Name: יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד ליצור ולתפעל אורגנואידים במעיים של חולדות באמצעות זיהום לנטיוירוס וטרנספקציה זמנית. מודל זה מאפשר מניפולציות גנטיות ומחקר מתקדם בביולוגיית המעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדות Sumigray ו- Ameen על הדיונים המעמיקים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק בריאות הילד של קרן צ'ארלס הוד ומענק של קרן סיסטיק פיברוזיס (004741P222) ל- KS ועל ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של המכונים הלאומיים לבריאות ל- NA תחת פרס מספר 2R01DK077065-12.

בידוד ויצירת אורגנואידים במעיים של חולדות

<ol><li>Beumer, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+adult+mammalian+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+BiologyI%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroids+for+nutritional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+%26+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Enteroids for nutritional studies.</a> Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143(2019).</li>
<li>Cai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+six+common+dietary+nutrients+on+murine+intestinal+organoid+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth.</a> PLoS One. 13 (2), e0191517(2018).</li>
<li>Davoudi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Organoid+as+a+new+platform+to+study+alginate+and+chitosan+mediated+PLGA+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery.</a> Marine Drugs. 19 (5), 282(2021).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut%3A+a+promising+model+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Mini-gut: a promising model for drug development.</a> Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).</li>
<li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport%2C+drug+uptake+and+metabolism+-+update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656(2020).</li>
<li>Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+gastrointestinal+diseases%3A+from+experimental+models+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation.</a> Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+permeability+coefficients+in+rat+and+human+jejunum%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum.</a> Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).</li>
<li>Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+intestinal+drug+permeability%3A+A+status+report+and+summary+of+repeated+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).</li>
<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Mouse%3A+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+processed+pseudogenes+in+the+mouse+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes.</a> Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).</li>
<li>Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+MHC+class+Ib+genes+in+rat+are+pseudogenes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse.</a> Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Haber, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+survey+of+the+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell survey of the small intestinal epithelium.</a> Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).</li>
<li>Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+cystic+fibrosis%3A+gastrointestinal%2C+pancreatic%2C+and+hepatobiliary+disease+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).</li>
<li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+necrotizing+enterocolitis%3A+pathophysiology%2C+translational+relevance%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Hedrich, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+rat+duodenal+organoids+for+ADME+and+toxicology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications.</a> Toxicology. 446, 152614(2020).</li>
<li>How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html">https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html</a> (2023).</li>
<li>How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html">https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html</a> (2023).</li>
<li>Sancak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rag+GTPases+bind+raptor+and+mediate+amino+acid+signaling+to+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1.</a> Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).</li>
<li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52531(2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids%3A+an+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Regent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+promotes+formation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+via+enhanced+neural+cell+fate+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351(2022).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Breau, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transgenesis+and+homology-directed+gene+targeting+in+monolayers+of+primary+human+small+intestinal+and+colonic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).</li>
<li>Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+organoids+enable+personalized+treatment+of+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis.</a> Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).</li>
<li>deWinter-de Groot, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+of+intestinal+organoids+correlates+with+disease+severity+in+adults+with+cystic+fibrosis+and+homozygous+F508del+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112(2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+to+model+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids to model cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379(2019).</li>
<li>Tong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+artificial+virus-like+nanocarriers+through+intestinal+monolayers+via+microfold+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells.</a> Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear%3A+control+by+Norrin+and+Frizzled-4%2C+a+high-affinity+ligand-receptor+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li>
<li>Jabaji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+as+an+extracellular+matrix+for+the+in+vitro+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 9 (9), e107814(2014).</li>
<li>Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+organoids+fuse+to+form+self-organizing+tubes+in+floating+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels.</a> Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

