Name: תכנון ובנייה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית, חד-אובייקטיבי, עבור הדמיה של רשתות שלד ציטו-שלד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: למדו לבנות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסוג light-sheet עם עדשה אחת להדמיית רשתות שלד ציטו-שלד תלת-ממדיות. השיטה מצמצמת פוטו-בליצ'ינג ומאפשרת הדמיה באיכות גבוהה לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס RUI של הקרן הלאומית למדע (NSF) (DMR-2203791) ל- J.S. אנו אסירי תודה על ההדרכה שניתנה על ידי ד"ר בין יאנג וד"ר מאניש קומאר במהלך תהליך היישור. אנו מודים לד"ר ג'ני רוס ולק. אליס לינדזי על הוראות ההכנה למנועי קינזין.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית להמחשת רשתות שלד ציטו-שלד

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף. כל המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים.

שני פרטים חשובים לגבי פרוטוקול זה הם העלות הכוללת של המערכת וזמן הבנייה והיישור הצפוי. למרות שהעלות המדויקת משתנה, אנו יכולים להעריך בנוחות כי עלות הטוטו של SOLS זה או מערכת DIY דומה תיפול בטווח של 85,000 דולר. נציין כי אומדן זה לוקח בחשבון את המחיר הקמעונאי של כל הרכיבים, ולכן מחיר כולל זה עשוי להיות מופחת מאוד על ידי מיקור רכיבים משומשים. מבחינת זמן הבנייה, יהיה זה הגיוני לצפות ממשתמש עם ניסיון מועט באופטיקה לבנות וליישר את כל מערכת ה-SOLS הזו תוך 1-2 חודשים, בתנאי שכל הרכיבים זמינים ומוכנים. למרות אורכו ומורכבותו של הפרוטוקול, אנו מאמינים כי כמות הפרטים בכתב היד הכתוב, יחד עם פרוטוקול הווידאו, צריכה להפוך פרוטוקול זה לפשוט ומהיר לביצוע.
ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, מיקום הגלבו קובע את מיקומן של עדשות רבות מכיוון שהוא חלק משלושה זוגות נפרדים של עדשות 4f. חיוני שהגלבו יהיה מצומד עם מישורי המוקד האחוריים של O1 ו-O2 וממורכז כראוי כדי להבטיח סריקה אינווריאנטית נטויה. שנית, איכות התמונה רגישה ביותר ליישור של O2 ו-O3 זה ביחס לזה. כאן, יש להקפיד לוודא שראשית, זווית היישור של O3 ל-O2 תואמת את ההטיה של יריעת אור העירור, ובכך מספקת תאורה שטוחה מקסימלית על פני ה-FoV המוטה באופן דומה. שנית, O3 חייב להיות ממוקם במרחק הציר הנכון כדי לשמור על FoV שטוח עם שטח גדול ככל האפשר. שלישית, O3 חייב להיות ממוקם במרחק הרוחבי הנכון מ- O2 כדי למקסם את האות שעובר דרך ממשק O2-O3.

במונחים של FoV שמיש, מערכת זו השיגה שדה שטוח ואמין עם תאורה עקבית על פני שטח 80 מיקרומטר x 80 מיקרומטר. שטח זה קטן יותר מה-FoV המרבי שמספקת המצלמה, כך שה-FoV השמיש מצוין על-ידי הקופסה הצהובה באיור 13. במונחים של כוח הפתרון, מערכת זו השיגה מרחק מינימלי ניתן לפתרון של 432 ננומטר לאורך ציר x ו 421 ננומטר לאורך ציר y, אשר נמדד על ידי מציאת הממוצע סיגמא x ו- y של התאמות גאוס לפונקציות התפשטות נקודתית (PSFs) ב- FoV הטוב והכפלה בשניים. נציין כי מערכת זו לא עברה אופטימיזציה במונחים של ה-NA הכולל שלה, כלומר יש מקום לשיפור משמעותי אם המשתמשים רוצים כוח פתרון גבוה יותר ממה שמערכת זו השיגה. ישנן מספר רב של אפשרויות אובייקטיביות תואמות עבור סוג זה של בניית SOLS, שרבות מהן יתרמו לרזולוציית מערכת גבוהה יותר אך עם חסרונות של עלות גבוהה יותר, FoV קטן יותר, או טכניקות יישור מסובכות יותר בממשק הממסר 8,11,13,20. בנפרד, אם המשתמשים ירצו ב-FoV גדול יותר, שילוב גלבו שני שיאפשר סריקה דו-ממדית ישיג מטרה זו, אך ידרוש אופטיקה נוספת ומכניקת בקרה כדי להשתלב בעיצוב32. סיפקנו פרטים נוספים לגבי שינויים במערכת בדף האתר שלנו, לצד קישורים למשאבים מועילים אחרים הנוגעים לתהליך העיצוב23.

