הדמיה ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב
16 ביוני 2023
פרוטוקול זה מתאר שיטות שונות שיכולות לסייע בחקר הביולוגיה של ATG9A, כולל אימונופלואורסנציה ואחריה ניתוח תמונה, שיקולי ביטוי יתר חולפים, וחקירת מצב הגליקוזילציה ATG9A באמצעות כתם מערבי.
במעבדה שלנו, אנו מעוניינים להבין אילו ליפידים ומכונות חלבון מעורבים בסחר בשלפוחיות ATG9A. ATG9A חיוני במסלול האוטופגיה להיווצרות והבשלה של פאגופורים. עם זאת, לאחרונה חקרנו את ההשפעה של ATG9A על הומאוסטזיס אברונים.
האתגר הגדול ביותר הוא לחשוף את הפרטים המולקולריים של האופן שבו חלבונים ומכונות חלבונים פועלים. טכנולוגיות כגון הנדסת חלבונים, המבוססות על AlphaFold ו- cryo-EM באתרו ברזולוציה גבוהה מספקות כיום את ההתקדמות הרבה ביותר. עבודת המעבדה שלי ביססה תובנה בסיסית לגבי האופן שבו נוצרים אוטופגוזומים.
תובנות אלה נתמכות על ידי טכניקות מתקדמות של ביולוגיה מולקולרית של התא כמו זו המתוארת כאן. אנו מתארים כמה חסרונות בשימוש בתגי חלבון מסוימים וכיצד ההתנהגות של ATG9A יכולה להשתנות בהתאם ללוקליזציה של התג. אז, או N או C-terminus.
אנו מציעים גם דרכים לזהות חסרונות אלה וכיצד להימנע מהם. מלבד זאת, אנו מספקים גם זרימת עבודה של כימות פיזור ATG9A באופן הניתן לשחזור. כאן, אנו מספקים זרימת עבודה מאימונופלואורסנציה והדמיה חיה לרכישת תמונה וניתוח לניתוח הפיזור של ATG9 בין תאים שונים.
ואנחנו כן חושבים שסטנדרטיזציה של צינורות לניתוח תמונות היא בראש סדר העדיפויות של ביולוגים של התא כדי שיוכלו להגדיל את האמינות ואת יכולת השחזור של התוצאות שלנו.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את מנגנוני הובלת הוסיקולות של ATG9A ואת תפקידם באוטופגיה ובהומאוסטזיס של אברונים. באמצעות תאי HEK293A, השתמשו החוקרים בטכניקות שונות של דימוי תאי כדי להבין את השפעתן של תגי חלבון על הלוקליזציה וההתנהגות של ATG9A.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של התא
- אוטופגיה
- תעתוע חלבונים
רקע
- ATG9A חיוני ליצירת פגופור (phagophore) באוטופגיה.
- המחקר עוסק באתגרים בהבנת המכניקה החלבונית המעורבת בתעתוק של שלפוחיות (vesicle trafficking).
- תובנות נגזרות מטכניקות מולקולריות מתקדמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אימונופלואורסצנציה ודימיון חי של מבני ATG9A
- קווי תאי HEK293A
- ניתוח Western blot וטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות
תוצאות עיקריות
- גישות תיוג שונות משפיעות על ההתנהגות והמיקום התאי של ATG9A.
- ATG9A המבטא ביתר (Overexpressed) עשוי להופיע במיקום משותף (co-localize) עם סמני גולג'י בתנאי הזנה.
- המחקר מספק זרימת עבודה ניתנת לשחזור לניתוח פיזור ATG9A בין מדורי התא השונים.
מסקנות
- המחקר מדגיש את החשיבות של תיוג מדויק בחקר הדינמיקה של חלבונים.
- הממצאים תורמים להבנה טובה יותר של מנגנוני אוטופגיה והומאוסטזיס תאי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
דימוי וכמתית מדויקים של תנועת ATG9A נותנים מענה לאתגר קריטי בתיקוף מטרות לאוטופגיה ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור פורטפוליו של גילוי מוקדם. זרימות עבודה סטנדרטיות למיקום חלבונים ממברנתיים מאפשרות הערכה הדירה של רכיבי מסלול האוטופגיה, ובכך תומכות בביטחון ניבוי במערכות רלוונטיות למחלות. יכולות אלו מהוות בסיס להחלטות go/no-go חסונות עבור תוכניות המכוונות למודולציה של אוטופגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד ATG9A ביניית האוטופגיה ובהעברה של וסיקולות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרה של לוקליזציית חלבונים ודינמיקת העברה.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בנוגע למעורבות המטרה ולבקרת המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק זרימות עבודה סטנדרטיות של אימונופלורסצנציה והדמיה חיה (live imaging) לניתוח חלבון ממברנה.
- מאפשר כימות הדיר השחזר עבור פיזור חלבונים במחלקות תאיות שונות.
- תומך בהכנת בדיקה לסריקת תרכובות המכוונות למסלולי אוטופגיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מעמיק תובנות מכניסטיות באמצעות מודלים של הומיאוסטזיס של אברונים הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מודולטורים של אוטופגיה.
- תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי הבהרת תהליכי הובלת חלבונים בתנאים פיזיולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
סבב העבודה הזה של דימות וכמימות מציב את ניתוח התנועה של ATG9A בנקודת המפגש בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף מטרות ומחקר פרה-קליני עבור תוכניות הקשורות לאוטופגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקידו של ATG9A ביצירת פגופורים וביוזמה של אוטופגיה.
- סריקה: מספק מדדים כמותיים הניתנים לשחזור עבור לוקליזציה ותנועה של חלבונים.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של מבנים מסומנים ודפוסי תנועה תחת תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מספק רצף מנגיסטי להערכת מודולציה של אוטופגיה במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים תהליך דימוג'ינג סטנדרטי וניתן להרחבה למחקרי חלבוני ממברנה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות של אוטופגיה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של זרימות עבודה מבוססות דימיון.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקה של תהליכים (go/no-go) ואת יעילות ההון עבור פורטפוליוים המתמקדים באוטופגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תוכניות המכוונות לתעבורה של חלבוני ממברנה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימנופלואורסצנציה, דימוי חי (live imaging) ואנליזה כמותית של תמונות.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ותשתית אנליטית חסונה.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של אסטרטגיות תיוג ופרוטוקולי דימוי.
- חובה להתחשב בהשפעות של מיקום התג על לוקליזציה ואגרגציה של חלבונים.
- מגבלות מעשיות כוללות ארטיפקטים פוטנציאליים כתוצאה מביטוי יתר ומלוקליזציה שגויה המושפעת מהתג.