פיתוח מודל אורגנואיד מעיים של חולדה משמר מאפיינים תפקודיים חשובים הנמצאים באיבר in vivo והוא כלי מבטיח לבדיקות פרה-קליניות, סינון תרופות ובדיקות תפקודיות. מודל זה במבחנה יכול לשמש במקביל למחקרי גסטרואנטרולוגיה פרה-קליניים in vivo , שעבורם חולדות הן לעתים קרובות מודל מועדף בשל גודל המעי הגדול שלהן, היבטים פיזיולוגיים משותפים עם בני אדם, ובמקרים מסוימים היותן מודלים טובים יותר למחלות38. כאן, מתואר פרוטוקול חזק שלב אחר שלב לבידוד של קריפטות מעיים של חולדות, יצירה ותרבית ארוכת טווח של אורגנואידים במעי חולדות, כמו גם יישומים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות של נפיחות פורסקולין, אימונופלואורסנציה של הר שלם, תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ומניפולציה גנטית לנטי-ויראלית. אורגנואידים של עכברי עכברוש עשויים להיות רלוונטיים בהקשרים רבים של מחלות שבהם הפתופיזיולוגיה של מודלים של עכברים אינה הולמת, ועשויים לספק מודל טוב יותר לפיזיולוגיה של המעי האנושי בהשוואה לאורגנואידים של מעי עכברים.
כדי לבסס תרביות אורגנואידים ארוכות טווח שניתן לעבור ולהרחיב, חיוני לזהות את גורמי הגדילה העיקריים הדרושים לשמירה על שגשוג אפיתל המעי. אורגנואידים עכבריים גדלים לרוב בקוקטייל פשוט של EGF, R-ספונדין ונוגין, אם כי דווח כי נוגין אינו הכרחי לתרבית אורגנואידים במעיים39. מדיה מותנית יכולה להחליף גורמי גדילה רקומביננטיים וקווי התאים הנפוצים ביותר הם L-WRN, המפריש תאים Wnt3a, Rspondin-3 ו- Noggin39, L-Wnt3a ו- HA-Rspondin1-Fc 293T40. מדיה מותנית L-WRN מספיקה כדי לתמוך לא רק בצמיחת אורגנואידים במעי עכבר 39, אלא גם בצמיחה של אורגנואידיםבמעיים ממספר חיות משק וחיות מחמד, כולל כלבים, חתולים, תרנגולות, סוסים, פרות, כבשים וחזירים12. עם זאת, אורגנואידים במעיים אנושיים שונים מאוד בדרישות גורמי הגדילה שלהם, מכיוון שהם דורשים פורמולציות מדיה נפרדות לשלב צמיחת ההתפשטות שלהם (כלומר, ההתקדמות מספרואידים קטנים לגדולים) לעומת שלב ההתמיינות שלהם (כלומר, יצירה והבשלה של סוגי תאים ממוינים)10. דרישות המדיה של אורגנואידים במעי חולדות דומות מאוד לאלה של מצע הגידול המתפשט עבור אורגנואידים במעיים אנושיים, עם זאת, יש לציין, אורגנואידים של חולדות מסוגלים הן לגדילה והן להתמיינות בסביבת מדיה זו, מה שמפשט במידה ניכרת את דרישות התרבות שלהם. בעוד שהניסיונות הראשונים שלנו התמקדו בביסוס וגידול אורגנואידים במעיים של חולדות במדיה מותנית L-WRN, התרבית ארוכת הטווח הייתה רופפת, וקווי אורגנואידים במעיים של חולדות סבלו מחוסר חוסן (הנתונים לא הוצגו). ייתכן שהסיבה לכך היא שקווי תאי L-WRN מהונדסים להפריש R-spondin 3, בעוד שקו התאים 293T-Rspo1 המומלץ כאן מתוכנן להפריש R-spondin 1. ייתכן שאורגנואידים של חולדות ובני אדם מעדיפים R-spondin 1, מה שעשוי להסביר את הכשל של קווי אורגנואידים של חולדות במדיה מותנית L-WRN.
כדי לשחזר בצורה הקרובה ביותר את הגדרת in vivo , חשוב לפתח תנאי תרבית אורגנואידים המאפשרים הישרדות, תחזוקה ושגשוג של תאי גזע, ושיכולים לשמור על תחלופת תאים ואירועי התמיינות בו זמנית לסוגי תאים בדידים. לכן, הריכוזים של חלבונים רקומביננטיים ו / או חלבונים במדיה מותנית צריכים להיות טיטרציה הדוקה ומבוקרת כדי להגיע לאיזון מושלם זה. בפרט, רמות Wnt אופטימליות חיוניות כדי למנוע אובדן של תרביות אורגנואידים במעי. מעט מדי Wnt במדיה המותנית לא יהיה מסוגל לתמוך בצמיחה, מה שיוביל לאובדן תאי גזע ומוות אורגנואידים לאחר מכן; הפעלת יתר של Wnt תגרום לאורגנואידים להיות ציסטיים ובלתי מובחנים10. אמנם לא מפורט כאן, מומלץ מאוד לבדוק כל אצווה של מדיה מותנית L-Wnt3a ו- 293T-Rspo1 באמצעות בדיקת לוציפראז של כתב Wnt, כגון קו תא Topflash41. מחקרים קודמים תיארו כי אצווה אופטימלית של מדיה L-Wnt3a צריכה לגרום לעלייה של פי 15 באות ב-12.5% ועלייה של פי 300 באות ב-50%, בהשוואה ל-1% L-Wnt3a10. מכיוון שאורגנואידים של חולדות רגישים יותר מאורגנואידים של עכברים לדרישות התרבית, במיוחד לרמות ההפעלה של Wnt, צעדי בקרת איכות נוספים אלה מסייעים מאוד להקל על החוסן והאמינות של תרביות אורגנואידים של חולדות. מכיוון שקו כתבים דומה אינו זמין לבדיקת פעילות Bmp וריכוזי Noggin יחסיים במדיה מותנית Noggin, מומלץ להשתמש ב- Noggin רקומביננטי במידת האפשר כדי לשלוט במדויק ברמות Noggin. בעוד שניתן לגדל ולתחזק אורגנואידים במעיים של עכברים בהיעדר Noggin39, זה לא נוסה עבור תרביות אורגנואידים של חולדות.
