Name: ייצור רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למדו לייצר רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון. שיטה זו מפחיתה רעש רקע ומשפרת את שימור הדגימות הביולוגיות בתהליך ההדמיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר שיאו פאן על דיונים מועילים בעת ביסוס שיטות אלה ב- Scripps Research. B.B נתמך על ידי מלגת מחקר פוסט-דוקטורט מקרן יואיט למחקר רפואי. W.C. נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של הקרן הלאומית למדע. D.E.P נתמך על ידי NS095892 המענק של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ל- G.C.L. פרויקט זה נתמך גם על ידי מענקי NIH GM142196, GM143805 ו-S10OD032467 ל-G.C.L.

ציפוי רשתות TEM בשכבה חד-שכבתית של גרפן

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

שימור דגימות ביולוגיות בשכבה דקה של קרח זגוגי הוא צעד חשוב ביותר לקביעת מבנה cryoEM ברזולוציה גבוהה. עם זאת, חוקרים נתקלים לעתים קרובות בבעיות הנובעות מאינטראקציות עם AWI, אשר מציג אוריינטציה מועדפת, פירוק מורכב, דנטורציה וצבירה. יתר על כן, לא תמיד ניתן לרכז את הדגימות במידה מספקת כדי לאכלס את הקרח הדק התלוי על פני חורי היריעה המוגדרת. מספר קבוצות מחקר פיתחו שיטות לצפות רשתות EM עם שכבה אחת של גרפן כדי לעזור להתגבר על חלק מהמגבלות הללו 24,25,26,27,28,29,30, ורשתות גרפן שימשו בהצלחה רבה. כאן, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב להכנת אצוות יעילות של רשתות גרפן בתוך החברה ובחינת איכות רשתות הגרפן על ידי TEM. נדגיש כי יש לנקוט משנה זהירות בחלק מהצעדים הקריטיים, אותם נפרט להלן.
לגרפן יש נטייה חזקה למשוך מזהמים הנישאים באוויר. לכן, בתהליך ייצור רשת הגרפן, חשוב לוודא שכל הכלים הבאים במגע עם יריעת הגרפן/Cu או עם הרשתות נקיים ונקיים מאבק. כיסויי זכוכית המשמשים להעברת גרפן ניתנים לניקוי על ידי שטיפה באתנול ומי DI או באמצעות דוסטר אוויר. מומלץ גם לעבוד מתחת למכסה מנוע מנדף ולשמור על יריעות גרפן ורשתות מכוסות בנייר כסף או צלחת זכוכית נקייה בכל עת. אבק או מזהמים על הרשתות עלולים למנוע מגרפן להיצמד ביסודיות לרשתות האלקטרומגנטיות. בעת טיפול ברשתות מצופות גרפן או גרפן, חשוב להיות מוארקים חשמלית כדי למנוע נזק לסרט הגרפן כתוצאה מפריקה סטטית. ניתן למנוע פריקה סטטית על ידי שימוש ברצועת הארקה לפרק כף היד, נגיעה בחפץ מתכתי מוארק בכל פעם שמטפלים ברשתות גרפן או גרפן, ו/או אי לבישת כפפה על היד האוחזת בפינצטה24.
מכיוון ששכבה אחת של גרפן היא דקה מאוד (רוחב של אטום פחמן), חשוב לתמוך בגרפן עם שכבה אורגנית כגון MMA או poly-MMA (PMMA) במהלך העברת גרפן לרשתות. PMMA הוא החומר הנפוץ ביותר להעברת גרפן. עם זאת, ל-PMMA יש זיקה חזקה לגרפן ולעתים קרובות הוא עלול לגרום לזיהום פולימרי על סרט הגרפן. MMA משמש בפרוטוקול זה, כפי שהוא משאיר פחות זיהום שיורי25. אולם גם ל-PMMA וגם ל-MMA יש את החיסרון של יצירת קמטים וסדקים שניתן לראות באזורים מסוימים של סרט הגרפן (איור 3B). זה יכול להיות מאתגר להימנע מקמטים אלה כפי שהם מתרחשים בדרך כלל במהלך צמיחת גרפן על ידי שיטת CVD31. לאחרונה פותחה שיטה לגידול גרפן שטוח במיוחד ללא קמטים, לפיה רדיד הנחושת מוחלף בפרוסת Cu(111)/ספיר כמצע צמיחה32.
