Name: מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למד מטבולומיקה ממוקדת לתאי גזע המטופואטיים נדירים באמצעות ספקטרומטריית מס. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מאות מטבוליטים מ-5000 תאים בלבד לחקר רגולציית תזונה ותאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למתקן בעלי החיים של מכון מקס פלנק לאימונוביולוגיה ואפיגנטיקה על אספקת בעלי החיים ששימשו במחקר זה.

מחקרים מטבוליים בעלי קלט נמוך בסוגי תאים של עכברים

<ol><li>Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+isotope+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and isotope tracing.</a> Cell. 173 (4), 822-837 (2018).</li>
<li>Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+measurement%3A+Pitfalls+to+avoid+and+practices+to+follow%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).</li>
<li>Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-platform+comparison+of+methods+for+quantitative+metabolomics+of+primary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism.</a> Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).</li>
<li>Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+capillary+electrophoresis+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Advances in capillary electrophoresis for the life sciences.</a> Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).</li>
<li>Žuvela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Column+characterization+and+selection+systems+in+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography.</a> Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).</li>
<li>Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf">https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf</a> (2023).</li>
<li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).</li>
<li>Cabezas-Wallscheid, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+regulatory+networks+in+HSCs+and+their+immediate+progeny+via+integrated+proteome%2C+transcriptome%2C+and+DNA+methylome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis.</a> Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).</li>
<li>Belmonte, M., Kent, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+maintain+single+functional+mouse+hematopoietic+stem+cells+in+vitro+without+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100927(2021).</li>
<li>Devilbiss, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+of+rare+cell+populations+isolated+by+flow+cytometry+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues.</a> eLife. 10, 61980(2021).</li>
<li>Schönberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+omics+analysis+reveals+a+non-classical+retinoic+acid+signaling+axis+that+regulates+hematopoietic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).</li>
<li>Schönberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+targeted+metabolomics+for+FACS-purified+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells.</a> Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).</li>
<li>Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+allosteric+protein-metabolite+interactions+that+control+enzyme+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo.</a> Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).</li>
<li>Binek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+has+a+significant+impact+on+the+cellular+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome.</a> Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).</li>
<li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+%28SICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).</li>
<li>Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+cells+alters+their+redox+state+and+cellular+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+biology%22%5BJournal%5D)">Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome.</a> Redox biology. 16, 381-387 (2018).</li>
<li>Zhang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-GPRC5C+signalling+promotes+dormancy+in+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).</li>
<li>Zafeiriadou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism-related+gene+expression+in+circulating+tumor+cells+from+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer.</a> Cancers. 14 (13), 3237(2022).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+classification+of+circulating+tumor+cells+as+a+biomarker+for+metastasis+and+prognosis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((automRm%3A+An+R+package+for+fully+automatic+LC-QQQ-MS+data+preprocessing+powered+by+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning.</a> Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).</li>
<li>Han, W., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+minimizing+batch+effects+in+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).</li>
<li>Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferences+and+contaminants+encountered+in+modern+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+block+treatment%2C+dead+cells+exclusion%2C+and+cell+aggregates+discrimination+concur+to+prevent+phenotypical+artifacts+in+the+analysis+of+subpopulations+of+tumor-infiltrating+CD11b%2B+myelomonocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells.</a> Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. 41, 1546(2010).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