מעבר לדרישות תרבית תאים, ההקמה הראשונית המוצלחת של קו אורגנואידים של חולדה תלויה באופן קריטי בדלדול יעיל של וילי ממוין במהלך בידוד קריפטה. רמות גבוהות של זיהום וילאר גורמות למוות של קריפטות, ככל הנראה בשל אותות מהתאים הגוססים, או בשל השתלטות על גורמים חיוניים. כדי לרוקן את הווילי המובחן הזה מתכשירי אפיתל בצורה מדויקת ועקבית, מומלץ לבצע בידודי אפיתל בעזרת סטריאוסקופ. בחינה חזותית של האפיתל המשתחרר מספקת רמז ברור מתי להשליך את PBS ולהחליף אותו (איור 1). אין לאסוף קריפטות עד שיש דלדול מספיק של וילי. תאי וילאר הם בעלי התמיינות סופנית ואינם יכולים לייצר אורגנואידים בתרבית. בנוסף, העברה לאחר מכן של אורגנואידים במעיים של חולדות והשימוש בהם לכל יישום במורד הזרם דורשים טיפול עדין. דגירה בריאגנטים דיסוציאציה לפרקי זמן ארוכים יותר (10 דקות) גורמת למוות תאי משמעותי ולאובדן קו האורגנואידים.
כאן מתואר פרוטוקול פשוט ומהיר ליצירת חד-שכבות מעיים מאורגנואידים של חולדות. למצעי EME וקולגן I יש השפעות שונות על האפיתל, שניתן למנף בהתאם למטרת המחקר. EME מאפשר הידבקות מהירה ויעילה של תאים בודדים ויצירת הקרנות תאים. לעומת זאת, ציפוי פני השטח בקולגן I מעכב תהליכים אלה. ברגע שחד-שכבות מגיעות למפגש של כ-80%, תאים הגדלים ב-EME מתחילים לייצר שוב מבנים אורגנואידים תלת-ממדיים. עם זאת, הם חסרים תמיכה פיזית וכימית מספקת להמשך הצמיחה. ניתן למנוע חזרה זו למצב אורגנואידי על ידי שמירה על חד-שכבות ב-EME במפגש של 50%-80%. תוספת של EME מדולל על פני השטח האפי של monolayers מקדם התאוששות מהירה היווצרות של אורגנואידים דה נובו, יצירת אזורים של התכנסות מהר יותר ובקלות. על משטח קולגן I, תאים יכולים ליצור חד-שכבה אחידה וליצור אשכולות קטנים. עם זאת, תוספת של קולגן I על גבי monolayers אינו מספיק כדי לגרום להיווצרות אורגנואידים. EME חייב להיות מדולל בעת הוספת משטח monolayer, כמו תהיה התנגדות מכנית חזקה יותר עבור אורגנואיד המתהווה להתגבר. עם זאת, EME מדולל זה אינו מאפשר היווצרות חזקה של אורגנואידים גדולים. כל אורגנואיד חולדה שנוצר דה נובו ומתנתק באופן טבעי מפני השטח חייב להיות מוסר מיד ומועבר EME לא מדולל כך שניתן יהיה לשחזר תמיכה מבנית וגדילה. בשל גודלם הקטן של האורגנואידים בשלב זה, המעבר של אורגנואידים אינו מומלץ עד לצמיחה חזקה הוקמה. המשמעות הביולוגית הבסיסית של מדוע EME יכול לתמוך ברפורמציה של אורגנואידים, אך האם קולגן I יכול או לא יכול לעשות זאת, אינה ברורה. עם זאת, היו דיווחים כי תאים שגדלו בקולגן תלת-ממדי אינם יכולים ליצור אורגנואידים ניצנים42,43 או לתמוך בתחזוקה לטווח ארוך. מוצרי EME הזמינים מסחרית הם תערובות הטרוגניות של חלבונים חוץ-תאיים, בעיקר למינין וקולגן IV44. לכן, ההרכב הייחודי של חלבונים והיכולת של תא אפיתל לתקשר עם המטריצה החוץ תאית באמצעות קומפלקסים תאיים שונים יכולים לאפשר עיצוב מחדש ב- EME אך לא בקולגן I. לא נבדקה השאלה אם ניתן להכניס חד-שכבות שמקורן בקולגן I ל-EME כדי לתמוך בהיווצרות וגדילה של אורגנואידים.
מניפולציה גנטית של מודל אורגנואיד המעי של חולדה מתוארת כאן, ומתוארים פרוטוקולים להתמרה לנטיויראלית של אורגנואידים תלת-ממדיים וטרנספקציה חולפת של חד-שכבות דו-ממדיות. כדי להתגבר על היעילות הנמוכה של התמרה אורגנואידית לנטיוויראלית, פותח פרוטוקול לטרנספקציה חולפת של חד-שכבות דו-ממדיות. המורפולוגיה השטוחה והתחומים האפיקליים החשופים של חד-שכבות מספקים גישה קלה יותר לנגיפים ולקומפלקסים המכילים DNA. הביטוי של כתב EGFP באמצעות וקטור pLJM1-EGFP שימש לאימות של טכניקה זו. ביטוי כתב GFP נצפה לאחר 24 שעות, ונשמר במשך 5-6 ימים בחד-שכבות. מחקרים עתידיים שיתמקדו בהתמרה לנטיויראלית של חד-שכבות צפויים להיות בעלי יעילות גבוהה יותר מאשר התמרה אורגנואידית תלת-ממדית. באמצעות הפרוטוקולים לעיל, אורגנואידים תלת ממדיים יכולים להיות מחדש מ monolayers 2D נגוע כדי להקל על יצירת קווים יציבים. בזהירות, ניתן לשמור בהצלחה על קווי אורגנואידים של מעי חולדות במשך למעלה משנה, להישאר יציבים לאורך מעברים רבים, להישמר בהקפאה, להפשיר בהצלחה ולהונדסים גנטית באמצעות התמרה לנטיויראלית, ובכך לענות על הצורך במודל אורגנואיד מעי במבחנה נגיש וניתן להעברה השומר על הרלוונטיות הפיזיולוגית לבני אדם.

