Name: כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למד כיצד לבודד ולנתח מטבוליטים מקורלים ומ-Symbiodiniaceae באמצעות כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסות. השיטה מאפשרת זיהוי ביומרקרים לשימור שוניות אלמוגים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.M. נתמך על ידי מלגת מחקר של UTS Chancellor.

מטבוליט פרופיל של דגימות אלמוגים קשים באמצעות GC-MS

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

ההפרדה בין הפונדקאי לסימביונט ניתנת להשגה בקלות ובמהירות באמצעות צנטריפוגה פשוטה, והתוצאות כאן מראות כי הפרדת השברים יכולה לספק מידע רב ערך המעיד על תרומות ספציפיות של חברי הולוביונט, אשר יכול לתרום לניתוח פונקציונלי של בריאות האלמוגים. באלמוגים בוגרים, סינתזת שומנים מבוצעת בעיקר על-ידי סימביונטאצות תושב 40, אשר מספק שומנים (למשל, טריאצילגליצרול ופוספוליפידים)41 וחומצות שומן שיכולות לקדם התאוששות מסטרס 11,42.</su...

מטבוליטים מייצגים את התוצרים הסופיים של תהליכים תאיים, ומטבולומיקה - המחקר של חבילת המטבוליטים המיוצרים על ידי אורגניזם או מערכת אקולוגית נתונה - יכולה לספק מדד ישיר לתפקוד אורגניזם1. זה קריטי במיוחד לחקר מערכות אקולוגיות, אינטראקציות סימביוטיות וכלי שיקום, שכן המטרה של רוב אסטרטגיות הניהול היא לשמר (או לשחזר) פונקציות ספציפיות של שירותי מערכת אקולוגית2. שוניות אלמוגים הן מערכת אקולוגית מימית אחת המדגימה את הערך הפוטנציאלי של מטבולומיקה להבהרת אינטראקציות סימביוטיות ולקישור תגובות פיזיולוגיות של אלמוגים להשפעות ברמת הקהילה וברמת המערכת האקולוגית3. היישום של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז בתפוקה גבוהה (GC-MS) מוערך במיוחד בשל יכולתו לנתח במהירות מגוון רחב של סוגי מטבוליטים בו זמנית עם סלקטיביות ורגישות גבוהות, לספק זיהוי מורכב מהיר כאשר ספריות ספקטרליות זמינות, ולספק רמה גבוהה של שחזור ודיוק, עם עלות נמוכה יחסית לדגימה.
אלמוגים הם הולוביונטים המורכבים מחיית האלמוגים, אנדוסימביונטים פוטוסינתטיים של דינופלגלאט (משפחה: Symbiodiniaceae4), ומיקרוביוםמורכב 5,6. באופן כללי, הכושר של ההולוביונט נשמר בעיקר באמצעות חילופי מולקולות ואלמנטים קטנים כדי לתמוך בתפקוד המטבולי של כל חבר 7,8,9,10. גישות מטבולומיות הוכחו כחזקות במיוחד להבהרת הבסיס המטבולי של ספציפיות סימביוזה 9,11, תגובת הלבנה לעקה תרמית7,8,12,13, תגובות מחלה 14, תגובות חשיפה לזיהום 15, פוטואקלום 16 ואיתות כימי 17 באלמוגים, כמו גם סיוע בגילוי סמנים ביולוגיים 18,19. בנוסף, מטבולומיקה יכולה לספק אישור רב ערך למסקנות שהוסקו מטכניקות מבוססות DNA ו- RNA 9,20. קיים אפוא פוטנציאל רב לשימוש במטבולומיקה להערכת בריאות השונית ולפיתוח כלים לשימור שוניות3, כגון באמצעות איתור סמנים ביולוגיים מטבוליים של עקה18,19 ולבחינת הפוטנציאל של אסטרטגיות ניהול אקטיבי כגון סובסידיות תזונתיות21.
הפרדת התאים המארח והסימביונט וניתוח פרופילי המטבוליטים שלהם באופן עצמאי, ולא יחד כהולוביונט, יכולים להניב מידע נוסף על אינטראקציות בין בני הזוג, סטטוסים פיזיולוגיים ומטבוליים עצמאיים, ומנגנונים מולקולריים פוטנציאליים להסתגלות 11,12,22,23,24. מבלי להפריד בין האלמוגים לבין Symbiodiniaceae, כמעט בלתי אפשרי להבהיר את תרומתם וחילוף החומרים של אלמוגים ו / או Symbiodiniaceae באופן עצמאי, למעט שחזור גנום מורכב ומידול מטבולי25, אך זה עדיין לא יושם על סימביוזה אלמוג-dinoflagellate. יתר על כן, ניסיון לחלץ מידע על חילוף החומרים האישי של הפונדקאי או סימביונט אצות מפרופיל המטבוליטים של ההולוביונט יכול להוביל לפרשנות שגויה.
לדוגמה, עד לאחרונה, הנוכחות של חומצות שומן רב בלתי רוויות C18:3n-6, C18:4n-3 ו-C16 בתמציות מרקמות אלמוגים והולוביונט נחשבה כנגזרת מסימביונט האצות, שכן ההנחה הייתה שלאלמוגים אין את ωx desaturases החיוני לייצור חומצות שומן אומגה-3 (ω3); עם זאת, ראיות גנומיות עדכניות מצביעות על כך שלקנידארים מרובים יש את היכולת לייצר ω3 PUFA de novo ולבצע ביוסינתזה נוספת של ω3 PUFA26 ארוך שרשרת. שילוב GC-MS עם תיוג איזוטופי יציב (למשל, 13 C-ביקרבונט, NaH 13CO 3) יכול לשמשלמעקב אחר גורלו של פחמן קבוע פוטוסינתטי באמצעות רשתות מטבוליות הולוביונט אלמוגים הן בתנאי בקרה והן בתגובה לגורמי עקה חיצוניים27,28. עם זאת, שלב קריטי במעקב אחר גורל 13 C הוא הפרדת רקמת האלמוג מתאי האצות – רק אז ניתן להקצות באופן חד משמעי נוכחות של תרכובת המסומנת ב-13C בחלק המארח של האלמוגים כמטבוליט שמקורו ב-Symbiodiniaceae המועתק לאלמוג או כתוצר במורד הזרם של תרכובת מסומנת שעברה. טכניקה זו הוכיחה את כוחה על ידי קריאת תיגר על ההנחה ארוכת השנים כי גליצרול הוא הצורה העיקרית שבה פוטוסינתאט מועבר מסימביונט למארח29, כמו גם הבהרה כיצד שטף תזונתי בין שותפים משתנה במהלך הלבנה27,28 ובתגובה למיני Symbiodiniaceae11 שאינם תואמים.
בעוד שההחלטה להפריד רקמות מונעת בעיקר על ידי שאלת המחקר, חשוב לקחת בחשבון את המעשיות, האמינות וההשפעות המטבוליות הפוטנציאליות של גישה זו. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות ומוכחות להפקת מטבוליטים מההולוביונט, כמו גם את השברים המארח והסימביונט הנפרדים. אנו משווים את פרופילי המטבוליטים של המארח והסימביונט באופן עצמאי וכיצד פרופילים אלה בהשוואה לפרופיל המטבוליט של הולוביונט.