הצעדים הקריטיים ביותר ליישום מוצלח של מטבולומיקה ממוקדת באמצעות פרוטוקול זה הם: 1) אסטרטגיית צביעה וגטינג חזקה שתניב אוכלוסיות תאים נקיות 2) טיפול מדויק בנפחי נוזלים, 3) תזמון ניתן לשחזור של כל שלבי הניסוי, במיוחד כל השלבים לפני מיצוי מטבוליטים. באופן אידיאלי, כל הדגימות השייכות לניסוי אחד צריכות להיות מעובדות ונמדדות באצווה אחת כדי למזער את השפעות האצווה22. עבור ניסויים גדולים יותר, אנו מציעים לאסוף תמציות תאים ב -80 ° C ולאחר מכן למדוד את כל התמציות באצווה אחת.
כאשר עובדים עם דגימות בעלות קלט נמוך, יש להדגיש טיפול נקי בכל החומרים המשמשים במהלך הניסויים23. זיהומים נפוצים הם שאריות חיץ, דטרגנטים ומוצרי טיפוח העור. האמצעי החשוב ביותר למזעור הזיהום הוא שימוש בכפפות מתאימות לאורך כל הניסוי. 
כדי למזער שינויים פוטנציאליים בהרכב המטבוליטים עקב חשיפה של תאים לתנאים לא פיזיולוגיים, חיוני להכין את הדגימות על קרח ועם ריאגנטים קרים (4 מעלות צלזיוס). כמו כן, להיות מהיר ככל האפשר לפני שלב FACS יגדיל את איכות המדידה2. הזמנים המצוינים לצביעת נוגדנים הם קצרים ככל האפשר ליעילות צביעה טובה. צעד נוסף לחסימת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לקולטני Fc באמצעות נוגדנים בלוק Fc ניתן להוסיף לפני הליך צביעת FACS24,25. זה מונע זיהום של אוכלוסיות תאי היעד ומומלץ במיוחד כאשר עובדים עם תרחיפים של תאים הכוללים סוגים רבים של תאים גבוהים קולטן Fc (כמו מונוציטים או מקרופאגים) או תאים שגודלו בתרבית ללא נסיוב. עם זאת, זה יגדיל את זמן הטיפול הכולל ב 10-15 דקות ולכן עשוי להוסיף שונות לא פיזיולוגית נוספת לתוצאות.
עם השימוש בשיטות MRM דינמיות על ספקטרומטרים מודרניים של מסות, ניתן להקליט את כל המטבוליטים המפורטים בהגדרות ספציפיות לתרכובת בזריקה אחת. הגבלת מספר מטבוליטי המטרה מאפשרת יישום של הפרוטוקול המתואר על ספקטרומטרים ישנים יותר של מסות ומאיצה עיבוד מקדים של נתונים וניתוח נתונים.
רמה מסוימת של אות רקע בנתוני LC-MS היא בלתי נמנעת. לכן, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לזהות את אותם מטבוליטים שניתן לזהות מעל הרקע. מיון אירועים קטנים מכדי לייצג תאים שלמים (פסולת) יוצר דוגמאות ריקות רלוונטיות בתהליך המייצגות עוצמות אות רקע תלויות מטריצה. בנוסף, תקנים פנימיים מאפשרים זיהוי דגימות בעייתיות שיש להחריגן מניתוח נתונים נוסף26. שני אמצעי אבטחת האיכות פועלים בצורה הטובה ביותר אם קיים מספר גדול מספיק של עותקים משוכפלים. אנו ממליצים להשתמש בלפחות שישה עותקים משוכפלים לכל קבוצה.