מעבר לשיפור הרכיבים הספציפיים עבור עיצוב ספציפי זה, יהיה זה ריאלי מאוד להוסיף טכניקות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה או שיטות לבנות זו. שיפור אחד כזה יהיה לשלב תאורה רב-אורכית, שתכלול יישור לייזרים עירור נוספים לנתיב העירור המקורי8. יתר על כן, מכיוון שסוג זה של תכנון SOLS משאיר את הדגימה נגישה, הוספת פונקציות נוספות למיקרוסקופ, כולל אך מוגבל לציוצים אופטיים, מיקרופלואידיקה וריומטריה, היא פשוטה יחסית 2,33.

בהשוואה לאינספור מדריכי גיליון האור שפורסמו, פרוטוקול זה מספק הוראות ברמת הבנה שמשתמש ללא ניסיון אופטי משמעותי עשוי להועיל. על ידי הנגשת בניית SOLS ידידותית למשתמש עם יכולות מסורתיות של הרכבה על שקופיות לדוגמה לקהל גדול יותר, אנו מקווים לאפשר הרחבה נוספת של היישומים של מחקר מבוסס SOLS בכל התחומים שבהם המכשיר שימש או יכול להיות בשימוש. למרות שהיישומים של מכשירי SOLS גדלים במהירות במספר 2,34,35, אנו מאמינים כי יתרונות ושימושים רבים של מכשירים מסוג SOLS עדיין לא נחקרו ומביעים התרגשות מהאפשרויות לסוג זה של מכשירים להתקדם.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור (LSFM) מייצג משפחה של טכניקות הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה שבהן אור העירור מעוצב לגיליון 1,2, כולל מיקרוסקופ הארה מישורית סלקטיבית (SPIM), עירור מישורי קונפוקלי (SCAPE) ומיקרוסקופ מישורי אלכסוני (OPM)3,4,5,6,7. שלא כמו שיטות מיקרוסקופיה אחרות כגון epi-fluorescence, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי, phototoxicity הוא מינימלי ב- LSFM וניתן לצלם דגימות על פני טווחי זמן ארוכים יותר מכיוון שרק מישור הדגימה המצולמת באופן פעיל מואר 8,9,10. לכן, טכניקות LSFM שימושיות ביותר להדמיית דגימות תלת-ממדיות על פני תקופות זמן ממושכות, במיוחד אלה עבות מדי עבור טכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מסיבות אלה, מאז פיתוחה המקורי בשנת 2004, LSFM הפכה לטכניקת הדמיה המועדפת על פיזיולוגים רבים, ביולוגים התפתחותיים ומדעני מוח להדמיה של אורגניזמים שלמים כגון דגי זברה חיים ועוברי דרוזופילה 3,4,6,11 . בשני העשורים האחרונים, היתרונות של LSFM מונפו כדי לדמיין מבנה ודינמיקה בסקאלות קטנות יותר ויותר, כולל קשקשים רקמתיים 11,12, תאיים ותת-תאיים, הן in vivo והן in vitro 13,14,15,17.
למרות הדיווחים על מקרי שימוש מוצלחים בספרות, העלות הגבוהה של מערכות LSFM מסחריות (~ 0.25 מיליון דולר נכון לזמן כתיבת שורות אלה)18,19 מונעת שימוש נרחב בטכניקה. כדי להפוך את בניית DIY לחלופה ישימה לחוקרים, פורסמו מספר מדריכי בנייה 8,13,20,21, כולל מאמץ הגישה הפתוחה OpenSPIM 22. אולם נכון להיום, חוקרים עם ניסיון מינימלי באופטיקה יכולים להשתמש רק בתכנוני LSFM מוקדמים יותר, שאינם תואמים לדגימות מסורתיות המותקנות על שקופיות (איור 1A). יישום גיליון אור (SOLS) שבוצע לאחרונה משתמש במטרה אחת הן לעירור והן לזיהוי (איור 1C), ובכך מתגבר על המגבלה הקשורה לתאימות 5,6,8,13,20. עם זאת, העלות עבור הרבגוניות של תכנון SOLS היא עלייה משמעותית במורכבות הבנייה עקב הדרישה של שתי מטרות נוספות להעביר, לבטל הטיה ותמונה מחדש של מישור האובייקט על המצלמה לצורך הדמיה (איור 1D). כדי להקל על הגישה להגדרות מורכבות בסגנון SOLS, מאמר זה מציג מדריך שלב אחר שלב על התכנון, הבנייה, תהליך היישור והשימוש במערכת SOLS תואמת שקופיות, אשר יהיה שימושי לחוקרים עם ידע של קורס אופטיקה ברמת הכניסה בלבד.
למרות שהפרוטוקול עצמו הוא תמציתי, על הקוראים להפנות למשאבים אחרים במהלך שלבי ההכנה כדי ללמוד עוד על חלקים מסוימים של שיקולי התכנון או החומרה. עם זאת, אם הקורא מתכוון לעקוב אחר המפרט של עיצוב זה, ייתכן שלא יהיה צורך להבין כיצד לבחור רכיבים אופטיים מסוימים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> איור 1: מאפיינים של תצורות LSFM שונות. (A) התקנה עם שתי מטרות אורתוגונליות שהיו נפוצות בתכנוני LSFM מוקדמים. בתצורה זו, צינור נימי או גליל ג'ל משמש להכיל את המדגם, אשר אינו תואם טכניקות מסורתיות הרכבה שקופיות. (B) סכמה של עיצוב גיליון אור SOLS המראה את הדברים הבאים: (ג) המטרה היחידה המשמשת הן לעירור והן לאיסוף הפליטה במישור הדגימה (O1); הדבר מאפשר להרכיב שקופית מסורתית על גביו, ו-(D) את מערכת יעדי הממסר בנתיב הפליטה של SOLS. O2 אוסף את אור הפליטה ומקטין את התמונה. O3 מצלם את המישור בזווית ההטיה הנכונה אל חיישן המצלמה. קיצורים: LSFM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור; SOLS = יריעת אור חד-אובייקטיבית; O1-O3 = מטרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>עדשה פלנו-קעורה בגודל 1 אינץ' f = -50 מ"מ</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>עבור לייזר יישור עלות משוערת: $49.5</td></tr><tr><td>1 אינץ' Achromatic Doublet f = 100 מ"מ (x3)</td> <td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 ולייזר יישור עלות משוערת: $342.42</td></tr><tr><td>1 אינץ' Achromatic Doublet