<table><tbody><tr><td>100% מתנול בדרגת LC</td><td>Merck</td><td>439193</td> צינורות <td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה חיוניים 2 מ"ל, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>פוליפרופילן מספק עמידות גבוהה בפני כימיקלים, לחץ מכני וטמפרטורות קיצוניות</td></tr><tr><td>2030 Shimadzu גז כרומטוגרף</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 & מיקרו; m חרוזי זכוכית שטופים בחומצה</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>גודל זה אופטימלי לשבירת תאי Symbiodiniaceae</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus דגימה אוטומטית רב תכליתית</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>כל מגיב קולורימטרי חלבון מקובל</td></tr><tr><td>אקדח אוויר דחוס</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>עיצוב דומה מקובל. התאמה שתתאים לטיפ של 1 מ"ל היא קריטית.</td></tr><tr><td>&nbsp; עמודת DB-5 עם עמודה בקוטר פנימי של 0.25 מ"מ ו-1 &micro; עובי סרט m</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C ו/או 13C5&ndash; 15N Valine</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>ניתן להוסיף למתנול אחד מהתקנים הפנימיים או את שניהם.</td></tr><tr><td>תחתית שטוחה 96 בארות צלחת</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ זכוכית</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 מ"ל, עם אטם לא פלסטיק</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>אם לא זמין, סרום בקר אלבומין מקובל</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>Shimadzu LabSolutions Insight</td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>כדורים להכנת 1 M פתרון</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R חבילה</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>או דומה</td></tr><tr><td>TQ8050NX משולש ספקטרומטר מסה מרובע</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 צלחת באר</td><td>גריינר</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>תיק מדגם Whirl-Pak תיק</td> איסוף <td>מדגם Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>; גודל: גדול מספיק כדי להכיל שבר אלמוג ~5 ס"מ, אך לא גדול מדי כדי שהמים יהיו מפוזרים מדי</td></tr></tbody></table>

כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

גישות המבוססות על ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה של גז (GC-MS) הוכיחו את עצמן כחזקות להבהרת הבסיס המטבולי של סימביוזה cnidarian-dinoflagellate וכיצד אלמוגים מגיבים ללחץ (כלומר, במהלך הלבנה הנגרמת על ידי טמפרטורה). פרופיל מטבוליטים במצב יציב של הולוביונט האלמוגים, הכולל את הפונדקאי הקנידריאני ואת המיקרובים הקשורים אליו (Symbiodiniaceae ופרוטיסטים אחרים, חיידקים, ארכאה, פטריות ווירוסים), יושם בהצלחה בתנאי סביבה ועקה כדי לאפיין את המצב המטבולי ההוליסטי של האלמוג.
עם זאת, כדי לענות על שאלות סביב אינטראקציות סימביוטיות, יש צורך לנתח את פרופילי המטבוליטים של מארח האלמוגים וסימביונטות האצות שלו באופן עצמאי, אשר ניתן להשיג רק על ידי הפרדה פיזית ובידוד של הרקמות, ואחריו מיצוי עצמאי וניתוח. בעוד היישום של מטבולומיקה הוא חדש יחסית בתחום האלמוגים, המאמצים המתמשכים של קבוצות מחקר הביאו לפיתוח שיטות חזקות לניתוח מטבוליטים באלמוגים, כולל הפרדת הרקמה המארחת של האלמוגים וסימביונטים של אצות.
מאמר זה מציג מדריך שלב אחר שלב להפרדת הולוביונט ומיצוי מטבוליטים לניתוח GC-MS, כולל שלבי אופטימיזציה מרכזיים שיש לקחת בחשבון. אנו מדגימים כיצד, לאחר ניתוח עצמאי, פרופיל המטבוליטים המשולב של שני השברים (אלמוגים ו- Symbiodiniaceae) דומה לפרופיל של השלם (holobiont), אך על ידי הפרדת הרקמות, אנו יכולים גם לקבל מידע מפתח על חילוף החומרים והאינטראקציות בין שני השותפים שלא ניתן להשיג מהשלם בלבד.

כל הנתונים שהופקו במהלך עבודה זו זמינים במידע המשלים.
הפרדה בין מארח לסימביונט
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> איור 1: הגדרה ותיקוף של ההפרדה בין רקמות מארחות אלמוגים ותאי Symbiodiniaceae. (A) מערך אקדח האוויר לסילוק רקמת אלמוג משלד האלמוג. קצה פיפטה מחובר לאקדח האוויר עם סרט חשמלי, וקטע קטן ...

במאמר זה אנו מציגים את ההפקה וההכנה של מטבוליטים קוטביים וקוטביים למחצה מהולובונט אלמוגים, כמו גם רקמת מארח אלמוגים מופרדת ושברי תאים Symbiodiniaceae, לצורך ניתוח ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיית גז.