ארכיטקטורת אפיתל המעי הדק האנושית והרכב התאים מורכבים, ומשקפים את תפקודיהם הפיזיולוגיים. תפקידו העיקרי של המעי הדק הוא לספוג חומרים מזינים מהמזון העובר דרך לומן1. כדי למקסם את הפונקציה הזו, פני השטח של המעי מאורגנים בבלטות דמויות אצבע שנקראות וילי (villi), המגדילות את שטח הפנים הספיגה, ובליטות דמויות הנקראות קריפטות (crypts), המאחסנות ומבודדות את תאי הגזע. בתוך האפיתל נוצרים סוגים שונים של תאי ספיחה והפרשה מיוחדים לביצוע פונקציות נפרדות1. בגלל מורכבות זו, היה קשה למדל רקמות כמו המעי בקווי תאים אימורטליים בעלי מעבר גבוה. עם זאת, המחקר של תאי גזע, במיוחד תאי גזע בוגרים ומנגנוני ההתמיינות שלהם, איפשר התפתחות של תרביות אורגנואידים במעי 3D. השימוש במודלים אורגנואידים שינה את התחום, בין השאר בשל הסיכום שלהם של כמה מרכיבים אדריכליים והטרוגניות סוג התא שנמצאו במעי השלם. אורגנואידים במעיים יכולים להיות בתרבית לטווח ארוך במבחנה עקב שמירה על אוכלוסיית תאי גזע פעילה2.
אורגנואידים במעיים הפכו במהירות למודל הסתגלות לחקר ביולוגיה של תאי גזע, פיזיולוגיה של התא, מחלות גנטיות ותזונה3,4, כמו גם כלי לפיתוח שיטות חדשות למתן תרופות5. בנוסף, אורגנואידים שמקורם בחולים משמשים למידול מחלות, גילוי תרופות וסינון טיפול מותאם אישית, בין היתר 6,7,8,9. עם זאת, אורגנואידים במעיים אנושיים עדיין מציבים אתגרים. זמינות רקמות, דרישות לאישור ועדת ביקורת מוסדית וסוגיות אתיות מגבילות את השימוש הנרחב בדגימות אנושיות. בנוסף, אורגנואידי מעיים אנושיים הנוצרים מקריפטות מעיים דורשים שני תנאי תרבית נפרדים לשמירה על תאי גזע לא ממוינים או כדי לגרום להתמיינות של סוגי תאים בוגרים10. זאת בניגוד ל-in vivo, שבו תאי גזע וסוגי תאים ממוינים בוגרים נוכחים בו זמנית ונוצרים/מתוחזקים ברציפות1. מצד שני, אורגנואידי מעיים של עכברים, הגדלים בקוקטייל פחות מורכב של גורמי גדילה, אינם דורשים את המתג הזה בהרכב המדיה ויכולים לשמור על תאי גזע ותאים ממוינים באותו הקשר מדיה 2,11. עם זאת, הבדלים עיקריים במעי עכבר בהשוואה לבני אדם יכולים להפוך אורגנואידים של עכברים למודל לא אופטימלי במקרים רבים. באופן כללי, אורגנואידי מעיים רבים מיונקים גדולים יותר, כולל סוסים, חזירים, כבשים, פרות, כלבים וחתולים, נוצרו בהצלחה בתנאי תרבית המיושרים יותר עם אורגנואידים של מעי עכברים מאשר תנאי התרבית של אורגנואידי מעיים אנושיים12. ההבדלים בתנאי גורם הגדילה בין אורגנואידים עכבריים לבני אדם משקפים ככל הנראה הבדלים בהרכב נישות תאי גזע ודרישות שונות להישרדות, שגשוג ותחזוקת תאי גזע. לכן, יש צורך במערכת אורגנואידים מודל נגישה ש-1) דומה מאוד להרכב תאי המעי האנושי, 2) מכילה תאי גזע עם דרישות לגורמי גדילה כמו אלה של אורגנואידים אנושיים במעי, ו-3) מסוגלת לשמור ברציפות על תאים לא ממוינים ומובחנים. באופן אידיאלי, המערכת תהיה ממודל נפוץ של בעלי חיים פרה-קליניים, כך שניתן יהיה לתאם ניסויים in vivo ו-in vitro ולהשתמש בהם במקביל.
חולדות הן מודל פרה-קליני נפוץ למחקרים בפיזיולוגיה של המעי ובפרמקולוגיה בשל פיזיולוגיה וביוכימיה של המעי הדומות מאוד שלהן לבני אדם13, במיוחד בכל הנוגע לחדירות מעיים14. גודלם הגדול יחסית בהשוואה לעכברים הופך אותם לנוחים יותר להליכים כירורגיים. בעוד שלעתים משתמשים במודלים של בעלי חיים גדולים, כולל חזירים, חולדות הן מודל זול יותר, דורשות פחות מקום לגידול, ויש להן זנים סטנדרטיים זמינים מסחרית15. החיסרון בשימוש במודלים של חולדות הוא שערכת הכלים הגנטית למחקרי in vivo אינה מפותחת היטב בהשוואה לעכברים, ויצירת קווי חולדות חדשניים, כולל נוקאאוטים, נוק-אין ומהונדסים, היא לעתים קרובות יקרה. פיתוח ואופטימיזציה של מודל אורגנואיד מעיים חזק של חולדות יאפשר מניפולציה גנטית, טיפולים תרופתיים ומחקרי תפוקה גבוהה יותר במודל נגיש השומר על רלוונטיות פיזיולוגית מרכזית לבני אדם. עם זאת, היתרונות של מודל אורגנואיד מכרסם אחד לעומת אחר תלויים מאוד בתהליך או בגן מסוים הנחקר; גנים מסוימים הנמצאים בבני אדם עשויים להיות פסאודוגנים בעכברים, אך לא בחולדות16,17. בנוסף, תת-סוגים ספציפיים של תאים נחשפים יותר ויותר על ידי RNAseq18,19,20 של תא יחיד. לבסוף, מודלים של מחלות מעיים של חולדות ועכבר מציגים לעתים קרובות שינויים ניכרים בפנוטיפים21,22 כך שיש לבחור את המודל המשחזר באופן הדוק יותר את הסימפטומים ואת תהליך המחלה הנראים בבני אדם לעבודה במורד הזרם. יצירת מודל אורגנואיד מעיים של חולדה מספקת גמישות נוספת ובחירה לחוקרים בבחירת מערכת המודל המתאימה ביותר לנסיבות חייהם. כאן, פרוטוקולים קיימים23,24 מורחבים לייצור אורגנואידים במעי חולדות ומתואר פרוטוקול ליצירה ותחזוקה של אורגנואידים במעי חולדות מהתריסריון או הג'ג'ונום. בנוסף, מתוארים מספר יישומים במורד הזרם, כולל זיהום לנטיויראלי, צביעת הר שלם ומבחני נפיחות פורסקולין.

