Name: שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: למד את שיטת Magnify להרחבת דגימות ביולוגיות פי 11 באמצעות מיקרוסקופ רחב שדה רגיל. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה ננומטרית ללא ציוד מיוחד ומשמרת מגוון רחב של ביומולקולות בדגימות קליניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קרנגי מלון וקרן הצדקה D.S.F. (Y.Z. ו- X.R.), המכונים הלאומיים לבריאות (N.I.H.) פרס הבמאי החדשן החדש DP2 OD025926-01, וקרן קאופמן.

מיקרוסקופ הרחבה להרחבה חזקה פי 11

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+R.N.A.+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+R.N.A.+detection+approach+with+super-resolution+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).</li>
<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+R.N.A.s+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nature Methods. 18, 107-113 (2021).</li>
<li>White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lipid expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).</li>
<li>Chang, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-preserving+magnified+analysis+of+proteome+%28eMAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP).</a> Science Advances. 7 (46), (2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. , (2023).</li>
<li>Gao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+stimulated+emission+depletion+microscopy+%28ExSTED%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED).</a> ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nature Communications. 11, 3388(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על האינטרסים הפיננסיים המתחרים הבאים: Y.Z., A.K., Z.C. ו- B.R.G. המציאו מספר המצאות הקשורות ל- Magnify ו- ExM.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול Magnify17, גרסת ExM שיכולה לשמור על ביומולקולות מרובות עם עוגן כימי יחיד ולהרחיב דגימות קליניות מאתגרות של FFPE עד פי 11 עם דנטורציה של חום. השינויים העיקריים בפרוטוקול זה המבדילים אותו מפרוטוקולי ExM אחרים כוללים שימוש בג'ל מנוסח מחדש שנשאר חזק מכנית גם כאשר הוא מורחב במלואו, כמו גם השימוש במתקרוליין כעוגן ביומולקולה. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם כדלקמן: 1) הרכב תמיסת הג'ל הסופית; 2) עיתוי שלבי הגלציה; 3) הגדרת תא הגלציה; 4) הפרמטרים להומוגניזציה של המדגם; ו-5...

מערכות ביולוגיות מפגינות הטרוגניות מבנית, החל מהגפיים והאיברים ועד לרמות החלבונים בסקאלה הננומטרית. לכן, הבנה מלאה של פעולת מערכות אלה מחייבת בחינה ויזואלית על פני קני מידה אלה. עם זאת, מגבלת העקיפה של האור גורמת לאתגרים בהדמיה של מבנים קטנים מ~200-300 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בנוסף, שיטות אופטיות ברזולוציית על 1,2,3, כגון דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופ לוקליזציה מופעל אור (PALM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), למרות שהן חזקות, מציבות אתגרים משלהן, מכיוון שהן דורשות חומרה וריאגנטים יקרים ולעתים קרובות יש להן זמני רכישה איטיים ויכולת ירודה לצלם נפחים גדולים בתלת-ממד.
מיקרוסקופ הרחבה4 (ExM) מספק אמצעי חלופי לעקוף את גבול העקיפה של האור על ידי עיגון קוולנטי של ביומולקולות לג'ל פולימרי מתנפח במים ומשיכה פיזית שלהן זו מזו, ובכך להפוך אותן לפתרון במיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי. מספר רב של גרסאות פרוטוקול ExM פותחו מאז הפרסום המקורי של ExM לפני פחות מעשור, ופרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב ישיר של חלבונים 5,6,7, RNA 8,9,10, או שומנים11,12,13 לתוך רשת הג'ל על ידי שינוי העוגן הכימי או הרחבת הדגימה עוד יותר (ובכך לשפר את הרזולוציה האפקטיבית) בשלב אחד14 או בשלבים איטרטיביים מרובים15,16. עד לאחרונה, אף פרוטוקול ExM יחיד לא יכול היה לשמור על שלוש מחלקות ביומולקולות אלה עם עוגן כימי יחיד הזמין מסחרית תוך מתן ג'ל חזק מכנית שיכול להתרחב ~ פי 10 בסבב התפשטות יחיד.
כאן, אנו מציגים את Magnify17, תוספת עדכנית לארסנל ExM המשתמשת במתקרולאין כעוגן ביומולקולה. מתקרוליין יוצר קשרים קוולנטיים עם רקמה כמו זו של פרפורמלדהיד, מה שמבטיח שניתן לשמור על סוגים מרובים של ביומולקולות בתוך רשת הג'ל ללא צורך בסוכני עיגון ספציפיים או מותאמים אישית. בנוסף, טכניקה זו יכולה להרחיב ספקטרום רחב של רקמות עד פי 11, כולל דגימות מאתגרות לשמצה כגון דגימות קליניות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE). שיטות קודמות להרחבת דגימות קשיחות מכניות כאלה דרשו עיכול פרוטאז קשה, מה שהפך את סימון הנוגדנים של חלבונים מעניינים לבלתי אפשרי לאחר הרחבת הדגימה. לעומת זאת, שיטה זו משיגה הרחבה של דגימות קליניות מסוג FFPE באמצעות תמיסת דנטורינג חם, ובכך משמרת אפיטופים של חלבונים שלמים בתוך הג'ל, שניתן לכוון אליהם לצורך הדמיה לאחר הרחבה (איור 1).

