Name: הדמיה ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: חקור את מנגנוני התנועה של ATG9A בתאי HEK293A באמצעות טכניקות הדמיה תאיות מתקדמות. המחקר מספק תובנות לגבי השפעת תגיות חלבון על התנהגות ATG9A ומיקומו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לרוקו ד'אנטונו על ההגהה של היבטי כתב היד, כמו גם לכל חברי המעבדה לביולוגיה מולקולרית של אוטופגיה (MCBA) בהווה ובעבר על הדיונים שהובילו לחידוד פרוטוקולים אלה. A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T, נתמכו על ידי מכון פרנסיס קריק המקבל את מימון הליבה שלו ממחקר הסרטן בבריטניה (CC2134), המועצה הבריטית למחקר רפואי (CC2134). מחקר זה מומן במלואו או בחלקו על ידי Wellcome Trust (CC2134). לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY לכל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.

חקירת לוקליזציה של ATG9A בתאים

<ol><li>Young, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+and+ULK1-dependent+cycling+of+mammalian+Atg9+between+the+TGN+and+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipid+scrambling+activity+and+role+in+autophagosome+formation+of+ATG9A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).</li>
<li>Matoba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9+is+a+lipid+scramblase+that+mediates+autophagosomal+membrane+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).</li>
<li>Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+perspective+of+mammalian+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).</li>
<li>Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+in+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes in biology and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. , (2023).</li>
<li>Sawa-Makarska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+autophagosome+nucleation+defines+Atg9+vesicles+as+seeds+for+membrane+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation.</a> Science. 369 (6508), (2020).</li>
<li>Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome+biogenesis%3A+From+membrane+growth+to+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure.</a> Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085(2020).</li>
<li>Orsi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+transient+interactions+of+Atg9+with+autophagosomes%2C+but+not+membrane+integration%2C+are+required+for+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).</li>
<li>Judith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG9A+shapes+the+forming+autophagosome+through+Arfaptin+2+and+phosphatidylinositol+4-kinase+IIIbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta.</a> Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+initiation+by+ULK+complex+assembly+on+ER+tubulovesicular+regions+marked+by+ATG9+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles.</a> Nature Communications. 7, 12420(2016).</li>
<li>Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+recruitment+of+mammalian+ATG+proteins+to+the+autophagosome+formation+site%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site.</a> Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).</li>
<li>Guardia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+human+ATG9A%2C+the+only+transmembrane+protein+of+the+core+autophagy+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery.</a> Cell Reports. 31 (13), 107837(2020).</li>
<li>Soreng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNX18+regulates+ATG9A+trafficking+from+recycling+endosomes+by+recruiting+Dynamin-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2.</a> EMBO Reports. 19 (4), e44837(2018).</li>
<li>Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+that+mediate+the+sorting+of+human+ATG9A+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).</li>
<li>Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNX18+tubulates+recycling+endosomes+for+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bif-1-Dynamin+2+membrane+fission+machinery+regulates+Atg9-containing+vesicle+generation+at+the+Rab11-positive+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs.</a> Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).</li>
<li>Imai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9A+trafficking+through+the+recycling+endosomes+is+required+for+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation.</a> Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>van Vliet, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG9A+and+ATG2A+form+a+heteromeric+complex+essential+for+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation.</a> Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).</li>
<li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradford+assay+for+determining+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bradford assay for determining protein concentration.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269(2020).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+antibody+specificities+for+immunohistochemistry+by+protein+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting.</a> Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).</li>
<li>Lamb, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBC1D14+regulates+autophagy+via+the+TRAPP+complex+and+ATG9+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic.</a> EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).</li>
<li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBC1D14+regulates+autophagosome+formation+via+Rab11-+and+ULK1-positive+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).</li>
<li>Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatidylinositol+3-phosphate-binding+protein+SNX4+controls+ATG9A+recycling+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy.</a> Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).</li>
<li>DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+leading+edge+F-actin+labeling+using+multiple+actin+probes%2C+fixation+methods+and+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities.</a> BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).</li>
<li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycloheximide%3A+Aspects+of+inhibition+of+protein+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li>
<li>Webber, J. L., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+autophagy+by+p38alpha+MAPK+through+mAtg9+and+p38IP%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP.</a> EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).</li>
<li>Claude-Taupin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG9A+protects+the+plasma+membrane+from+programmed+and+incidental+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization.</a> Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).</li>
<li>Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+co-localization+-+Co-occurrence+versus+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Image co-localization - Co-occurrence versus correlation.</a> Journal of Cell Science. 131 (3), 211847(2018).</li>
<li>D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%27Antuono%2C+R+%22Principles+of+Light+Microscopy%3A+From+Basic+to+Advanced%22">Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced</a>. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).</li>
</ol>

S.A.T. מכהנת בוועדה המדעית המייעצת של Casma Therapeutics.