f = 125 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 עלות משוערת: $114.14</td></tr><tr><td>1 אינץ' Achromatic Doublet f = 150 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 עלות משוערת: $114.14</td></tr><tr><td>1 אינץ' כפול אכרומטי f = 150 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 עלות משוערת: $114.14</td></tr> 1 <tr><td>אינץ' כפול אכרומטי f = 45 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 עלות משוערת: $114.14</td></tr><tr><td>1 אינץ' Achromatic Doublet f = 75 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 עלות משוערת: $114.14</td></tr><tr><td>עדשה גלילית 1 אינץ' f = 100 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 עלות משוערת: $117.62</td></tr><tr><td>עדשה גלילית 1 אינץ' f = 200 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 עלות משוערת: $111.22</td></tr><tr><td>עדשה גלילית 1 אינץ' f = 50 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 עלות משוערת: $117.62</td></tr><tr><td>חור סיכה רכוב 1 אינץ', 30 ומיקרו; m קוטר חור סיכה</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>עלות משוערת: $77.08 מראה</td></tr><tr><td>כסף 1 אינץ' (x3)</td> <td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, אחד ליישור עלות משוערת: $168.78</td></tr> מראה <tr><td>אליפטית 2 אינץ'</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 עלות משוערת: $179.98</td></tr><tr><td>מחזיק עמוד 2 אינץ' (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>עבור תושבת לייזר מותאמת אישית, גלגל ND, מסכי בטיחות עלות משוערת: $98.45</td></tr><tr><td>עמודים בגודל 2 אינץ' (x47)</td> <td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>עבור תושבת לייזר מותאמת אישית ורכיבים אופטיים עלות משוערת: $277.3</td></tr><tr><td>עמודים בגודל 3 אינץ' (x4)&nbsp;</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td>TR3</td><td>עבור תומכי M3 ותושבות אחרות עלות משוערת: $24.6</td></tr><tr><td>מחזיק עמוד 3 אינץ' (x4)</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td>עלות משוערת <td>של PH3</td><td>: $38.48</td></tr><tr><td>מתאם כלוב 30 עד 60 מ"מ&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>להרכבה O1 עלות משוערת: $45.42</td></tr><tr><td>גלגל מסנן כלוב 30 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>להרכבת מסנני ND עלות משוערת: $172.36</td></tr><tr><td>צלחת כלוב 30 מ"מ (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>לבניית כלוב יישור ולייזר יישור עלות משוערת: $114.54</td></tr><tr><td>30 מ"מ תושבת מראה קינמטית בזווית ישרה (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>להרכבה של M1 ו-M2 וללייזר יישור עלות משוערת: $463.95</td></tr><tr><td>מחזיק עמוד 4 אינץ' (x30)</td> <td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>עלות משוערת: $320.1</td></tr><tr><td>561 ננומטר לייזר וספק כוח&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>עירור לייזר עלות משוערת: $6000</td></tr><tr><td>צלחת כלוב 60 מ"מ (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>להרכבת TL1 ו-M3 mount עלות משוערת: $88.52</td></tr><tr><td>60 מ"מ תושבת מראה קינמטית בזווית ישרה</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>להרכבה M3 עלות משוערת: $187.26</td></tr><tr><td>90&deg; פליפ מאונט</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>לייזר יישור עלות משוערת: $95.5</td></tr><tr><td>מתאם עם חוטי C-Mount חיצוניים וחוטי SM1 פנימיים</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>לחיבור צינור עדשה למצלמה עלות משוערת: $20.96</td></tr><tr><td>מתאם עם חוטי SM1 חיצוניים וחוטי C-Mount פנימיים</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>לחיבור עדשת צינור לתושבת העדשה עלות משוערת: $21.82</td></tr><tr><td>מתאם עם חוטי SM1 חיצוניים וחוטי M25 פנימיים (x2)</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>להרכבת O1 ו-O2 עלות משוערת: $47.06</td></tr><tr><td>מתאם עם חוטי SM1 חיצוניים וחוטי M26 פנימיים</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>להרכבה O3 עלות משוערת: $22.38</td></tr><tr><td>דיסק יישור</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>עלות משוערת: $20.45</td></tr><tr><td>לייזר יישור</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM עלות משוערת: $16.98</td></tr><tr><td>שקופיות פלסטיק אוטולורסנטיות, אדום&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>עלות משוערת: $20</td></tr><tr><td>תריס קרן&nbsp;</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>לחסימת אור לייזר עלות משוערת: $65.8</td></tr><tr><td>תושבת סיבוב כלוב (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>להרכבה