בהתבסס על הניסיון שלנו, עדיף לרכוש יריעות גרפן/Cu ולתמוך בגרפן עם MMA בתוך הבית מאשר לרכוש יריעות Cu-graphene מכוסות פולימר מהיצרנים, אשר הופכות שבירות לאחר חריטת נחושת וקשה לטפל בהן בשלבים הבאים. את מעיל הספין בו השתמשנו לציפוי MMA ניתן לבנות בזול באמצעות חלקים מחנות מחשבים/חומרי בניין מקומית, כפי שתואר קודם לכן25.
במהלך שלב ציפוי MMA, חשוב לכסות את כל משטח הגרפן על יריעת Cu-graphene עם MMA. לאחר שה-Cu נחרט, MMA-גרפן יהפוך לשקוף למחצה, ואזורים ללא כיסוי MMA ייראו כמו חורים ריקים. כדי למנוע ציפוי MMA בצד הנחושת, חשוב להניח מתחתיו במהלך הציפוי פיסת נייר ניקוי קטנה, כך שהיא תספוג את עודפי ה-MMA שמסתובבים החוצה מסרט ה-CVD.
לאחר החריטה והשטיפה, יריעת MMA/גרפן מוכנה להעברה לרשתות EM באמצעות מערכת שוקת מסחרית או ביתית עם מזרק או משאבה פריסטלטית כדי לשלוט במפלס המים. לפני שלב ההעברה, חשוב לשטוף היטב את הרשתות באמבטיות עוקבות של כלורופורם, אצטון ו- IPA. אפיית רשתות מצופות גרפן בטמפרטורה של 65°C מסייעת בשמירה על שלמות הגרפן ומקדמת ספיחת גרפן לרשתות. לבסוף, כדי למנוע זיהום MMA ברשתות, חשוב להסיר ביסודיות MMA באמבט אצטון ולנקות את הרשתות ב- IPA. כל שאריות MMA לא שטופות ייצפו ברשתות EM ויקטינו את יחס האות לרעש של התמונות (איור 3C). ניתן לחזור על תהליך שטיפת אצטון-IPA כדי לנקות עוד יותר את משטחי הגרפן.
כדי להפוך את רשתות הגרפן להידרופיליות, חשפנו את הרשתות לקרינת UV/אוזון. מודלים שונים של שואבי UV / אוזון עשויים לדרוש אופטימיזציה כדי לחמצן מספיק את שכבת הגרפן להכנת דגימת cryoEM מבלי לפגוע בגרפן. ללא קשר למערכת, קריטי להשתמש ברשתות אלה ליישום דגימת cryoEM מיד לאחר טיפול UV / אוזון. שיטות חלופיות להפיכת רשתות גרפן להידרופיליות מתוארות במחקרים אחרים33,34.

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני של חלקיק יחיד (cryoEM) הוא טכנולוגיה ישימה יותר ויותר המשמשת לחקר המבנים התלת-ממדיים של ביומקרומולקולות. ההתקדמות הטכנולוגית באופטיקה של מיקרוסקופ אלקטרונים, גילוי אלקטרונים ישיר1 ואלגוריתמים ממוחשבים 2,3,4 במהלך העשור האחרון אפשרו למשתמשי cryoEM לקבוע את המבנים של קומפלקסים מקרומולקולריים יציבים ביוכימית לרזולוציה כמעט אטומית 5,6,7,8 . למרות התקדמות זו, עדיין קיימים מחסומים בולטים לשימור דגימות להדמיית cryoEM, המונעים מרוב הדגימות הביולוגיות להיפתר ברזולוציות כה גבוהות.
הכנת הדגימה לניתוח cryoEM ברזולוציה גבוהה כרוכה בלכידת מקרומולקולות המפוזרות באופן שווה במגוון רחב של כיוונים בתוך שכבה דקה של קרח מזוגג. שיטות הקפאה "כתם וצניחה" הן השיטות הנפוצות ביותר המשמשות ליצירת שכבות דקות של דגימות ביולוגיות על רשתות עבור מחקרי cryoEM 9,10. שיטות אלה כוללות יישום של כמה מיקרוליטרים של תמיסת דגימה על רשת EM המכילה סרט fenestrated שהפך הידרופילי ולאחר מכן למחוק את רוב הדגימה עם נייר מסנן לפני צלילה מהירה של הרשת לתוך קריוגן של אתאן נוזלי או תערובת אתאן-פרופאן9.