חילוף חומרים הוא תהליך ביולוגי חיוני המתרחש בכל התאים החיים. תהליכים מטבוליים כוללים רשת עצומה של תגובות ביוכימיות המווסתות ומחוברות זו לזו, ומאפשרות לתאים לייצר אנרגיה ולסנתז ביומולקולות חיוניות1. כדי להבין את תפקודן של רשתות מטבוליות, חוקרים מודדים את רמות המתווכים של מולקולות קטנות בתוך התאים. מתווכים אלה משמשים אינדיקטורים חשובים לפעילות מטבולית ויכולים לחשוף תובנות קריטיות לגבי תפקוד התאים.
ספקטרומטריית מסה (MS) היא הבחירה הפופולרית ביותר לזיהוי ספציפי של מטבוליטים בדגימות מורכבות 1,2. לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) יש יתרונות בכימות מוחלט של תרכובות והבהרת מבנה, אך טרשת נפוצה יכולה לעתים קרובות לפתור רכיבים נוספים בתערובות מורכבות כגון נוזלים ביולוגיים או תמציות תאים. לעתים קרובות יותר, טרשת נפוצה משולבת עם הפרדה קודמת של התרכובת על ידי אלקטרופורזה נימית (CE), כרומטוגרפיית גז (GC), או כרומטוגרפיה נוזלית (LC)3. הבחירה בפלטפורמת ההפרדה מונעת בעיקר על ידי מגוון המטבוליטים של המטרה וסוג הדגימה, ובסביבה בעולם האמיתי, על ידי זמינות המכונות והמומחיות. לכל שלוש פלטפורמות ההפרדה יש טווח רחב וחופף של מטבוליטים מתאימים אך מגבלות שונות. בקצרה, CE יכול רק להפריד מולקולות טעונות ודורש מומחיות רבה כדי ליישם ניתוח חזק של מספר רב של דגימות4. GC מוגבל למולקולות קטנות ואפולריות מספיק כדי להתאדות לפני פירוק3. בהתחשב בכל עמודות LC זמין מסחרית, כל שני מטבוליטים ניתן להפריד על ידי טכנולוגיה זו5. עם זאת, שיטות LC רבות מציגות פחות כוח פתרון מאשר שיטות CE או GC באורך דומה.
הכמות האופיינית של חומר מוצא למדידות מטבולומיות היא בדרך כלל בטווח של 5 x 105 עד 5 x 107 תאים לדגימה, 5-50 מ"ג של רקמה רטובה, או 5-50 מיקרוליטר של נוזל גוף6. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר להשיג כמויות כאלה של חומר מוצא כאשר עובדים עם תאים ראשוניים של סוגי תאים נדירים, כגון למשל תאי גזע hematopoietic (HSC) או תאים סרטניים במחזור. תאים אלה נמצאים לעתים קרובות במספרים נמוכים מאוד ולא ניתן לטפח אותם מבלי לפגוע בתכונות תאיות קריטיות.
HSCs ותאי אב רב-פוטנטיים (MPPs) הם התאים הכי פחות ממוינים של המערכת ההמטופויטית ומייצרים ברציפות תאי דם חדשים לאורך חיי האורגניזם. הרגולציה של hematopoiesis הוא בעל רלוונטיות קלינית בתנאים כגון לוקמיה ואנמיה. למרות חשיבותם, HSCs ו-MPPs הם בין התאים הנדירים ביותר במערכת ההמטופויטית. מעכבר יחיד, בדרך כלל, ניתן לבודד כ- 5000 HSCs 7,8,9. מכיוון ששיטות מטבולומיות מסורתיות דורשות יותר חומר קלט, איגום תאים מעכברים מרובים היה נחוץ לעתים קרובות כדי לנתח סוגי תאים נדירים10,11.
כאן שאפנו לפתח פרוטוקול המאפשר מדידה של מטבוליטים ב-5,000 תאים בלבד לדגימה, כדי לאפשר הפקת נתונים מטאבולומיים מ-HSCs של עכבר בודד12. יחד עם זאת, שיטה זו מאפשרת ליצור שכפולים מרובים מעכבר יחיד עבור סוגי תאים שופעים יותר כמו לימפוציטים. גישה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים לפרויקט נתון, ובכך תורמת ל"3R" (הפחתה, החלפה, עידון) של ניסויים בבעלי חיים.
מטבוליטים בתאים יכולים להיות בעלי שיעורי תחלופה גבוהים מאוד, לעתים קרובות בסדר גודל של שניות13. עם זאת, הכנת דגימות למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) יכולה להימשך שעות, ומיון FACS עצמו יכול להימשך דקות עד שעות, מה שמוביל לשינויים פוטנציאליים במטבוליזם עקב תנאים לא פיזיולוגיים. לחלק מהריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה (כגון חיץ ליזה של אמוניום-כלוריד-אשלגן [ACK]) יכולות להיות השפעות דומות. תנאים אלה יכולים לגרום לעקה תאית ולהשפיע על רמות ויחסים של מטבוליטים בתוך התאים, מה שמוביל למדידות לא מדויקות או מוטות של חילוף החומרים התאי 14,15,16. השינויים המטבוליים עקב הכנת הדגימה מכונים לעיתים ממצאי מיון. פרוטוקולי עיכול ארוכים וריאגנטים קשים שעשויים להידרש כדי לייצר תרחיפים חד-תאיים מרקמות קשות או קשות עלולים להחמיר בעיה זו. השינויים שיכולים להתרחש תלויים ככל הנראה בסוג התא ובמצב העיבוד. טבעם המדויק של השינויים נותר לא ידוע, שכן לא ניתן למדוד את המצב המטבולי של התאים הבלתי מופרעים ברקמה החיה.
הפרוטוקול המוצג כאן כולל מספר הבדלים מרכזיים בהשוואה לשיטות מסורתיות, כלומר השימוש ב-NaCl 5 גרם/ליטר כנוזל נדן, מיון ישירות למאגר מיצוי, הזרקת נפחי דגימה גדולים על ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית (HILIC-MS), ושימוש בכימות ממוקד, שימוש קפדני בתקנים פנימיים ובבקרות רקע (איור 1). לפרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמר הבדלים בין סוגי תאים ובין טיפול תרופתי לבקרת רכב במידה רבה12. אפילו עבור תאים בתרבית, הוא משתווה לטובה לגישות חלופיות, כגון צנטריפוגה מבוססת יותר והסרה ידנית של סופרנטנט. עם זאת, מכיוון שמיון ממצאים עדיין עשוי להתרחש, יש לפרש את הנתונים בזהירות. למרות מגבלה זו, הפרוטוקול מייצג שיפור משמעותי בתחום האפיון המטבולי, ומאפשר מדידות מדויקות ומקיפות יותר של חילוף החומרים התאי בתאים ראשוניים נדירים12.
היכולת למדוד באופן יציב פרופילים מטבוליים רחבים בתאים ראשוניים נדירים פותחת את הדלת לניסויים חדשים במחקר ביו-רפואי המערבים תאים אלה. לדוגמה, רגולציה מתווכת מטבולית ב- HSCs הוכחה כמשפיעה על יכולת התחדשות עצמית רדומה, עם השלכות על אנמיה ולוקמיה11,17. בתאי גידול שמקורם בחולה, הבדלים בביטוי גנים מטבוליים בין הגידול לתאים סמוכים הוכחו18,19. פרוטוקול זה מאפשר כעת לחוקרים לחקור הבדלים אלה באופן שיטתי ברמה המטבולית, הנחשבת בדרך כלל קרובה יותר לפנוטיפ התאי מאשר ביטוי גנים.

