (ראה הערה 23 לפרטים) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בשנים האחרונות נבחנו ביצועיהם של מוצרים אלטרנטיביים במערכת התרבות, כגון המדיה והפלסטיק התרבותי. היו סיבות שונות להערכות כאלה, ביניהן שינויים בהרכב הבינוני של היצרנים, הכנסת מדיה חדשה וכן מחסור במוצרים במהלך מגפת הקורונה (2020-2022). התצפית נעשתה שמוצרים דומים מספקים שונים גורמים לתרביות תאי אפיתל ממוינים בהתבסס על הערכת סמנים של סוגי תאי אפיתל, אף על פי שההרכב התאי הסופי עשוי להשתנות באופן משמעותי (איור 6A), בעוד שההבדלים ב-TEER היו פחות בולטים (איור 6B). לעומת זאת, מדיום מספקים שונים הביא להבדלים ניכרים בהרכב הסלולר; בעת שימוש בתוספות של מותגים שונים, הבדלים אלה היו מוגבלים (איור 6C). בפרט, בעת שימוש במדיום תרבית תאי אפיתל של דרכי הנשימה PneumaCult מבית STEMCELL Technologies, נצפתה מורפולוגיה שונה והיווצרות מהירה יותר של פעילות ריסנית נראית לעין. מלבד תצפיות אלה, נצפה גם הבדל בערכי TEER והבדל בהרכב התאי של ALI-PBEC בהשוואה למדיום cBD (איור 6D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> איור 6: השוואה בין ספקים שונים של תווך תאי אפיתל ותוספות תרבית תאים. PBEC היו מבודדים, מורחבים ומובחנים היטב תרבויות ALI-PBEC הוקמו. (A) ALI-PBECs גודלו בתרבית במשך 14 יום, ולאחר מכן שכבות התא עברו ליזה לצורך בידוד RNA. ביטוי גנים של סמני תאי בסיס, ריסונים, גביעים ותאי מועדון (TP63, FOXJ1, MUC5AC, ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור RPL13A ו-ATP5B. n = 2 תורמים; העמודות מתארות את הערך הממוצע ± SD. (B) במהלך 9 ימים לאחר ALI נמדדה התנגדות חשמלית ולאחר מכן חושב ה-TEER (Ω·cm2). n = 3 תורמים שונים; ערכים ממוצעים מתוארים ± SD. (C) ALI-PBECs תורבתו במשך 14 יום באמצעות תוספות תרבית תאים שנרכשו משלושה ספקים שונים, ולאחר מכן שכבות התא עברו ליזה לצורך בידוד RNA. ביטוי גנים של סמנים של תאי ציליאט, גביע ומועדון (FOXJ1, MUC5AC, ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור RPL13A. n = 18 תורמים שונים, העמודות מתארות את הערך הממוצע ± SD. הנתונים נבדקו למובהקות באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס חד כיווני ANOVA לא פרמטרי ולא נמצא הבדל משמעותי. (D) ALI-PBECs גודלו בתרבית בתווך cBD או בתווך PneumaCult (טכנולוגיות STEMMCELL) במשך 14 יום לאחר ALI, ואז שכבות התא עברו ליזה לצורך בידוד RNA. ביטוי גנים של סמני תאי בסיס, ריסון, גביע ומועדון (TP63, FOXJ1, MUC5B ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור RPL13A (הפסים מתארים את הערך הממוצע ± SD), והתנגדות חשמלית נמדדה בימים 5 ו-12 לאחר ALI ושימשה לחישוב TEER (Ω·cm2). n = 2; הערך הממוצע מתואר ± SD (ראה הערה 23 לפרטים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: הרכב הפתרונות והמדיה המשמשים בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