<table><tbody><tr><td>תרבית תלת מימדית מטריקס חולדה קולגן I</td><td>קולטרקס/מו"פ D Systems</td><td>3447-020-01</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>Corning/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף תזונה (50X), ללא סרום</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>100-1061</td><td></td></tr><tr><td>תאי Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T</td><td>R & D Systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco / Thermo Fisher</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I (אנושי)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Technologies Stem Cell Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל מופחת גורם גדילה, פנול ללא אדום</td><td>קורנינג</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021</td><td></td></tr><tr><td>לנולין</td><td>Beantown Chemical</td><td>144255-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco / Thermo Fisher</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>תאי L-Wnt3a</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף (100X)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma אולדריץ'</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>בינוני Gibco/Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>סרט שקוף</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>pLJM1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>19319</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין הידרוכלוריד (PEI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>764965</td><td></td></tr><tr><td>p-phenylenediamine&nbsp;</td><td>Acros Organics/Thermo Fisher</td><td>417481000</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td></td><td>VWR J593-25mg</td><td></td></tr><tr><td>חלבון FGF2 אנושי רקומביננטי</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-250ug</td><td></td></tr><tr><td>חלבון IGF-1 אנושי רקומביננטי</td><td>Biolegend</td><td>B356441</td><td></td></tr><tr><td>חלבון נוגין אנושי רקומביננטי</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי חלבון EGF</td><td>תרמו פישר</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש ספראג דולי</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר</td><td>זן 001</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>אמריקאי ביואנליטי</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE אקספרס אנזים</td><td>גיבקו/תרמו פישר</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 דיהידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