CL1-3 עלות משוערת: $282.15</td></tr><tr><td>מוטות מערכת כלוב 1 אינץ' (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>להרכבת M3 ו-O1 עלות משוערת: 44.8 דולר</td></tr><tr><td>מוטות מערכת כלוב 3 אינץ' (x2)</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>להרכבת O3 עלות משוערת: $14.28</td></tr><tr><td>מוטות מערכת כלוב 4 אינץ' (x4)</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>להרכבת slit עלות משוערת: $30.76</td></tr><tr><td>מוטות מערכת כלוב 8 אינץ' (x2)</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>ליישור עדשות צינור עלות משוערת: $25.3</td></tr><tr><td>מוטות מערכת כלוב 12 אינץ' (x8)</td> <td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>עבור כלוב יישור עלות משוערת: $145.36</td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>עלות משוערת: ~$14,000</td></tr><tr><td>מזלג הידוק (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>כדי להדק את תושבות העמוד עלות משוערת: $338.8</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי, 22 x 22 מ"מ&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>2850-22</td><td>לדגימות שקופיות עלות משוערת: $265</td></tr><tr><td>Dichroic&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>לפיצול נתיבי פליטה/פליטה עלות משוערת: $965</td></tr><tr><td>שלב תרגום זנב יונה</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>לתרגום חור סיכה עלות משוערת: $90.55</td></tr><tr><td>מסנן</td> פליטה <td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>עלות משוערת: $140.99</td></tr><tr><td>דיסק יישור זכוכית חלבית (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>עבור כלוב יישור ומישור ביניים עלות משוערת: $75.14</td></tr><tr><td>מחולל פונקציות</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>לשליטה ב-galvo עלות משוערת: $900</td></tr><tr><td>גלוונומטר - מערכת קוטר קרן גדולה 1D</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>עלות משוערת: $1715.78</td></tr><tr><td>ספק כוח גלוונומטר</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>עלות משוערת: $300</td></tr><tr><td>ג'לריט</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>G35020-100.0</td><td>מסטיק גלן לדגימת חרוזים תלת מימדית עלות משוערת: $68.25</td></tr><tr><td>תוכנת FIJI</td> הורדה <td>בקוד</td><td></td> פתוח <td>מ-https://imagej.net/software/fiji/downloads עלות משוערת:</td></tr><tr><td>פלטה חמה בחינם /</td><td>בוחש קורנינג</td><td>6795-220</td><td>להכנת פתרונות לדוגמה עלות משוערת: $ 550</td></tr><tr><td>בקר מנוע מוברש K-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Drives Z825B עלות משוערת: $757.51</td></tr> הר <tr><td>קינמטי</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>להרכבת dichroic עלות משוערת: $92.01</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>הורד מ-https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 עלות משוערת:</td></tr><tr><td>חוסם אור לייזר חינם&nbsp;</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td>LB1</td><td>עבור השתקפויות מסנן ND עלות משוערת: $57.65</td></tr><tr><td>תושבת לייזר</td><td>בהתאמה אישית</td><td></td><td>מודפסת בתלת מימד עלות משוערת:</td></tr><tr><td>מסך בטיחות לייזר N / A (x2)</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>לחסימת אור לייזר תועה עלות משוערת: $92.02</td></tr><tr><td>עדשת צינור סריקת לייזר</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 עלות משוערת: $1491</td></tr><tr><td>תושבת עדשה (x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>כדי להרכיב את כל העדשות ומראה היישור הנוספת. עלות משוערת: $164.7</td></tr><tr><td>סרגל מגנטי</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>לבדיקת יישור עלות משוערת: $52.74</td></tr><tr><td>תוכנת מיקרו-מנהל&nbsp;</td>הורדה <td>בקוד</td><td></td> פתוח <td>מ-https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release עלות משוערת:</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td> בחינם <td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td>12550400</td><td>לדגימות שקופיות עלות משוערת: $123.9</td></tr><tr><td>שלב מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 עם חלקים מותאמים אישית</td><td>לתרגום עדין של דוגמאות עלות משוערת: ~$16,000</td></tr><tr><td>מערבל מיני מערבולת&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>להכנת דגימה עלות משוערת: $152.64</td></tr><tr><td>מפעיל ממונע</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>לתרגום עדין M1 עלות משוערת: $729.07</td></tr><tr><td>איריס סטנדרטי רכוב (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>לפחות 