<table><tbody><tr><td>4-הידרוקסי-TEMPO (4HT)</td><td></td><td>מעכב</td> <td>176141 סיגמא אולדריץ'</td></tr><tr><td>צלחת תחתון זכוכית 6 בארות (#1.5 כיסוי)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8887</td><td>רכיב מונומר ג'ל</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Initiatior</td></tr><tr><td>DAPI (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>דקאתילן גליקול מונו דודציל אתר (C12E10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9769</td> סכין <td>יהלום פעילי שטח לא יוניים</td></tr><tr><td>מס' 88 CM</td><td>General Tools</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco</td><td></td><td></td>111000200</tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) 0.5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td>רכיב חיץ הומוגניזציה</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8898</td><td>רכיב מאגר הומוגניזציה</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>מתקרולין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>133035</td><td>סוכן עיגון</td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי זכוכית #1 (24x60 מ"מ)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי זכוכית #1.5 (24x60 מ"מ)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Accelerator</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebisacrylamide (Bis)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td>רכיב מונומר ג'ל</td></tr><tr><td>N,N-dimethylacrylamide (DMAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>274135</td><td>רכיב מונומר ג'ל</td></tr><tr><td>Nunclon 4-Well x 5 מ"ל MultiDish Cell Culture Dish</td><td>Dish Thermo Fisher</td><td></td> 167063-Nunclon <td></td></tr><tr><td>6-Well Cell Culture Dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 15 מ"ל&nbsp; </td><td>תרמו פישר</td> חרוטי <td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 50 מ"ל&nbsp; חרוטי</td><td>תרמו פישר</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td></td><td></td><td></td>אורביטלי</tr><tr><td>מברשת</td><td></td><td></td><td></td>צבע</tr><tr><td>pH מטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS), 10x תמיסה</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול&nbsp; 200</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P-3015</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K ( כיתה ביולוגיה מולקולרית)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>פישר Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה Safelock 1.5 מ"ל</td><td>תרמו פישר</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה Safelock 2.0 מ"ל</td><td>תרמו פישר</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אקרילט (SA)</td> <td>AK Scientific</td><td>R624</td><td>רכיב</td></tr> <tr>מונומר ג'ל<td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט טריבסיק דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L3771</td><td>רכיב מאגר חיץ הומוגניזציה</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP152-1</td><td>מאגר הומוגניזציה רכיב</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>רכיב חוצץ הומוגניזציה</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy

הדמיה ננומטרית של דגימות ביולוגיות יכולה לשפר את ההבנה של פתוגנזה של מחלות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ הרחבה (ExM) הוכח כחלופה יעילה וזולה למיקרוסקופ אופטי ברזולוציית על. עם זאת, הוא הוגבל על ידי הצורך בסוכני עיגון ספציפיים ולעתים קרובות מותאמים אישית כדי לשמור על מחלקות ביומולקולות שונות בתוך הג'ל ועל ידי קשיים בהרחבת פורמטים סטנדרטיים של דגימות קליניות, כגון רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין, במיוחד אם רוצים גורמי התפשטות גדולים יותר או אפיטופים חלבוניים משומרים. במאמר זה אנו מתארים את Magnify, שיטת ExM חדשה להרחבה חזקה עד פי 11 במגוון רחב של סוגי רקמות. על ידי שימוש במתקרולאין כעוגן כימי בין הרקמה לג'ל, Magnify שומרת על ביומולקולות מרובות, כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין, בתוך הג'ל, ובכך מאפשרת הדמיה ננומטרית רחבה של רקמות על מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מתאר שיטות עבודה מומלצות כדי להבטיח הרחבת רקמות חזקה ונטולת סדקים, כמו גם טיפים לטיפול והדמיה של ג'לים מורחבים מאוד.

אם הפרוטוקול הושלם בהצלחה (איור 1), הדגימה תיראה ברורה ושטוחה לאחר דנטורציה של חום; כל קיפול או קמטים מעידים על הומוגניזציה חלקית. דגימה שהורחבה בהצלחה תהיה גדולה פי 3-4.5 מאשר לפני ההתרחבות ב-PBS 1x וגדולה פי 8-11 כאשר תורחב במלואה ב-ddH2O. איור 3 מציג תמונות לדוגמה לפני ואחרי ההתפשטות של דגימת כליה אנושית FFPE בעובי 5 מיקרומטר שעובדה באמצעות פרוטוקול זה והורחבה בהצלחה פי 8. הרקמה הוכתמה תחילה בנוגדנים עבור ACTN4 יחד עם DAPI כדי להמחיש את הדנ"א הגרעי...

מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.

The nanoscale imaging of biological specimens can improve the understanding of disease pathogenesis. In recent years, expansion microscopy (ExM) has been ...

אנו מנסים למצוא דרכים קלות וזולות עבור חוקרים לצלם את הדגימות הביולוגיות שלהם ברזולוציות מתחת לגבול העקיפה, במיוחד בתחומי מדעי המוח והפתולוגיה הקלינית. פיתוחים רבים של מיקרוסקופיית הרחבה שנעשו לאחרונה כוללים שינוי כימיה של ג'ל כדי להרחיב דגימות עוד יותר, שינוי מולקולת העיגון כדי לדמיין מטרות שונות ושימוש בשינוי חימום כדי לשמר אפיטופים של חלבונים. עם הגדלה חדשנית, שיטת מיקרוסקופ הרחבה חזקה המאפשרת הדמיה ננומטרית של דגימות ביולוגיות או קליניות שונות.הוא מפשט מיקרוסקופיה ברזולוציית על על ידי ביטול צרכי ציוד מיוחדים תוך שמירה על תכונות ביולוגיות מורכבות ברזולוציה של עד 15 ננומטר, ומכאן הגדלת הנגישות והתועלת במעבדות ברחבי העולם. בעבר המשתמשים היו צריכים להתנסות בטכניקות שונות של מיקרוסקופ הרחבה, בהתאם לרקמות ולביומולקולות שהם רצו לדמות. הגדלה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה בין ביומולקולות וסוגי רקמות שונים ללא צורך בשלבי עיגון ספציפיים או ציוד ייעודי, ובכך מגשרת על פער משמעותי בדימות ננומטרי.מגדיל מרחיבה דגימות קליניות קשות יותר מפי ארבעה תוך שמירה על אפיטופים חלבוניים המאפשרים חקירה מדויקת יותר של מחלות בתור. העוגן הכימי שלו גם משמר מגוון רחב של ביומולקולות, מה שהופך אותו שימושי למחקר בסיסי במודלים של בעלי חיים מגדיל מפשט הדמיה ננומטרית של ביומולקולות ודגימות שלמות ללא אופטיקה מורכבת או ציוד מיוחד. הוא ניתן להתאמה בשיטות הדמיה שונות ובאסטרטגיות מיקרוסקופיית הרחבה, ומאפשר הדמיה ננומטרית נגישה וחסכונית שעשויה להאיץ טיפולים תרופתיים ומחקרי מחלות תוך שינוי פוטנציאלי ביצירת אטלס רקמות.מגדיל מציעה אינסוף אפשרויות למחקר. תחומי המיקוד הנוכחיים כוללים הרחבת אתר הרקמות, חקירת דגימות אנושיות פתולוגיות בקנה מידה ננומטרי וחקר השינויים בקנה מידה הקטן ביותר במוח במהלך למידה ומחלות.

universal-molecular-retention-with-11-fold-expansion-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.

הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית

השיטה המוצגת מאפשרת הדמיה של חלבונים תאיים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרוסקופיית הרחבה המובילה לרזולוציה של 70 ננומטר על מיקרוסקופ קונבנציונלי.

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

הודגם פרוטוקול של מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM). LR-ExM משתמשת במערך חדשני של עוגנים תלת-תכליתיים, המספקים יעילות תיוג טובה יותר בהשוואה למיקרוסקופיות הרחבה שהוצגו בעבר.

מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM) מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ועיצוב תוויות ביעילות גבוהה

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

מחקר זה מראה פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. אנו כוללים את הטכניקה האופטימלית עבור חלבונים ציטו-שלד ותיוג פאן-פרוטאום.

מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופי של טריפנוזומה קרוזי

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט המשלב שיטות מיקרוסקופ קריו-קיבוע והרחבה (Cryo-ExM), המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עם שימור מבני מותאם לדגימות ביולוגיות שונות. דגימות ביולוגיות מוקפאות, מוטמעות בפולימר מתנפח, מפורקות, מורחבות ומסומנות באימונו, מה שמאפשר הדמיה ברזולוציה על-גבוהה עם מיקרוסקופים רגילים.

מיקרוסקופ התרחבות: הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונבנציונלי

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד התווית לדמיין שלפוחית ​​יחיד exocytosis הסינפטי וסחר רשתית דג זהב תאים דו קוטבית באמצעות הקרינה הכוללת פנימי ההחזרה (TIRF) מיקרוסקופיה.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

למד את שיטת Magnify להרחבת דגימות ביולוגיות פי 11 באמצעות מיקרוסקופ רחב שדה רגיל. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה ננומטרית ללא ציוד מיוחד ומשמרת מגוון רחב של ביומולקולות בדגימות קליניות.

שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11

גלה סרטונים נוספים