פרוטוקול זה מיועד לשיטה חזקה וחסכונית שניתן להשתמש בה כדי לענות על מגוון שאלות מחקר הקשורות לתפקוד ולתפקיד של תאי אפיתל בדרכי הנשימה בבריאות ובמחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת שכבת תא המייצגת היטב את שכבת תאי האפיתל האנושית, כולל ייצור ריר ופעילות ריסנית. טכניקה זו היא תכליתית וניתן להשתמש בה כדי לחקור עלבונות הקשורים למחלה, או טיפולים.כדי להתחיל, לשטוף את טבעת הסימפונות מבודד מרקמת הריאה האנושית עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי בצלחת פטרי 10 ס"מ. בזמן שאתם מחזיקים את הטבעת בפינצטה, השתמשו במספריים קטנים כדי להסיר עודפי רקמת חיבור ושאריות דם. חותכים את הטבעת לשניים, וטובלים שני חצאים ב-10 מיליליטר של תמיסת פרוטאז 14 שחוממה מראש ב-HBSS המכילה פרימוצין במיכל סטרילי סגור.לדגור על חתיכות טבעת הסימפונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר הדגירה, מעבירים את החתיכות לצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר PBS חם, ובעזרת פינצטה כפופה, מגרדים את החלק הפנימי של הטבעת כדי לקבל תמיסת תאים. השליכו את הטבעת.העבר את תמיסת התא לצינור 50 מיליליטר, והוסף PBS חם לקבלת נפח סופי של 50 מיליליטר. צנטריפוגו את תמיסת התא, ושאפו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר של PBS חם. לפצות את נפח ל 50 מיליליטר עם PBS, ולחזור על הצנטריפוגה.יש להשהות מחדש את הגלולה ב-KSFM חם ושלם המכיל פרימוצין. לאחר מכן, להחליף את פתרון ציפוי מן צלחת שש בארות עם שני מיליליטר של השעיית התא לכל באר. לאפשר לתאים לגדול עד 80 עד 90% מפגש הוא הגיע, עבור cryopreservation של PBECs, לשאוף את התווך מן הבארות ולשטוף את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS חם לכל באר.טריפסינזציה של התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של טריפסין רך לכל באר, ודגרה במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבלים את תמיסת הטריפסין, ומשחררים את התאים על ידי הקשה עדינה על הצלחת. מעבירים את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכיל מעכב טריפסין מפולי סויה.צנטריפוגות את המתלים, ומשליכים את הסופרנאטנט לפני השעיית הגלולה מחדש ב-10 מיליליטר של KSFM המכיל פניצילין וסטרפטומיצין. לאחר ספירת התאים על מונה תאים אוטומטי, להשעות מחדש את התאים לריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר בתווך הקפאה, ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיה זו בהקפאה. מעבירים את הבקבוקונים למיכל תא קריר, ומניחים אותו על מינוס 80 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, העבירו את הבקבוקונים למינוס 196 מעלות צלזיוס חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. כדי לצפות בקבוק תרבית תאים T75, הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת ציפוי ב-PBS, וסגרו את המכסה היטב לפני הנחת הבקבוק באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, להחליף את פתרון ציפוי מן הבקבוק עם 10 מיליליטר של KSFM מלא.מניחים למדיום להתחמם ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם מכסה פתוח מעט כדי לאפשר לאינקובטור להתאוורר פנימה. הפשירו במהירות את ה-PBECs השמורים בהקפאה באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. הוסף את כל התוכן לקריוביאל לבקבוק T75 שחומם מראש ופזר את התאים באופן שווה.לאחר וידוא כי התאים מחוברים היטב, להחליף את המדיום עם 10 מיליליטר של KSFM שלם טרי וחם, ולגדל אותם עד 80 עד 90% מפגש הוא הגיע. תרבית תאי מעיל תוספות על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי לכל תוספת, ולדגור במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. טריפסינזציה של PBECs בבקבוק על ידי הוספת שני מיליליטר של טריפסין רך, ולדגור במשך חמש עד 10 דקות.הקל על ניתוק התאים על ידי ערבול והקשה עדינה על הצלוחית. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של מעכב טריפסין סויה לצלוחית, ולהעביר את השעיית התא צינור 25 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלים ולתלות מחדש את הגלולה בשישה מיליליטר של מדיום BD מלא.ספור את התאים במונה תאים אוטומטי. לאחר הציפוי, הסר את תמיסת הציפוי מהתוספות. לדלל את תרחיף התא עם מדיום BD מלא בתוספת ננומול EC 23 אחד ולהוסיף 500 מיקרוליטר על החלק העליון של הממברנה של תוספות.הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום BD שלם לבאר שמתחת לתוספת. כאשר התאים מוכנים להעברה לממשק אוויר-נוזל, או ALI, הסר את התווך מהתוספות ומהבאר, והוסף מדיום BD שלם חדש בתוספת EC 23 50 ננו-מולרי רק לבאר. לשנות את המדיום בבארות שלוש פעמים בשבוע.כדי להסיר עודפי ריר ופסולת תאית, הוסיפו בעדינות 200 מיקרוליטר של PBS חם בצד האפי של שכבת התא בתוך העלון, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, שואפים PBS המכיל עודף ריר ופסולת תאית. TEER נמדד כדי להעריך את האיכות של תרבויות PBEC ALI.בגיל שבעה ימים, ההתנגדות החשמלית של שכבת התא הגבוהה מ -300 אוהם נחשבת לתרבית מוצלחת. יתר על כן, השונות בין התורמים בהתנגדות החשמלית פחתה עם הזמן בין היום השביעי ליום ה-14 של התרבית בממשק אוויר-נוזל, והיא מושפעת במידה ניכרת ממקור ה-DMEM בו נעשה שימוש. כל סוגי התאים העיקריים, כגון תאי בסיס, ריסון, גביע וקלאב, נצפו לאחר 14 יום של תרבית ALI, ורמות הביטוי היו תלויות בתורם.בין הריכוזים השונים של EC 23 שנבדק, TEER מקסימלי נצפה ב 50 ננומולארי. השוואה בין חומצה רטינואית לבין האנלוגיה הסינתטית שלה, EC 23, מאשרת כי ביטוי גנים של סמנים עבור תאים ciliated ו goblet היו דומים בין 50 ננומולרי EC 23 וחומצה רטינואית. השימוש בתווך מספקים שונים הביא להבדלים משמעותיים בהרכב הסלולר, בעוד שההבדלים ב-TEER היו פחות בולטים.לעומת זאת, שימוש באינווסטים מספקים שונים לא הביא להבדלים מהותיים בפירוק התאים. יתר על כן, נצפה גם הבדל בערכי TEER ובהרכב התאי של PBEC ALI ומדיום PneumaCult בהשוואה למדיום BD השלם. כאשר התאים מוכנים לעבור ל- ALI, הגדל את ריכוזי EC 23.כמו כן, אין לבצע צנטריפוגות של התאים לאחר ההפשרה, ולהסיר במהירות את התאים מפלסטיק תרבית תאים לאחר הוספת SBTI. באמצעות תרביות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה כפי שמופיע בפרוטוקול זה, ניתן לעקוב אחר כך באמצעות מגוון שיטות ניתוח כדי להסתכל, למשל, על הפונקציה, ביטוי הגנים, ייצור המתווך של תאי האפיתל של דרכי הנשימה, וכך, למשל, לקבל תובנה לגבי ההשלכות של חשיפות, למשל, לעשן סיגריות. השלבים הבאים בפרוטוקול תרבית תאים זה הם שילוב של סוגי תאים נוספים, כגון תאי מערכת החיסון, או תאי כלי דם, וזה יעזור להגדיל את ייצוג הרקמות.