2 ליישור עלות משוערת: $118.02</td></tr><tr><td>סט מסננים ND&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>כדי להפחית את עוצמת העירור עלות משוערת: $726.73</td></tr><tr><td>עדשת אובייקט 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 עלות משוערת: ~$15,000</td></tr><tr><td>עדשה אובייקטיבית 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>O2 עלות משוערת: ~$6,000</td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 עלות משוערת: ~$6,800</td></tr><tr><td>תוכנת הטיה OPM</td> קוד <td>פתוח</td><td></td><td>לעיבוד תמונה. הורד מ https://github.com/QI2lab/OPM עלות משוערת:</td></tr><tr><td>חיישן הספק פוטו-דיודה</td> בחינם <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>למדידת עוצמת לייזר עלות משוערת: $379.68</td></tr><tr><td>יעד עיוות רשת חיובי</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>R1L3S3P יישור Brightfield עלות משוערת: $267.87</td></tr><tr><td>מד כוח קונסולה דיגיטלית</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>למדידת עוצמת לייזר עלות משוערת: $1245.48</td></tr><tr><td>רודמין 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>לדגימת שקופיות מצופה פלואורסצנט עלות משוערת: $27.7</td></tr><tr><td>מהדק זווית ישרה לעמודים</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>לתמיכה ב-M3 ומראה מתהפכת עלות משוערת: $32.46</td></tr><tr><td>צלחת כלוב עם הברגה RMS (x2)&nbsp;</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td>CP42</td><td>לייזר יישור עלות משוערת: $70.56</td></tr><tr><td>צלחת גזירה 2.5-5.0 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>עלות משוערת: $182.85</td></tr><tr><td>צלחת גזירה 5.0-10.0 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>עלות משוערת: $201.47</td></tr><tr><td>צלחת גזירה 10.0-25.4 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>עלות משוערת: $236.42</td></tr><tr><td>צלחת גזירה צפייה במסך</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>עלות משוערת: $337.74</td></tr><tr><td>אינטרפרומטר גזירה עם צלחת 1-3 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>לבדיקת קולימציה עלות משוערת: $465.85</td></tr><tr><td>צווארון פוסט סליפ-און (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>לשמירה על גובה פוסט עלות משוערת: $208.25</td></tr><tr><td>חריץ</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>עלות משוערת: $294.64</td></tr><tr><td>צינור עדשה מחורר, 3 אינץ'</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>לייזר יישור עלות משוערת: $77.45</td></tr><tr><td>מראה מרובעת, 1 x 1 אינץ'</td><td></td><td></td> <td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 עלות משוערת: $14.76</td></tr><tr><td>צינור עדשה הניתן לערמה 1/2 אינץ' (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>להרכבה CL1-3 עלות משוערת: $40.86</td></tr><tr><td>צינור עדשה הניתן לערמה 1 אינץ'</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>להרכבת O3 עלות משוערת: $15.41</td></tr><tr><td>צינור עדשה הניתן לערמה 2 אינץ' (x2)</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>עבור נתיב מצלמה עלות משוערת: $35.7</td></tr><tr><td>מתאם בסיס הדום משובץ (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>לחיבור תושבות עמוד לשולחן עלות משוערת: $400.71</td></tr><tr><td>תרגום תושבת עדשה (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>לתרגום עדין של חור סיכה, O2 ו-O3 עלות משוערת: $441</td></tr><tr><td>שלב תרגום עם מיקרומטר סטנדרטי (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 עלות משוערת: $647.54</td></tr><tr><td>שלב תרגום מדריך לנסיעות</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>תושבת תרגום כלוב O3 עלות משוערת: $497.3</td></tr><tr><td>עדשת צינור</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 עלות משוערת: $359</td></tr> LED <tr><td>רכוב לבן</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>מקור אור MNWHL4</td><td>Brightfield עלות משוערת: $171.28</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>סה"כ עלות משוערת: $84,858.98</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>המחברים מציינים כי חלקים רבים נקנו משומשים. כאן, ניסינו לשקף את המחיר הקמעונאי של כל הפריטים, כך שניתן להפחית מאוד את העלות הכוללת על ידי קניית פריטים מסוימים בשימוש, במיוחד היקרים יותר.</td></tr><tr>רכיבים <td></td><td></td><td></td><td>אופציונליים</td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>לבדיקות אבחון במהלך היישור. ניתן להשתמש במצלמת Acquisiton במקום זאת, אך דורשת יישור מחדש לאחר מכן. עלות משוערת: $1089</td></tr></tbody></table>