<table><tbody><tr><td>תמצית שמרים 13C</td><td>פתרונות איזוטופיים</td><td>ISO-1</td><td></td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסננת תאים</td><td>m קורנינג</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, מאגר ליזה בדרגת LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.32</td><td></td></tr><tr><td>ACK</td><td>Gibco</td><td>104921</td><td>לחלופין: Lonza, Cat# BP10-548E</td></tr><tr><td>אדנוזין דיפוספט (ADP)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין מונופוספט (AMP)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום קרבונט, HPLC כיתה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A/3686/50</td><td></td></tr><tr><td>אטלנטיס פרמייר BEH Z-HILIC עמודה (100 x 2.1 מ"מ, 1.7 ומיקרו; m)</td><td>Waters</td><td>186009982</td><td></td></tr><tr><td>B220-A647</td><td>Invitrogen</td><td>103226</td><td></td></tr><tr><td>B220-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td>RRID:AB_313005</td></tr><tr><td>CD11b-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>101216</td><td>RRID:AB_312799</td></tr><tr><td>CD150-BV605</td><td>BioLegend</td><td>115927</td><td>RRID:AB_11204248</td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-0031-83</td><td></td></tr><tr><td>CD48-BV421</td><td>BioLegend</td><td>103428</td><td>RRID:AB_2650894</td></tr><tr><td>CD4-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td>RRID:AB_2660860</td></tr><tr><td>CD8a-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>100722</td><td>RRID:AB_312761</td></tr><tr><td>cKit-PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td>RRID:AB_313217</td></tr><tr><td>ערכת תאי CD4 של עכבר שלא נגעו בהם&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>108416</td><td>RRID:AB_313381</td></tr><tr><td>רדיד איטום חום</td><td></td><td>Neolab Jul-18</td><td></td></tr><tr><td>איזולאוצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>58880</td><td></td></tr><tr><td>JetStream ESI מקור</td><td>Agilent</td><td>G1958B</td><td></td></tr><tr><td>לאוצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מדרונית,</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M9508-1G</td><td></td></tr><tr><td>, מתנול, קארל רוט בדרגת LC-MS</td>, <td>HN41.2</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td>, <td>D8537</td><td></td></tr>, <tr><td>Sca1-APC/Cy7</td>, <td>BioLegend</td><td>108126</td><td>RRID:AB_10645327</td></tr><tr><td>TER119-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>116221</td><td>RRID:AB_2137789</td></tr><tr><td>Triple Quadrupole מסה ספקטרומטר</td><td>Agilent</td><td>6495B</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR צלחת 96 באר LoBind חצאית</td><td>Eppendorf</td><td>30129512</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G7157B</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC עמוד תרמוסטט</td><td>Agilent</td><td>G7116B</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC משאבת</td><td>Agilent</td><td>G7120A</td><td></td></tr><tr><td>תרמוסטט לדוגמא UHPLC</td><td>Agilent</td><td>G4761A</td><td></td></tr></tbody></table>