מחקר זה ממחיש את הכלים השונים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור לוקליזציה של ATG9A. ראשית, מחקר זה מתאר כיצד ATG9A ניתן לדמיין על ידי immunofluorescence וכיצד ניתן לכמת זאת. שנית, אסטרטגיות שניתן להשתמש בהן כדי לתייג ATG9A עם סמן פלואורסצנטי להדמיה בתאים קבועים או חיים מושווים. לבסוף, עבודה זו מתארת כיצד לחקור ולהשתמש במצב הגליקוזילציה של ATG9A כדי לקבוע אם ATG9A יצא מהמיון ונסחר דרך הגולג'י.
לגבי אפיון לוקליזציה אנדוגנית ATG9A על ידי אימונופלואורסצנציה, יש להקפיד על שיטות הקיבוע והחדירות הנהוגות לניסוי. על פי הנהלים הסטנדרטיים המתוארים כאן, קיבוע paraformaldehyde יחד עם permeabilization digitonin הם תנאים טובים כדי לדמיין הן ATG9A הקשורים Golgi ו ATG9A חיובי שלפוחית7. יחד עם הקיבוע והחלחול, גם עיתוי הדגירה עם פתרון הנוגדנים הראשוני הוא קריטי. ראינו, אך לא תועדנו, כי ריכוזים גבוהים יותר של תמיסת נוגדנים ראשונית וזמני דגירה ארוכים יותר יכולים להוביל לעלייה מטעה בצביעת גולג'י של ATG9A, אשר בסופו של דבר פוגעת בזיהוי של חלוקה מחדש של ATG9A לתאי ממברנה אחרים. בנוסף, מאחר ש-ATG9A קיים בתאים תוך-תאיים רבים 1,13,17,22,23,24,27,28,חשוב להשתמש בסמנים ספציפיים של הממברנה, יחד עם ATG9A, כדי לזהות היכן ATG9A ממוקם. מספר גישות שימשו בעבר לכימות לוקליזציה של ATG9A, כולל מקדם המתאם של פירסון עבור לוקליזציה29. עם זאת, החפיפה החלקית של ATG9A עם הגולג'י ותא השלפוחית המובהק מובילה למספר גבוה של חריגות פיקסלים, מה שעלול להטות את הפרשנות של מקדם המתאם. מסיבה זו עדיפה גישה פשטנית יותר המבוססת על היחס בין הפלואורסצנטיות הממוצעת בשני התאים המנותחים, וגישה זו פחות רגישה לשונות בין תאים. למידע נוסף על ניתוח תמונות באמצעות מיקרוסקופיה, הקוראים מופנים לספר זה פרק30.
כאשר חוקרים את מצב הגליקוזילציה של ATG9A, בחירת הג'לים להפעלת הכתמים המערביים חשובה. עבור פרוטוקול זה, 3%-8% ג'ל Tris-אצטט מועדפים מכיוון שהם מציעים את הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור חלבונים גדולים יותר, אך ניתן להשתמש גם בהרכבי ג'ל חלופיים או חוצצים רצים המציעים הפרדה טובה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. הנסיין יכול להבטיח הפרדה מקסימלית של חלבונים על ידי הגדלת זמן האלקטרופורזה.
בעת הכנת הדגימות כדי לדמיין ATG9A על כתם מערבי, יש להקפיד לא להרתיח את הדגימות לאחר הוספת חיץ Laemmli; רתיחה ב 95 ° C גורם להיווצרות של אגרגטים ATG9A, ולאחר מכן, ATG9A אינו נודד ביעילות לתוך ג'ל1. חימום הדגימות ב 65 ° C במשך 5 דקות מומלץ27.
רמות גבוהות של טרנספקציה מובילות בדרך כלל להצטברות גבוהה יותר של ATG9A במיון, בעוד רמות ביטוי מתונות מסייעות ללוקליזציה הפיזיולוגית של החלבון. באופן אנקדוטלי, זמני דגירה של 72 שעות במקום 48 שעות מסייעים לעתים קרובות בהפחתת לוקליזציה של מיון. יש לציין כי mRFP-ATG9A יכול לדווח במדויק על סחר ATG9A ולתפקד אם הרמות נשלטות באמצעות רמות ביטוי או באמצעות קווי תאים יציבים 8,9,22,27.
כישלונה של אוכלוסייה של ATG9A להתבטא יתר על המידה לרכוש גליקנים בוגרים מקושרי N יכול לשמש כקריאה לסחר ATG9A מוטרד. בעת מוטציה או מחיקה של אזורים מסוימים של ATG9A, קיים סיכון של שימור מוגבר של ER, אשר יכול להוביל לכישלון לרכוש גליקנים בוגרים N-linkans, ולכן, רצועת ATG9A נודדת מהר יותר על כתם מערבי. חוקרים העובדים עם מבני ATG9A קטועים צריכים לבדוק שימור ER, מצבי גליקוזילציה ולוקליזציה של גולג'י.
עבור דימות תאים חיים של ATG9A, מיקרוסקופ Airyscan, המסתמך על הפונקציה Airyscan המהירה, מספק רזולוציה אופטימלית של בדרך כלל כ -120 ננומטר. לדיוק לוקליזציה, קצב פריימים של כ- 1-2 פריימים לשנייה (fps) במצב רזולוציית על הוא אופטימלי, בהתאם למספר הערוצים המצולמים. מיקרוסקופים קונפוקליים דומים שיכולים לצלם במהירות גבוהה יכולים לשמש גם להדמיה של שלפוחיות ATG9A; עם זאת, יש לציין כי מהירות ההדמיה יכולה להשפיע ישירות על זיהוי אירועים, ולכן, להשפיע על פרשנות הנתונים.
לסיכום, הפרוטוקולים המוצגים מתארים דרכים לכמת ולאפיין לוקליזציה של ATG9A על ידי אימונופלואורסנציה, מיקרוסקופ תאים חיים ומצב הגליקוזילציה שלו. פרוטוקולים אלה יכולים לסייע לחוקרים העובדים עם ATG9A ולעזור למנוע כמה מלכודות.