כאשר משתמשים באורגנואידים כדי להעריך פיזיולוגיה והחלטות לגבי גורל התא, חשוב להשתמש במודל שחוזר מקרוב בהקשרים של in vivo . בהתאם לכך, אורגנואידים שמקורם בחולה משמשים למידול מחלות, גילוי תרופות וסינון טיפול מותאם אישית. אורגנואידים של עכברי מעיים משמשים בדרך כלל להבנת היבטים של תפקוד המעי / פיזיולוגיה ודינמיקה של תאי גזע / החלטות גורל. עם זאת, בהקשרים רבים של מחלות, חולדות מועדפות לעתים קרובות על עכברים כמודל בשל הדמיון הפיזיולוגי הגדול יותר שלהן לבני אדם במונחים של פתופיזיולוגיה של מחלות. מודל החולדות הוגבל בשל מחסור בכלים גנטיים זמינים in vivo, ואורגנואידים של חולדות במעיים הוכחו כשבריריים וקשים לתרבית לטווח ארוך. כאן, אנו מתבססים על פרוטוקולים שפורסמו בעבר כדי ליצור אורגנואידים של חולדות מהתריסריון והג'ג'ונום. אנו מספקים סקירה כללית של מספר יישומים במורד הזרם המשתמשים באורגנואידים של מעי חולדות, כולל בדיקות נפיחות פונקציונליות, צביעת הר שלם, יצירת חד-שכבות אנטרואידים דו-ממדיות והתמרה לנטיוויראלית. מודל אורגנואיד החולדות מספק פתרון מעשי לצורך של השדה במודל in vitro השומר על רלוונטיות פיזיולוגית לבני אדם, ניתן למניפולציה גנטית מהירה, וניתן להשיגו בקלות ללא המחסומים הכרוכים ברכישת אורגנואידים במעי אנושי.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעיים של חולדות ומשתמשים בהם במספר יישומים במורד הזרם. חולדות הן לעתים קרובות מודל פרה-קליני מועדף, ומערכת אורגנואיד המעי החזקה ממלאת את הצורך במערכת חוץ גופית שתלווה מחקרי vivo .

