ייצור רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון
8 בספטמבר 2023
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום שכבה אחת של גרפן על רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים וכיצד להכין אותם לשימוש בקביעת מבנה cryoEM.
כיום, שימור אופטימלי של דגימות ביולוגיות הוא אתגר גדול בהשגת מבני CryoEM ברזולוציה גבוהה. במהלך תהליך הכנת הדגימה, הדגימות נחשפות לממשק אוויר-מים הידרופובי, שיש לו השפעות דנטורינג על הדגימות ויכול לגרום לדגימות יציבות לאמץ אוריינטציה מועדפת בקרח, המונעת קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. ציפוי רשתות CryoEM בשכבה דקה של פחמן של תחמוצת גרפן רכה, שימש בדרך כלל לטיפול בבעיות הקשורות לאינטראקציות עם ממשק אוויר-מים.
עם זאת, שכבות אלה מגבירות לעתים קרובות את רעשי הרקע בתמונות שלנו, אשר פוגעות ברזולוציות של המבנה שלנו. ציפוי הרשת בשכבה אחת של גרפן משיג הגנה דומה מבלי להכניס רעשי רקע משמעותיים. שימוש ברשתות CryoEM מצופות גרפן יכול לעזור להתגבר על בעיות הקשורות לאינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, עם זאת, רשתות גרפן מסחריות הן יקרות ומעבדות רבות רואות ברשתות גרפן מסובכות מדי להכנה פנימית.
חוקרים בתחום CryoEM יכולים כעת להשתמש בפרוטוקול שלב אחר שלב זה כדי לשחזר עשרות גרפנים באיכות גבוהה המיוצרים במלואם ביום אחד.
סקירה כללית
מחקר זה עוסק באתגר של שימור אופטימלי של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית בקירור (cryo-EM) ברזולוציה גבוהה. המחברים מציגים פרוטוקול לציפוי רשתות EM בשכבה אחת של גרפן (monolayer) כדי למזער את רעש הרקע ולשפר את שלמות הדגימה במהלך ההדמיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים
- שימור דגימות בדימות ביולוגי
- יישומים של גרפן במיקרוסקופיה
רקע
- שימור של דגימות ביולוגיות הוא קריטי לקבלת מבני cryo-EM ברזולוציה גבוהה.
- ציפויים מסורתיים של פחמן עלולים להגביר את רעש הרקע בדימות.
- גרפן מספק שכבת הגנה מבלי לפגוע באיכות התמונה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יישום של שכבת גרפן אחת (monolayer) על רשתות EM
- טכניקות דימוי ב-Cryo-EM
- שימוש במכשירים לציפוי סבב (spin coaters) מתוצרת ביתית ובחומרי ניקוי שונים
תוצאות עיקריות
- רשתות מצופות גרפן מראות רעשי רקע מופחתים בדימות.
- השיטה מאפשרת ייצור המוני של גרפן באיכות גבוהה ביום אחד.
- רשתות EM מדגימות שימור וריכוז יעיל של דגימות ביולוגיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה פשוטה למעבדות לייצור רשתות EM מצופות גרפן.
- התקדמות זו מגבירה את הפוטנציאל לשיפור בדימוי cryo-EM במחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה אלקטרונית בקריו ברזולוציה גבוהה (cryoEM) היא מרכיב מרכזי בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות, אך דנטורציה של הדגימה והטיית אוריינטציה בממשק האוויר-מים מגבילים את איכות הנתונים ואת תפוקת העבודה. רשתות מצופות גרפן בשכבה אחת פותרות צווארי בקבוקים אלו על ידי שמירה על השלמות המקרו-מולקולרית והפחתת רעשי רקע, מה שמשפיע ישירות על שלבי הגילוי המוקדמים ותיקוף המטרה. ייצור פנימי וניתן להרחבה של רשתות גרפן מאפשר אימוץ רחב יותר, תומך במחקרים מבניים של תיקי פיתוח שלמים ומאיץ את הפחתת הסיכונים המכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מבנית ברמת דיוק גבוהה של קומפלקסים מקרו-מולקולריים לצורך תיקוף המטרה.
- מפחית דנטורציה ואגרגציה, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים.
- משפר את מגוון האוריינטציות, ובכך מגביר את הביטחון החזוי במודלים מבניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקל על הכנת רשתות cryoEM בעלות רעש רקע נמוך וניתנות לשחזור עבור סריקות המשך.
- תומך בדימות כמותי על ידי מזעור רעשים וארטיפקטים של ריכוז.
- מאפשר הערכה מהימנה של קומפלקסים חלבונים בריכוזי דגימה נמוכים יותר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- משפר את הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה ביצירה של נתונים מבניים חזקים.
- מתואם עם פיתוח ביומרקרים תרגומיים (translational biomarkers) באמצעות רזולוציה מבנית משופרת.
- מפחית את הסיכון לכישלונות בשלבים מאוחרים עקב נתונים מבניים מעורפלים או פגומים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
רשתים מצופים בשכבת גהראפן בודדת (Monolayer graphene) משתלבים בתהליך העבודה של cryoEM, החל משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מובילים ומחקר פרה-קליני, ובכך תומכים במחקרים מבניים מבוססי היפותזות ומאפשרים דימוי איכותי הניתן לשחזור.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי שימור קונפורמציות מקרו-מולקולריות טבעיות.
- סריקה: מספקת רשתות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור בדיקות cryoEM כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה וברעש נמוך לצורך ניתוח השוואתי חסון.
- מחקר תרגומי: משפרת את הרציפות הפרה-קלינית על ידי אפשור אפיון מבני מהימן של מועמדים תרופתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת להרחבה ומשתלמת עבור מחקרי מבנה חוזרים לאורך תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה מבנית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הרשתות, שיפור השחזוריות ואפשרות להרחבת קנה המידה לסדרות של דגימות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות של המשכה או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות נתונים באיכות גבוהה יותר.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות מאושרות מבנית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ברשתות cryoEM ובמניפולציה של גרפן.
- נדרשת גישה למכשירים לציפוי ספין (spin coaters), למכסות פuming (fume hoods) ולתשתית סטנדרטית להכנת רשתות EM.
- נדרש סטנדרזציה בין-צוותית להבטחת איכות רשת ותוצאות דימות הניתנות לשחזור.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מחלקות חלבונים או סוגי דגימות שונים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות רגישות בטיפול והכשרה ראשונית לשלבי העברת הגרפן.