ATG9A הוא החלבון הטרנסממברנלי היחיד של מנגנון הליבה של אוטופגיה והוא מועבר בין גולג'י לבין תא שלפוחית ציטוסולי ATG9A, העובר דרך התא האנדוזומלי1. ATG9A, שהיה חידתי זמן רב, תואר לאחרונה כמתפקד כסקרמבלז שומנים, שכן הוא מאזן שומנים על פני דו-שכבות קרום 2,3. כעת ברור כי ATG9A שוכן בראש ההיררכיה בהיווצרות אוטופגוזום, והמחקר שלו הוא, לפיכך, חיוני להבנת אוטופגיה 4,5. לכן, שלפוחיות ATG9A הוצעו לאחרונה כ"זרע" של אוטופגוזום 6,7. עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי ATG9A רק אינטראקציה זמנית עם אוטופגוזום יוצר בשלבים שונים של הבשלתו ואינו משתלב בקרום האוטופגי 6,8,9,10,11. לפיכך, יש צורך בחקירות נוספות כדי לפענח לחלוטין את התפקיד ואת הפונקציות המרובות הפוטנציאליות של ATG9A בהיווצרות אוטופגוזום. עם זאת, הפער בין המודלים הנוכחיים לנתונים הקודמים יכול להיפתר רק באמצעות ניסויים ממוקדים המטפלים בסחר ב- ATG9A באמצעות גישות כמותיות מתוקפות וסמנים תוך תאיים.
ישנם כלים שונים המשמשים לחקר ATG9A, כל אחד עם יתרונות וחסרונות, והשימוש בכלים אלה מסובך בגלל המבנה של ATG9A, הפונקציה המולקולרית שלו, והסחר הסלולרי 2,8,12. ATG9A יוצר הומוטרימר, הוא glycosylated, והוא מועבר ברחבי התא לתאים כגון Golgi, אנדוזומים, ואת קרום פלזמה13,14. בהתחשב במסלול המורכב שלו, ישנם מספר אתגרים בפירוש קריאות כגון פיזור ATG9A מהגולג'י על טיפולים או גירויים ספציפיים (כגון רעב חומרים מזינים וסרום). ATG9A הוא דינמי ביותר במונחים של סחר שלפוחית; ואכן, שלפוחיות המכילות ATG9A הוגדרו כתא ATG9A בהקשר של אוטופגיה הנגרמת מרעב. תא ATG9A, שנוצר על ידי שלפוחיות דינמיות אלה, מקיים אינטראקציה זמנית עם מספר אברונים תוך תאיים 8,15,16,17. הטכניקות המתוארות כאן, כולל immunofluorescence, הדמיה חיה, בדיקות glycosylation, אמור לסייע בזיהוי והבנה של ביולוגיה ATG9A. בפרט, הגישות המתוארות במאמר זה יסייעו לענות על שאלות לגבי לוקליזציה למדורי תאים ספציפיים ואינטראקציות עם שותפי חלבון ספציפיים ו/או תאי ממברנה. מכיוון שלתחום הליבה ההידרופובית המשומרת ATG9A (תחום PFAM PF04109) יש טופולוגיה ייחודית ומחזורי ATG9A בין מספר תאי ממברנה, החוקרים צריכים להיות מודעים למלכודות וממצאים מסוימים בעת ביטוי יתר זמני של ATG9A, כולל, אך לא רק, שימור רשתית אנדופלסמית (ER). בעיות אפשריות אחרות עלולות להתעורר עקב קיפול שגוי של החלבון, צבירה מלאכותית בתנאי גידול רגילים, או זיהוי לא מספיק של תא השלפוחית עקב פרוטוקולי חדירות תת-אופטימליים לאימונופלואורסנציה.
בעת הדמיה אנדוגנית ATG9A, יש להקפיד על הכנת הדגימה ורכישת התמונה כדי להבטיח את איכות הניתוח הכמותי הבא ואת הפרשנות הנכונה של הנתונים. שילוב הטכניקות המתוארות במאמר זה עם גישות ביוכימיות סטנדרטיות (כגון משקעים חיסוניים או ניסויים מושכים למטה שאינם מתוארים כאן) אמור לשפר את הבנתנו את תפקוד ATG9A. ערכת כלים ניסיונית זו נועדה לסייע לחוקרים חדשים לנווט בחלק מהבדיקות הדרושות כדי לקבוע את תפקודו של ATG9A במערכת הביולוגית שלהם.