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

כמו בכל אורגניזם, אלמוגים תלויים בתזונה מעולה כדי לגדול ולבנות שוניות לחסינות ולרבייה ולעמוד בתנאי סביבה משתנים. אולם אנו יודעים מעט מאוד על תזונה אופטימלית לאלמוגים בתנאים רגילים או משתנים, וכיצד כל חבר בהולוביונט האלמוגים תורם למצב התזונתי הזה. אלמוגים הם הולוביונטים המורכבים מהפונדקאי וממיקרואורגניזמים סימביוטיים שונים.אלה כוללים Symbiodiniaceae, פרוטיסטים, חיידקים, וירוסים ופטריות. הכושר של ההולוביונט תלוי באינטראקציות המטבוליות בין חברים אלה. לדוגמה, Symbiodiniaceae מספקים פוטוסינתאט כדי לתמוך בחילוף החומרים של הפונדקאי ולעזור לו להסתגל לתנאים משתנים.כדי להבין את השותפות החיונית הזו, עלינו ללמוד את ההרכב הכימי והמטבולי של כל שותף בנפרד. ממצאים אלה הראו כי ניתן לקבל מידע נוסף על ידי הפרדת שברים מארחים וסימביונטים לצורך ניתוח מטבולי. עם זאת, ההחלטה לנתח שברים נפרדים לעומת ההולוביונט נשלטת בסופו של דבר על ידי שאלת המחקר.לכן, במקרים בהם ניתוח ההולוביונט עדיף, סיפקנו מתודולוגיה למיצוי מטבוליטים של הולוביונט, והצעות לקבלת מידע רב ככל האפשר במהלך הניתוח. השיטות בהן נעשה שימוש במחקר זה פותחות אפיקי מחקר חדשים. אלה כוללים חשיפת סמנים ביולוגיים פוטנציאליים, זיהוי מטבוליטים מרכזיים במהלך שלבי חיים ספציפיים או תנאי עקה, הבנת היתרונות של שיוך עם מינים מסוימים, וחקירת אינטראקציות בתוך ההולוביונט.מחקר עתידי יתמקד ביישום הפרוטוקולים שנקבעו כאן למספר תחומי מחקר, כולל איתור סמנים ביולוגיים עם יישומים בשימור ושיקום שוניות אלמוגים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם כאשר הפרדת שברים אינה אפשרית עבור מדדים פיזיולוגיים אחרים. לדוגמה, בעת ניתוח פליטות מטבוליטים נדיפים ממושבות אלמוגים.

gas-chromatography-mass-spectrometry-based-targeted-metabolomics-hard

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

פרוטוקול זה מיועד למיצוי וריכוז של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית שנאספה ממי ים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים המתאימים לניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה טנדם.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

שיטת ספקטרומטריית מסה דו-ממדית של כרומטוגרפיית גז-זמן טיסה מתוארת לאפיון החלק המימי של ביו-גולמי המופק מהנזלה הידרותרמית של אצות. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם כדי לנתח את החלק המימי של מוצרים נוזליים מפירוליזה מהירה, פירוליזה מהירה קטליטית, דה-חמצן קטליטי וטיפול הידרו.

אפיון איכותי של השבר מימית מ הידרותרמיות עיבוי של אצות באמצעות גז כרומטוגרפיה 2D עם זמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה

שרשרת פולימראז משופר שיטת פולימורפיזם תגובת הגבלה שבר אורך עבור genotyping מיני נפוחיתיים ידי ספקטרומטריית נוזלי כרומטוגרפיה / מסה מתוארת. טור מונולית סיליקה הפוכה פאזיים מועסק להפרדת amplicons מתעכל. שיטה זו יכולה להבהיר את המוני monoisotopic של oligonucleotides, אשר הוא כלי שימושי לזיהוי רכב בסיס.

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול זה מתאר כיצד להתכונן הרימות דרוזופילה metabolomic GC-MS מבוססי ניתוח.

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

כתב היד מציג באתר דגימה של גידולים במוח האנושי עם מיקרו-ארכה שלב מוצק ואחריו פרופיל ביוכימי שלהם לקראת גילוי סמנים ביולוגיים.

באתר דגימה וחילוץ של גידולים במוח עבור מטבולומיקה וניתוח Lipidomics

מוצגת שיטה לניתוח מטבולומי של שעורה. השיטה כוללת פיצול ונגזרת של מטבוליטים וניתוחם על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה (GC/MS). ניתן להשתמש בניתוח מטבולומי כדי לקבוע את ההשפעה של גידול משולב ולחץ בצורת על התבואה.

ניתוח מטבולומי של שעורה על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה

למד כיצד לבודד ולנתח מטבוליטים מקורלים ומ-Symbiodiniaceae באמצעות כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסות. השיטה מאפשרת זיהוי ביומרקרים לשימור שוניות אלמוגים.

כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים

גלה סרטונים נוספים