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

במחקר זה ביססנו מודל אורגנואיד מעיים של חולדות שהוא חזק בתרביות תאים ארוכות טווח. אנו גם מדגימים את המניפולציות הגנטיות המוצלחות הראשונות באמצעות זיהום לנטיויראלי וטרנספקציה חולפת. מודל זה הוא כלי מצוין למניפולציה של ביולוגיית המעי בחולדה, שבה הכלים הגנטיים הזמינים in vivo מוגבלים.אורגנואידים במעיים של חולדות היו בעבר קשים לתרבית לטווח ארוך. על ידי יצירת מודל אורגנואיד חזק של חולדות הניתן למניפולציה גנטית, אנו מספקים לחוקרים גמישות נוספת ובחירה לבחור מודל אורגנואיד המתאים ביותר לנסיבות הספציפיות שלהם. אורגנואידים של עכברי מעיים משמשים לחקר התנהגות תאי גזע, גורל תאים ופיזיולוגיה, אך הם יכולים להיות מודל תת-אופטימלי.מכיוון שישנם הבדלים מרכזיים בין הביולוגיה של העכבר לבין הביולוגיה האנושית. מצד שני, אורגנואידים במעיים אנושיים יכולים להיות קשים להשגה, ויש להם דרישות מורכבות לתרבית תאים. מודל אורגנואיד החולדות שאנו מתארים כאן שומר על רלוונטיות פיזיולוגית מרכזית לביולוגיה האנושית, בעוד שהוא הרבה יותר קל לגישה ולטיפול מאשר אורגנואידים במעיים אנושיים.פיתוח ואופטימיזציה של מודל אורגנואיד המעי של חולדות מאפשר מניפולציה גנטית, טיפולים תרופתיים ומחקרי תפוקה גבוהה יותר של ביולוגיה של המעי ומודל נגיש עם רלוונטיות פיזיולוגית מרכזית לבני אדם. בנוסף, אורגנואידים אלה של חולדות יאפשרו לחקור פיזיולוגיה ספציפית למין, גורלות תאים, וריאציות פנוטיפיות ומודלים של מחלות במעי.

generation-and-manipulation-of-rat-intestinal-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.

יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

כאן מתוארות שיטות מפורטות לייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי הדק ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. שיטות אלו נועדו לשפר את יכולת השחזור, להרחיב את המדרגיות ולהפחית את זמן העבודה הנדרש לציפוי ומעבר של אורגנואידים.

ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי אפיקליים מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות משובצות מטריצה. הוא גם מתאר את השילוב הבא של EdU בתאים המתרבים באופן פעיל ואת הכימות האוטומטי למחצה של תאים חיוביים ל-EdU.

יצירת אורגנואידים במעי אפיקלי החוצה והערכת קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות תיוג EdU

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

למד ליצור ולתפעל אורגנואידים במעיים של חולדות באמצעות זיהום לנטיוירוס וטרנספקציה זמנית. מודל זה מאפשר מניפולציות גנטיות ומחקר מתקדם בביולוגיית המעי.

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

גלה סרטונים נוספים