<table><tbody><tr><td>24 צלחות מולטי-באר&nbsp;</td><td>פלקון</td><td>353047</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | קוטר זכוכית 14 מ"מ | לא מצופה</td><td>MATTEK</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>צלחת תרבית תאים למיקרוסקופיה של תאים חיים</td></tr><tr><td>4x Laemmli מאגר דגימה&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה 60 מ"מ&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10099170</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A22287</td><td>Actin stain</td></tr><tr><td>anti-ATG9A נוגדן</td><td>תוצרת בית</td><td>STO-215</td><td>ארנב אנטי N-terminal פפטיד ATG9A</td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG, מקושר לפרוקסידאז&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10794347/NA934-1ml</td><td>נוגדן משני לארנב פוליקלונלי STO-215</td></tr><tr><td>נוגדן נגד RFP</td><td>Evrogen</td><td>AB233</td><td>עבור Western Blot</td></tr><tr><td>ATG9A נוגדן חד שבטי (14F2 8B1), נוגדן</td><td>Invitrogen Invitrogen</td><td>15232826</td><td>לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>ATG9A-eGFP</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>Construct המבטא ATG9A</td></tr><tr><td>Bemis Parafilm</td> מתויג<td>Thermofisher Scientific</td><td>11747487</td><td>סרט תרמופלסטי איטום עצמי&nbsp;</td></tr><tr><td>תרכיז ריאגנט צבע לבדיקת חלבון Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>לקביעת ריכוז החלבון</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10735086001</td><td>לחסימת תיוג לא ספציפי</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>/</td><td></td><td>For PBS ו-EBSS</td></tr><tr><td>cOmplete מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>רוש</td><td>11697498001</td><td>תוסף במאגר ליזה למניעת פירוק חלבון</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat אוגר אנטי-ארמני IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>127-165-099</td><td>נוגדן משני לנוגדנים i14F2 8B1 ל-mmunofluorescence</td></tr><tr><td>Cyclohexamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>66-81-9</td><td>להפסקת תרגום חלבון</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>/</td><td></td><td>ל-EBSS</td></tr><tr><td>Digitonin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>300410</td><td>לתאים חודרים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck</td><td>D6546-6x500ml</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>eGFP-ATG9A</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>Construct המבטא ATG9A</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td> מתויג <td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>תוסף ל-DMEM לתרבית תאים</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>/</td><td>https:/fiji.sc/</td><td>תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח</td></tr><tr><td>הוכסט&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H3570</td><td>מכתים את הגרעין</td></tr><tr><td>KCl</td><td>/</td><td></td><td>עבור EBSS</td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>67513</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>להעברת תאים</td></tr><tr><td>LSM880 מיקרוסקופ Airyscan&nbsp;</td><td>Zeiss</td> <td>/</td> <td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>MgCl2</td> <td>/</td><td></td> <td>עבור PBS</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td> <td>/</td><td></td> <td>עבור פתרון הרכבה EBSS</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td>לכיסויי זכוכית להרכבה קבועה</td></tr><tr><td>NaCl</td> <td>/</td><td></td> <td>עבור EBSS</td></tr><tr><td>NaH 2PO4.2H2O</td><td>/</td><td></td><td>עבור EBSS</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>/</td><td></td><td>עבור EBSS</td></tr><tr><td>NuPAGE 3 עד 8%, Tris-Acetate, 1.5 מ"מ, מיני ג'ל חלבון</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>EA0378BOX</td><td>עבור Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS מאגר ריצה (20x)</td> <td>Life Tech</td><td>NP0002</td><td>עבור Western Blotting</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>Medium Thermofisher Scientific</td><td>31985062</td><td>לטרנספקציה של תאים</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td>לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A</td> מבנה <td>תוצרת</td><td></td> בית <td>המבטא מתויג ATG9A</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>/</td><td></td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>PNGaseF</td><td>NEB</td><td>&nbsp; P0710S</td><td>להסרת גליקנים מקושרים N</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד מול wt 70,000-150,000</td><td>Merck</td><td>P0899</td><td>לציפוי כיסויים</td></tr><tr><td>מהיר PNGase F אנזים</td><td>NEB</td><td>P07105</td><td>להסרת גליקנים מקושרים</td></tr><tr><td>N RFP-ATG9A</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>Construct המבטא ATG9A מתויג ATG9A</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13454259</td><td>חומר ניקוי לתא תמיסת</td></tr><tr><td>ליזה טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>Whatman סינון נייר</td><td>Merck</td><td>WHA1001325</td><td>עבור Western Blot ו- IF</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>עבור Western Blotting</td></tr><tr><td>Zen Black edition</td><td>Zeiss</td> <td>/</td> <td>משמש להפעלת LSM 880</td></tr></tbody></table>