isolating-bronchial-epithelial-cells-from-resected-lung-tissue-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים את שיטת מפורט לגידול העיקרי בתאים אנושיים אפיתל הסימפונות מ explants של רקמה אנושית דרכי הנשימה הסימפונות כולל גידול הבדיל על ממשק אוויר נוזלי. שיטה זו מספקת מקור שופע של תאים ראשוניים על חקירת תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה בריאות מחלת ריאות האדם.

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לפיתוח מודל ריאות חזיר ex vivo של ביופילם חיידקי על רקמת סימפונות נגועה. ביופילמים הם אגרגטים חיידקיים המשובצים במטריצה הנצמדת למשטח. מודל זה משמש לחקר הרגישות האנטיביוטית של חיידקים בשלבים שונים של היווצרות ביופילם.

מודל ריאות חזיר Ex vivo של ביופילם: טכניקה לפיתוח מודל ריאות לחקר ביופילמים חיידקיים על רקמת ברונכיולר חזיר

מאמר זה מתאר טכניקות bronchoscopic בריאת השור תחת תנאי ניסוי, כלומר חיסון מודרך bronchoscopically, שטיפה ברונכואלוואולרית, צחצוח הסימפונות, וביופסית ריאות transbronchial.

ברונכוסקופיה מודרכת מבחינה ויזואלית, Intrabronchial הרכבת חיסון ו: ריאות שור במחקר ביו<em&gt; בVivo</em&gt; טכניקות דגימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות מלא agarose דיוק-קאט אמבריולוגיה מרקמות החולה resected המתאימים ליצירת ריאות 3D בתרביות רקמה למחלות ריאה אנושיים מודל במחקרים ביולוגי וביו.

דור של תרבויות רקמות אמבריולוגיה תלת-ממד (3D-LTCs) עבור מידול המחלה

המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תרבית ממשק אוויר-נוזל משמשת בדרך כלל לפיתוח אפיתל דרכי נשימה פסאודוסטרטי על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים תקינים ראשוניים המחקים את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול קל לקביעת איכותו על ידי ניטור תכונותיו הביופיזיקליות, כגון תפקוד ריסוני ושלמות הממברנה.

קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

מאמר זה מתאר את היצירה של מודל מחסום דרכי נשימה מורכב ורב-תאי המורכב מאפיתל ריאות שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), מזנכימה, תאי אנדותל ומקרופאגים בתרבית ממשק אוויר-נוזל.

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

למדו שיטה יעילה לבידוד תאי אפיתל קשבי ראשוניים מרקמת ריאה אנושית לצורך הקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל. השיטה מאפשרת מחקר מדויק של תפקודי תאי דרכי הנשימה במחלות ובבריאות.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

גלה סרטונים נוספים