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

תפקוד התאים תלוי באופן קריטי בחילוף החומרים, וניתן לחקור את תפקוד הרשתות המטבוליות הבסיסיות על ידי מדידת מתווכים של מולקולות קטנות. עם זאת, השגת מדידות מדויקות ואמינות של חילוף החומרים בתאים, במיוחד בסוגי תאים נדירים כמו תאי גזע המטופויטיים, דרשה באופן מסורתי איגום תאים מבעלי חיים מרובים. פרוטוקול מאפשר כעת לחוקרים למדוד מטבוליטים בסוגי תאים נדירים באמצעות עכבר אחד בלבד בכל דגימה, תוך יצירת מספר עותקים משוכפלים עבור סוגי תאים נפוצים יותר. זה מקטין את מספר בעלי החיים הדרושים לפרויקט נתון. הפרוטוקול המוצג כאן כולל מספר הבדלים מרכזיים על פני פרוטוקולים מטאבולומיים מסורתיים, כגון שימוש ב- NaCl 5 גרם / L כנוזל מעטפת, מיון ישירות לאצטוניטריל, ושימוש בכימות ממוקד תוך שימוש קפדני בתקנים פנימיים, המאפשרים מדידות מדויקות ומקיפות יותר של חילוף החומרים התאי. למרות הזמן הנדרש לבידוד תאים בודדים, צביעה פלואורסצנטית ומיון, הפרוטוקול יכול לשמר במידה רבה הבדלים בין סוגי תאים וטיפולים תרופתיים.