הדמיה atg9a, חלבון ממברנה רב-מורחב

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

אוטופגיה היא מסלול שמור מאוד שהתא משתמש בו כדי לשמור על הומאוסטזיס, לפרק אברונים פגומים, להילחם בפתוגנים פולשים ולשרוד בתנאים פתולוגיים. קבוצה של חלבונים, הנקראת חלבוני ATG, מרכיבים את מנגנון הליבה של אוטופגיה ועובדים יחד בהיררכיה מוגדרת. מחקרים בשנים האחרונות שיפרו את הידע שלנו על מסלול האוטופגיה. לאחרונה, הוצע כי שלפוחיות ATG9A נמצאות בלב האוטופגיה, מכיוון שהן שולטות בסינתזה דה נובו מהירה של אברון הנקרא פאגופור. המחקר של ATG9A הוכח כמאתגר, שכן ATG9A הוא חלבון טרנסממברנלי, והוא נמצא בתאי ממברנה שונים. ככזה, הבנת הסחר בו הוא מרכיב חשוב להבנת האוטופגיה. כאן מוצגות שיטות מפורטות שניתן להשתמש בהן כדי ללמוד ATG9A, ובפרט, לוקליזציה שלה באמצעות טכניקות immunofluorescence, אשר ניתן להעריך ולכמת. המלכודות של ביטוי יתר ארעי מטופלות גם הן. האפיון הנכון של פונקציית ATG9A והסטנדרטיזציה של טכניקות לניתוח הסחר בה חיוניים לאפיון נוסף של האירועים השולטים בהתחלת אוטופגיה.