תכנון ובנייה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית, חד-אובייקטיבי, עבור הדמיה של רשתות שלד ציטו-שלד

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

חומרים מרוכבים של שלד ציטו-שלד משוחזר התפתחו כמערכת מודל רבת ערך לחקר חומר רך שאינו שיווי משקל. הלכידה הנאמנה של הדינמיקה של רשתות תלת-ממדיות וצפופות אלה דורשת חתך אופטי, הקשור לעתים קרובות למיקרוסקופים קונפוקליים פלואורסצנטיים. עם זאת, התפתחויות אחרונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור (LSFM) ביססו אותו כחלופה חסכונית, ולעתים עדיפה. כדי להפוך את LSFM לנגיש לחוקרי שלד ציטו-שלד שפחות בקיאים באופטיקה, אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב למתחילים לבניית מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-תכליתי מרכיבי מדף. כדי לאפשר הרכבה של דגימות עם דגימות שקופיות מסורתיות, LSFM זה עוקב אחר עיצוב גיליון האור (SOLS) בעל מטרה יחידה, המשתמש במטרה אחת הן עבור איסוף העירור והן עבור איסוף הפליטה. אנו מתארים את הפונקציה של כל רכיב ב- SOLS בפירוט מספיק כדי לאפשר לקוראים לשנות את המכשור ולעצב אותו כך שיתאים לצרכים הספציפיים שלהם. לבסוף, אנו מדגימים את השימוש במכשיר SOLS מותאם אישית זה על ידי הדמיה של אסטרים ברשתות מיקרוטובולים מונעות קינזין.