מיון FACS מאפשר בידוד של אוכלוסיות נקיות מסוגי תאים שונים מאותו תרחיף תאים (איור 2 ואיור 3). הספציפיות של שיטה זו מסתמכת על צביעה של סוגי תאים שונים עם סמני משטח ספציפיים (לדוגמה, תאי B ותאי T מהטחול) או שילובים ספציפיים של סמני פני שטח (לדוגמה, HSCs ו- MPPs). צביעה של סמנים תוך תאיים דורשת בדרך כלל חדירה של קרום התא. זה יכול לגרום לדליפה של מטבוליטים, ולכן סוג זה של כתמים אינו מתאים לשימוש בפרוטוקול זה.
LC מספק הפרדה של מטבוליטים לפני גילוי על-ידי טרשת נפוצה (איור 4). מטבוליטים פולטים מעמודת HILIC בערך לפי קוטביות, כאשר פחות תרכובות קוטביות פולטות מוקדם ויותר מטבוליטים קוטביים נפלטים מאוחר יותר. עוצמת האות נקבעת על ידי כמות מטבוליט המטרה במדגם וגורם תגובה ספציפי למטבוליט. כתוצאה מכך, לא ניתן להשוות באופן משמעותי את עוצמות האות בין מטבוליטים אלא רק עבור מטבוליט אחד על פני דגימות. 3 הפסגות המודגשות באיור 4 מייצגות 1: ניאצינאמיד מזוהה הן בפסולת והן בתמצית תאים, אם כי ברמות שונות, 2: אצטיל-קרניטין שמזוהה כמעט אך ורק בתמציות תאים, ו-3: חומצה אמינוטרפטלית סטנדרטית פנימית שמזוהה באותה רמה בדגימות פסולת ותמציות תאים.
הבדלים מטבוליים בין סוגי תאים מאותה רקמה נשמרים באמצעות פרוטוקול FACS-LC-MS משולב (איור 5). עבור HSCs ו-MPPs, תאים מ-6 עכברים נדרשו לייצר 6 דגימות, מה שהוביל לשונות גדולה יותר בתוך כל קבוצה בהשוואה לתאי B ותאי T, שמוינו מאותו טחול מורין. דגימות פסולת המייצגות דגימות בקרה ריקות בתהליך מופרדות בבירור מדגימות המכילות תמציות תאים. בתוך דגימות הפסולת נראית הפרדה ברורה בין שני הניסויים, המדגישה את ההבדל בסביבה המטבולית שהתאים חווים לפני המיון. כאשר הוא מיוצג במפת חום מקובצת (איור 6), מידע נוסף הופך גלוי, כגון הרמות היחסיות של מטבוליטים בין דגימות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של שלבים מרכזיים בפרוטוקול המוצג. נתון זה הודפס מחדש באישור Schoenberger et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig02.jpg"> איור 2: בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי B ותאי T מהטחול. תאים ואירועי פסולת נבחרו בהתבסס על אותות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). תאי B ותאי T נבחרו בהתבסס על אותות צביעה ספציפיים לסוג התא. נתון זה הותאם באישור Schoenberger et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig03.jpg"> איור 3: בידוד של HSC ו-MPP ממח העצם. תאים ואירועי פסולת נבחרו בהתבסס על אותות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). אוכלוסיות HSC ו-MPP נבחרו בהתבסס על שלבים מרובים של אותות צביעה ספציפיים לסוג התא. נתון זה הותאם באישור Schoenberger et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig04.jpg"> איור 4: כרומטוגרמות לדוגמה. דגימות עם (A) 5000 HSCs ו-(B) 5000 אירועי פסולת מאותו סוג. שים לב שהציר חולק קנה מידה זהה בשתי החלוניות. מטבוליטים מודגשים הם 1: ניקוטינאמיד, 2: אצטיל-קרניטין, 3: חומצה aminoterephtalic (ATA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig05.jpg"> איור 5: ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של פרופילים מטבוליים מסוגי תאים שונים ודגימות רקע של פסולת מאותם ניסויים. נצפתה הפרדה גדולה בין האיברים השונים ודגימות רקע של פסולת מכל איבר. בנוסף, סוגי תאים מופרדים בבירור בתוך התאים של כל איבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig06.jpg"> איור 6: מפת חום המייצגת מטבוליטים שנמדדו בין סוגי תאים שונים ודגימות בקרת רקע תואמות (פסולת). ערכים חסרים זוקפו עם ערך חצי מינימום של אותו מטבוליט בכל הדגימות. עבור plotting, הנתונים נורמלו למקסימום בנפרד בכל שורה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: הטבלה מפרטת את ההגדרות הספציפיות לתרכובת עבור המטבוליטים שנבחרו, כולל זמן שמירה (RT), קוטביות (Pol), מבשר m/z (Q1), מקטע m/z (Q3) ואנרגיית התנגשות (CE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידה מדויקת ואמינה של מטבוליטים בסוגי תאים נדירים. שיפורים טכניים, כולל נוזל מעטפת שונה למיון תאים ויצירת דגימות ריקות רלוונטיות, מאפשרים כימות מקיף של מטבוליטים עם קלט של 5000 תאים בלבד לדגימה.