ATG9A הוא חלבון טרנסממברנה הקשור למספר תאי קרום 8,17,22,23,24. בתנאים בסיסיים, ATG9A ממוקם בעיקר ברשת טרנס-גולג'י (TGN), כפי שמצוין על-ידי האימונופלואורסצנטיות של החלבון האנדוגני והחפיפה עם GM130, סמן cis-Golgi (איור 1A), כמו גם בשלפוחיות קטנות החופפות חלקית לתא המיחזור האנדוציטי (ERC)23. ניתן לזהות לוקליזציה ATG9A בגולג'י באמצעות פרוטוקולים שונים של אימונופלואורסנציה. עם זאת, החלק השלפוחית של ATG9A, כמו גם שינוי הלוקליזציה שלו, במיוחד הגידול במאגר השלפוחית, בתגובה לגירויים ספציפיים כגון רעב מזין וסרום, יכול להיות משתנה למדי בעוצמתו וקשה לדמיין עם גישות הדמיה קונבנציונליות. היחס בין ATG9A מקומי בגולג'י לבין ATG9A מקומי לשבר שלפוחית נקרא קצב פיזור ATG9A. כדי לזהות שינויים בקצב פיזור ATG9A, למשל בטיפול EBSS, המשמש לדלדול חומצות סרום ואמינו, סמן גולג'י כגון GM130 או TGN46 וסמן שלד ציטו-שלד כגון פאלואדין, אשר מכתים את מתאר התא25, שימושיים לכימות קל של פיזור ATG9A (איור 1B). חשוב לציין, ניתוח יחס הפלואורסצנטיות הממוצע יכול להתפרש רק כמדד השוואתי בין תנאים ולא כשיעור פיזור קבוע. היחס בין המדורים תלוי מאוד בגורמים ביולוגיים ולא ביולוגיים כמו קו התאים שבו משתמשים, איכות הצביעה או שיטות הסף המיושמות (איור 1B). מסיבה זו, החוקר צריך להקים צינור המסוגל לזהות העשרת ATG9A Golgi בתנאי הניסוי הספציפיים שלהם ולאחר מכן להרחיב את הניתוח עם אותם פרמטרים לכל התמונות בקבוצה להיות מנותח. תמונות בינאריות מייצגות ואזורים שנבחרו לניתוח פלואורסצנטיות ממוצעת ATG9A מוצגים כמדריך באיור 1B.
ATG9A מכיל מספר תחומים טרנסממברנליים שמשני צדדיהם שני תחומים גמישים יחסית ובלתי מובנים N ו-C טרמינליים, מתוכם רצף C-terminal מקיף כמעט מחצית מהחלבון12. חשוב לציין, דפוס הלוקליזציה של ATG9A בעל ביטוי יתר יכול להיות מושפע מאיזה קצה חלבון מתויג (איור 2A). בפרט, כאשר משתמשים במערכות ביטוי ארעיות ומתייגים ATG9A ישירות על מסוף N שלו עם תג פלואורסצנטי (למשל, eGFP, mRFP או נגזרות), לוקליזציה Golgi שלו יכולה להיפגע חלקית, עם פחות העשרה נראית בתנאי בסיס (כלומר, מוזן), בעוד שלפוחיות ATG9A עדיין נראות בקלות (איור 2A). נראה כי תיוג ATG9A על מסוף C שלו גורם מעט לצבירים חיוביים גדולים יותר של GFP שניתן לצבור. לבסוף, גרסה מונומרית של mRFP-ATG9A מראה גם צבירים פלואורסצנטיים דומים של שלפוחיות וצביעת גולג'י קטנה בתאים בעלי ביטוי יתר (איור 2A).
ATG9A מתקפל בקרום חדר המיון לפני שהוא מועבר לשלפוחיות גולג'י ו-ATG9A. במהלך שהותו בחדר המיון, ATG9A משתנה על ידי גליקנים מקושרי N על אספרגין 99, ולאחר מכן עם הגעתו לגולג'י, הוא רוכש גליקנים מורכבים ובוגרים מקושרי N 1,14. שינוי זה על ידי גליקוזילציה יכול להיות מזוהה באמצעות כתם מערבי על ידי הופעת פס כפול14. בהתאם ללוקליזציה התוך-תאית שלו, רוב ATG9A האנדוגני מכיל גליקנים מורכבים מקושרי N, ולכן רצועת המשקל המולקולרי הגבוהה יותר היא הדומיננטית, עם רצועת משקל מולקולרית נמוכה יותר שנראית גם היא (איור 2B). הנוכחות של פס כפול נראית בקלות רבה ביותר כאשר משתמשים בג'ל Tris-אצטט כדי לשפר את הרזולוציה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר (איור 2B, בקרה, t = 0). כאשר החלבון האנדוגני עובר טיפול PNGase F (פפטיד:N-גליקוזידאז F), אשר מסיר את רוב הגליקנים המורכבים המקושרים ל-N, החלבון פועל כפס יחיד (איור 2B, PNGase F, t = 0). לכן, מצב הגליקוזילציה N-linked של ATG9A יכול לשמש כפרוקסי לניטור היציאה של ATG9A מה-ER ל-Golgi, אשר משתקף ביחס היחסי בין שני הפסים.
כאשר mRFP-ATG9A בונה מבנה ארעי, החלבון בעל ביטוי יתר מצטבר בתחילה בחדר המיון, אולי מאחר שמכונות הסחר אינן מסוגלות לקפל ולהעביר את כל ATG9A, ורצועת המשקל המולקולרי הנמוכה יותר היא הדומיננטית (איור 2C, בקרה t = 0). יש לציין כי לאחר 24 שעות של ביטוי mRFP-ATG9A, קיימת התפלגות שווה בקירוב בין הפסים העליונים והתחתונים, מה שמרמז על כך שמאגר mRFP-ATG9A נע לתוך גולג'י (איור 2C, Control, t = 24). אם התאים מטופלים עם cycloheximide (CHX), אשר חוסם סינתזת חלבון דה נובו 26, קיפול ויציאה של ATG9A מן המיון ניתן להבהיר. כאשר החלבון האנדוגני מקופל, מסוכרר ושוכן בגולג'י, הטיפול ב-CHX אינו משנה באופן משמעותי את היחס בין פסי