ביצענו סריקות נפחיות של חרוזי 1 מיקרומטר המשובצים בגומי גלן. איור 14 מראה את התחזיות בעוצמה מרבית של סריקות נפחיות מוטות לאורך כיווני x, y ו-z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> איור 14: הדמיה נפחית של חרוזים פלואורסצנטיים של 1 מיקרומטר בגומי גלאן. מוצגות הקרנות בעוצמה מרבית של סריקות נפחיות מוטות. פסי קנה מידה = 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הדגמנו את השימוש במיקרוסקופ אור חד-תכליתי כדי לאפיין רשתות ציטו-שלד משוחזרות על ידי ביצוע סריקות נפחיות של דגימות של אסטרים מיקרוטובוליים. בקצרה, מיקרוטובולים מיוצבים בתווית רודמין וטקסול עברו פולימריזציה מדימרים משוחזרים על ידי GTP; לאחר מכן, לאחר פילמור, אשכולות מוטוריים קינזין מבוססי סטרפטווידין עורבבו לדגימות יחד עם ATP עבור ריכוזים סופיים של 6 מיקרוטובולים של 6 מיקרו-צינורות, דימרים קינזין של 0.5 מיקרומטר ו-10 מילימטר ATP. פרוטוקולים ומדריכים נרחבים להכנת מיקרוטובולים מיוצבי טקסול וצברי מנוע קינזין ניתן למצוא באתרי האינטרנט Mitchson Lab ו- Dogic Lab25,26. הדגימות הוכנסו בעדינות לשקופיות מיקרוסקופ, נאטמו והורשו לשבת במשך 8 שעות לפני ההדמיה כדי לאפשר הפסקת פעילות מוטורית כך שהדגימות הגיעו למצב מבני יציב הדומה לאסטרים.
מחקרים על מערכות שלד ציטו-שלד משוחזרות משתמשים לרוב במיקרוסקופ קונפוקלי או אפיפלואורסצנטי כדי לסמן חוטים מסומנים. עם זאת, שתי הטכניקות הללו מוגבלות ביכולתן לצלם דגימות תלת-ממד צפופות27. בעוד התקדמות רבה נעשתה במחקר חומר פעיל מבוסס שלד חוץ גופי על ידי הגבלת דגימות להיות quasi2D 28,29, רשתות cytoskeleton הן תלת ממדיות מטבען, ומאמצים עכשוויים רבים טמונים בהבנת ההשפעות שיכולות להתעורר רק בדגימות תלת ממד29,30, ובכך ליצור צורך בהדמיה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> איור 15: הנחיית הדמיה תלת-ממדית של דגימות שלד ציטו-שלד משוחזרות באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור חד-אובייקטיבי. (A) תמונות של אסטרים פלואורסצנטיים של מיקרוטובולים שנרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר של Leica DMi8. התמונות מציגות מישורים שונים מסריקת Z. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. (B) תמונות מפותלות מסריקה נפחית המבוצעת על הגדרת גיליון אור חד-אובייקטיבי של אותה דגימה. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. אזור התמונה המוטה כאן מתאים ל-FoV (קופסה צהובה) השמיש שהודגם באיור 13B. בעוד שהקונפוקל מצטיין בהדמיה של מישורים בודדים ליד הכיסוי, צפיפות הדגימה הפלואורסצנטית גורמת לסיבוכים בעת הדמיה במישורים גבוהים יותר בשל האות הנוסף מתחת למישור ההדמיה. יריעת האור עוקפת בעיה זו על ידי הארת מישור ההדמיה בלבד, ובכך מאפשרת הדמיה חדה אחידה במישורים שונים ב-z. קיצורים: SOLS = גיליון אור חד-אובייקטיבי; FoV = שדה ראייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
באיור 15 אנו מדגימים הדמיה נפחית של רשת מיקרוטובולים משוחזרת שהתכווצה למבנים דמויי אסטר על-ידי צבירי מנועי קינזין. כפי שהוכח במחקר קודם 28,31, מבנים תלת-ממדיים אלה נוטים לגדול צפופים לכיוון המרכז, וכתוצאה מכך אזורים בהירים של פלואורסצנטיות השולטים באות. במישורי הדמיה ליד הכיסוי (רמת z נמוכה), מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 15A) יכול לפתור חוטים בודדים סביב הפריפריה של האסטר, עם רקע נוסף לכיוון המרכז עקב אותות פלואורסצנטיים לא ממוקדים מלמעלה. עם זאת, הזזת כמה מיקרונים ב-z מפחיתה במהירות את איכות התמונות בשל העובדה שחלקים צפופים מחוץ למיקוד של האסטר שולטים באות במישור ההדמיה. ההארה החד-מישורית של יריעת האור (איור 15B) מבטלת את האותות מחוץ למיקוד מהחלקים הצפופים של האסטר מעל ומתחת למישור ההדמיה, ובכך מאפשרת איכות תמונה דומה בין המישורים. יכולתה של יריעת האור להפיק נתוני סריקה נפחית איכותיים ואמינים פותחת את האפשרות להמחיש ולאפיין תופעות תלת-ממדיות במערכות ציטו-שלד משוחזרות.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לבנות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל מטרה אחת ויריעות אור ואת השימוש בו להדמיית רשתות שלד.