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

המטרה העיקרית של המעבדה שלי היא לשמור על תאי גזע המטופויטיים בריאים שמושכים למעלה בהזדקנות כדי למנוע ממאירויות המטולוגיות, ואנחנו עושים זאת על ידי ביצוע התערבויות תזונתיות. לכן, בפרט, אנו מעוניינים להבין כיצד מטבוליטים שמקורם בתזונה מווסתים את הגבעול וגם מטבוליטים תוך-תאיים כיצד הם מווסתים את גורל תאי הגזע. תאי גזע המטופויטיים הם אוכלוסייה נדירה מאוד, כלומר אנו תמיד מתמודדים עם האתגר שאין לנו מספיק חומר לבצע את הניסויים שלנו.אבל עכשיו עם הקמת שיטות תא בודד, וגם עם שיטות קלט נמוך, השגנו ידע חדש על איך תאי גזע אלה מוסדרים. תאי גזע המטופויטיים הם אוכלוסייה נדירה מאוד ובנוסף, הם זעירים מאוד. עכשיו, עם השיטות שפיתחנו כאלה, למשל, מטבולומיקה קלט נמוך מבוסס על מפרט מסה, אנחנו עכשיו יכולים לזהות עם מספר נמוך מאוד של תאים, מאות מטבוליטים, זה איפשר לנו עכשיו להבין מה התפקיד של מטבוליטים מסוימים עבור ויסות תאי גזע.בעבר, ניתוח מטבולומי של תאים ראשוניים נדירים דרש עכברים רבים וימי עבודה והכנת דגימות. עם הפרוטוקול החדש שלנו, אנו זקוקים לפחות עכברים ופחות זמן. בנוסף, צמצמנו את מספר השלבים הידניים, כך שהפרוטוקול כולו הופך לחזק יותר.בעתיד, תכננו להתאים את פרוטוקול הקלט הנמוך שלנו כדי לאפשר ניתוח נוסף ותאים ראשוניים נדירים. לדוגמה, מטבולומיקה לא ממוקדת וליפידומיקה.

targeted-metabolomics-on-rare-primary-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים, תוך שימוש בשילוב של מעקב איזוטופים יציב, מיון תאים לבידוד סוגי תאים ספציפיים וספקטרומטריית מסה.

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

מיומנות מטבולית של מערכות במבחנה ב הוא דרישת מפתח עבור biotransformation ומכירה של סמים toxicants. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היישום של בדיקות מטבוליות התייחסות להעריך בשלב שאני המטבוליזם בתרביות תאים.

ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא תרבויות

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

כתב היד מציג באתר דגימה של גידולים במוח האנושי עם מיקרו-ארכה שלב מוצק ואחריו פרופיל ביוכימי שלהם לקראת גילוי סמנים ביולוגיים.

באתר דגימה וחילוץ של גידולים במוח עבור מטבולומיקה וניתוח Lipidomics

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מאיי לבלב פרימטים קפואים שאינם אנושיים לשימוש בריצוף RNA סימולטני של גרעין יחיד וריצוף ATAC תוך שמירה על החלק הציטוסולי בתפזורת לניתוחים מטבוליים מאותן דגימות.

הכנת איים עובריים פרימטים קפואים שאינם אנושיים לריצוף RNA משולב של גרעינים בודדים וריצוף ATAC, ומטבולומיקה בתפזורת

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

למד מטבולומיקה ממוקדת לתאי גזע המטופואטיים נדירים באמצעות ספקטרומטריית מס. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מאות מטבוליטים מ-5000 תאים בלבד לחקר רגולציית תזונה ותאי גזע.

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

גלה סרטונים נוספים