המשקל המולקולריים הנמוכים והגבוהים יותר (איור 2B, בקרה). אולם באמצעות שימוש בביטוי הארעי של mRFP-ATG9A, טיפול CHX מקדם הצטברות של רצועת משקל מולקולרית גבוהה יותר (איור 2C, Control, CHX t = 24). רצועת mRFP-ATG9A בעלת המשקל המולקולרי הגבוה יותר קורסת לתוך הרצועה התחתונה לאחר טיפול ב-PNGase F (איור 2C, PNGase F, t = 24). הנתונים האלה מראים שהחלבון האנדוגני רוכש גליקנים בוגרים במהירות, כפי שמשתקף מהדומיננטיות של רצועת המשקל המולקולרית הגבוהה יותר, ומרדף CHX אינו משפיע על היחס בין הפסים הכפולים (איור 2B). במקרה של mRFP-ATG9A בעל ביטוי יתר חולף, טיפול CHX גורם להצטברות של הפס העליון, מה שמצביע על כך שגליקנים בוגרים יותר נרכשים כאשר בריכת המיון מתקפלת ויוצאת מהמיון אל הגולג'י (איור 2C).
הוספת מקשר בין רצף ATG9A לבין התגים הפלואורסצנטיים יכולה להיות מועילה בקידום לוקליזציה פיזיולוגית יותר וסחר של החלבון. מיזוג רצף 3x-FLAG (24 חומצות אמינו) בין פלואורופור N-terminal ו-ATG9A מסייע לחלבון בעל ביטוי יתר להתנהג באופן דומה לחלבון האנדוגני (איור 3). ואכן, mCherry-3xFLAG-ATG9A בעל ביטוי יתר מתחבר לסמן Golgi GM130 בתנאי הזנה (איור 3A). חשוב לציין שלוקליזציה זו ותא שלפוחית ATG9A נשמרים לאורך זמן, מה שמאפשר מחקר מרחבי-זמני של הסחר ב-ATG9A (איור 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65349/65349fig01.jpg"> איור 1: ניתוח תמונות של לוקליזציה אנדוגנית של ATG9A. (A) תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת של ATG9A אנדוגני (אדום), GM130 כסמן גולג'י (ירוק) ופאלואדין כדי להמחיש את שלד האקטין (ציאן). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) תהליך עבודה של ניתוח התמונה כדי לקבוע את החלק של ATG9A אנדוגני הממוקם באזור Golgi. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65349/65349fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65349/65349fig02.jpg"> איור 2: ניתוח של מבנים המתויגים באופן פלואורסצנטי ATG9A על-ידי לוקליזציה וגליקוזילציה . (A) eGFP N-terminally tagged ATG9A פחות מקומי בגולג'י ושוכן בעיקר בשלפוחיות. ATG9A המתויג ב-eGFP C מציג אגרגטים בתוך התא (חלק מהדוגמאות מסומנות בראשי חץ לבנים; eGFP-ATG9A ו-ATG9A-eGFP מסומנים בירוק). mRFP N-terminally tagged ATG9A הוא פחות מקומי ב Golgi ומתגורר בעיקר שלפוחיות. N מציין את המיקום המשוער של גרעין התא, וה- mRFP-ATG9A מסומן באדום. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) ATG9A אנדוגני מופיע כשני פסים כאשר הוא מנותח על ידי כתם מערבי (ראשי חץ): פס עליון (גליקנים מורכבים מקושרי N) ופס תחתון (ללא גליקנים בוגרים מקושרי N). הטיפול עם cyclohexamide (CHX) אינו משפיע על היחס בין הפסים העליונים והתחתונים. הטיפול ב- PNGase F גורם להיעלמות הרצועה העליונה. (C) לאחר טרנספקציה חולפת של ATG9A המתויג על ידי mRFP בתאי HEK293A, נראים שני פסים בולטים על כתם מערבי (ראשי חץ). הטיפול ב- PNGase F גורם להיעלמות הרצועה העליונה. טיפול ב- CHX לאחר טרנספקציה מוביל לגליקוזילציה מוגברת מכיוון שמאגר ATG9A הנגוע מועבר מהמיון לגולג'י. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65349/65349fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65349/65349fig03.jpg"> איור 3: ניתוח לוקליזציה של mCherry-3xFLAG-ATG9A על-ידי אימונופלואורסנציה והדמיה חיה. (A) ניסויים אימונופלואורסצנטיים של תאי HEK293A בעלי ביטוי יתר זמני של mCherry-3xFLAG-ATG9A ומוכתמים בסמן Golgi GM130. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. mCherry-3xFLAG-ATG9A צבוע באדום, וסמן GM130 Golgi צבוע בירוק. (B) מונטאז' מניסויי הדמיה חיה בתאי HEK293A המבטאים באופן ארעי את mCherry-3xFLAG-ATG9A. N מציין את המיקום המשוער של הגרעין. מסגרת זמן = 1 fps. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. mCherry-3xFLAG-ATG9A צבוע באדום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65349/65349fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטות שונות שיכולות לסייע בחקר הביולוגיה של ATG9A, כולל אימונופלואורסנציה ואחריה ניתוח תמונה, שיקולי ביטוי יתר חולפים, וחקירת מצב הגליקוזילציה ATG9A באמצעות כתם מערבי.