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

עבודתנו שואפת לקדם את הידע על הקשר בין דינמיקת עבודה טרנסית, מבנה מקומי ותכונות מכניות בחומרים רחוקים משיווי משקל. ויזואליזציה של חומרים רחוקים משיווי משקל כגון רשתות שלד ציטו-שלד דורשת יכולת לצלם דגימות תלת-ממדיות צפופות באיכות תמונה דומה לאורך כל נפח הדגימה, תוך גרימת נזק מינימלי באמצעות הלבנה פוטו-לבנה, משימה מאתגרת מבחינה טכנית שמיקרוסקופ יריעות אור פלואורסצנטיות מתאים לה ביותר. מערכות מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי מספקות יכולות חתך אופטי מצוינות, המאפשרות הדמיה של דגימות תלת ממדיות עבות אלה לטווחי זמן ארוכים עם מינימום הלבנה.בפרט, מערכת יריעות האור האובייקטיבית היחידה שנציג תואמת לדוגמאות מסורתיות המותקנות על שקופיות, מה שהופך אותה לכלי רב-תכליתי מאוד. הרוב המכריע של מדריכי יריעות אור אובייקטיביות בודדות נכתבים עבור משתמשים בעלי ניסיון רב באופטיקה. כדי להפוך את ההגדרה המורכבת של סגנון גיליון קל למטרה אחת לנגישה יותר, מדריך מפורט זה מספק שלבים שמשתמש עם קורס אופטיקה ברמת הכניסה ידע מעמיק יכול לבצע.

design-building-customizable-single-objective-light-sheet

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במצבים ביולוגיים וקליניים רבים הוא יתרון ללמוד תהליכים תאיים כמו שהם להתפתח microenvironment הולדתם. כאן אנו מתארים את הרכבה ושימוש מיקרוסקופ סיב אופטי בעלות נמוכה אשר יכול לספק הדמיה בזמן אמת בתרבות התא, מחקרים בבעלי חיים, ומחקרים קליניים המטופל.

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של מיקרוסקופ גיליון אור ויישומה לin vivo הדמיה של ג elegans עוברים.

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em&gt; בטוטו</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; פיתוח

מודול למיקרוסקופיה תאורת מטוס בודד (SPIM) מתואר אשר מותאם בקלות למיקרוסקופ שדה הרחב הפוך ומותאם במיוחד לתרביות תאים 3 ממדים. המדגם ממוקם בתוך נימים מלבניות, ובאמצעות צבעי ניאון מערכת microfluidic, יכולים להיות מיושמים סוכנים או תרופות תרופות בכמויות קטנות.

מטוס אחד תאורת מודול וגישת מיקרו-נימים למיקרוסקופ שדה רחב

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

למדו לבנות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסוג light-sheet עם עדשה אחת להדמיית רשתות שלד ציטו-שלד תלת-ממדיות. השיטה מצמצמת פוטו-בליצ'ינג ומאפשרת הדמיה באיכות גבוהה לאורך זמן.

תכנון ובנייה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית, חד-אובייקטיבי, עבור הדמיה של רשתות שלד ציטו-שלד

גלה סרטונים נוספים