הדמיה ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...

במעבדה שלנו, אנו מעוניינים להבין אילו ליפידים ומכונות חלבון מעורבים בסחר בשלפוחיות ATG9A. ATG9A חיוני במסלול האוטופגיה להיווצרות והבשלה של פאגופורים. עם זאת, לאחרונה חקרנו את ההשפעה של ATG9A על הומאוסטזיס אברונים.האתגר הגדול ביותר הוא לחשוף את הפרטים המולקולריים של האופן שבו חלבונים ומכונות חלבונים פועלים. טכנולוגיות כגון הנדסת חלבונים, המבוססות על AlphaFold ו- cryo-EM באתרו ברזולוציה גבוהה מספקות כיום את ההתקדמות הרבה ביותר. עבודת המעבדה שלי ביססה תובנה בסיסית לגבי האופן שבו נוצרים אוטופגוזומים.תובנות אלה נתמכות על ידי טכניקות מתקדמות של ביולוגיה מולקולרית של התא כמו זו המתוארת כאן. אנו מתארים כמה חסרונות בשימוש בתגי חלבון מסוימים וכיצד ההתנהגות של ATG9A יכולה להשתנות בהתאם ללוקליזציה של התג. אז, או N או C-terminus.אנו מציעים גם דרכים לזהות חסרונות אלה וכיצד להימנע מהם. מלבד זאת, אנו מספקים גם זרימת עבודה של כימות פיזור ATG9A באופן הניתן לשחזור. כאן, אנו מספקים זרימת עבודה מאימונופלואורסנציה והדמיה חיה לרכישת תמונה וניתוח לניתוח הפיזור של ATG9 בין תאים שונים.ואנחנו כן חושבים שסטנדרטיזציה של צינורות לניתוח תמונות היא בראש סדר העדיפויות של ביולוגים של התא כדי שיוכלו להגדיל את האמינות ואת יכולת השחזור של התוצאות שלנו.

imaging-atg9a-a-multi-spanning-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

מוטציות הגורמות למחלות ביקטינו יכולות לשנות את תפקוד cytoskeletal. דינמיקת Cytoskeletal הם לכמת באמצעות הדמיה של חלבונים מתויגים fluorescently באמצעות כולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפנימי. כדוגמא, חלבון cytoskeletal, Aip1p, שינה לוקליזציה ותנועה בתאים המבטאים את איזופורם אקטין המוטציה, R256H.

Aip1p Dynamics שונה על ידי מוטצית R256H ביקטין

בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.<br...

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מסוים בסוג תא של החיישן מקודד גנטית המבוסס על החיישנים ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של העכבר הקדמי. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בחיישן זה עבור הדמיה דינמית של רמות ATP סלולריים בנוירונים ו astrocytes.

הדמיה של ATP תאיים בפרוסות רקמה אורגנותית של המוח העכבר באמצעות חיישן מבוסס-הסריג ATeam 1.03ימק

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

הפונקציות של חלבוני משפחת העל של דינמין תלויות בשינויים קונפורמטיביים יחד עם הידרוליזה של GTP. מערכת מתוארת באמצעות טכניקת FRET חד-מולקולה (smFRET) כדי לנטר את הדינמיקה הקונפורמטיבית של GTPase atlastin דמוי דינמין במצבי עומס נוקלאוטידים שונים.

הדמיית FRET של מולקולה אחת להתבוננות בדינמיקת הקונפורמציה של GTPase Atlastin דמוי דינמין

חקור את מנגנוני התנועה של ATG9A בתאי HEK293A באמצעות טכניקות הדמיה תאיות מתקדמות. המחקר מספק תובנות לגבי השפעת תגיות חלבון על התנהגות ATG9A ומיקומו.

הדמיה ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב

גלה סרטונים נוספים