בעוד שיטה זו שימשה בהצלחה כדי לקבוע מבנים של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כל שיטות הכנת דגימות cryoEM הנפוצות חושפות דגימות לממשק אוויר-מים הידרופובי (AWI), אשר לעתים קרובות מציג בעיות המגבילות קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. נקבע כי לדגימות ביולוגיות יש נטייה גבוהה לדנטורציה כאשר הן נחשפות ל- AWI, מה שיכול להוביל לצבירה מורכבת ופירוק11,12,13,14. יתר על כן, כתמים הידרופוביים על פני השטח של דגימות ביולוגיות גורמים לחלקיקים לאמץ אוריינטציות מועדפות בקרח12. בתרחישים רבים, אזור הידרופובי יחיד של הדגימה מאלץ את כל החלקיקים לאמץ אוריינטציה ייחודית בקרח, ובכך מבטל את היכולת ליצור שחזור אמין. בנוסף לבעיות עם AWI, דגימות עשויות להראות זיקה לפני השטח של שכבת היריעה המוגדרת, מה שמגביל את מספר החלקיקים המרחפים בקרח בתוך החורים15.
מספר פתרונות מתודולוגיים וטכנולוגיים פותחו כדי לצמצם בעיות אלה הנובעות מאינטראקציות עם AWI או הסרטים16,17. גישה פופולרית אחת היא לצפות את היריעה המחוספסת של רשתות הקרינה האלקטרומגנטית בשכבה דקה (עשרות ננומטרים) של פחמן אמורפי. ציפוי זה מספק משטח רציף על פני החורים שאליהם חלקיקים יכולים לספוח, עם היתרון של הגנה חלקית על הדגימה מפני אינטראקציות עם AWI15,18,19,20. עם זאת, שכבת הפחמן הנוספת מעלה את כמות אות הרקע באזורים המצולמים, ומציגה רעש שיכול לפגוע ברזולוציה הניתנת להשגה, במיוחד עבור דגימות קטנות (<150 kDa). בשנים האחרונות, השימוש בפתיתי תחמוצת גרפן (GO) לייצור יריעות תומכות על רשתות cryoEM הוכח כבעל יתרונות על פני פחמן אמורפי מסורתי. פתיתי GO מיוצרים באמצעות חמצון של שכבות גרפיט, וכתוצאה מכך יריעות פסאודו-גבישיות של גרפיט חד-שכבתי שהן הידרופיליות בשל תכולת החמצן המשמעותית שלהן בצורה של קבוצות קרבוקסיל, הידרוקסיל ואפוקסי על פני השטח והקצוות. פתיתי GO מסחריים במתלים מימיים אינם יקרים, וישנן שיטות רבות שפורסמו ליישום פתיתי GO על רשתות EM18,21. עם זאת, שיטות אלה גורמות לעתים קרובות לרשתות המכוסות רק חלקית בפתיתי GO, כמו גם אזורים המכילים שכבות מרובות של פתיתי GO. יתר על כן, פתיתי GO תורמים אות רקע בולט לתמונות cryoEM קרוב לזה שנצפה עם פחמן אמורפי דק22,23.
גרפן חד-שכבתי טהור, המורכב ממערך גבישי דו-ממדי יחיד של אטומי פחמן, נבדל מ-GO בכך שאינו מייצר ניגודיות פאזה במיקרוסקופ האלקטרונים. לפיכך ניתן להשתמש בגרפן חד-שכבתי ליצירת שכבת תמיכה בלתי נראית להדמיית דגימות ביולוגיות. גרפן חד-שכבתי הוא גם חזק יותר מ-GO וניתן ליישם אותו כשכבה חד-שכבתית יחידה ברשת EM, וההתקדמות האחרונה בייצור רשתות EM מצופות גרפן אפשרו להכין רשתות גרפן חד-שכבתיות בעלות כיסוי גבוה בתוך הבית 24,25,26,27,28,29,30. עם זאת, למרות היתרונות של שימוש ברשתות מצופות גרפן לקביעת מבנה cryoEM, הן אינן בשימוש נרחב בשל ההוצאה האוסרת של אפשרויות מסחריות והמורכבות של ייצור פנימי. במאמר זה אנו מתארים מדריך שלב אחר שלב לייצור יעיל של רשתות EM המכוסות בשכבה אחת של גרפן לצורך קביעת מבנה cryoEM של דגימות ביולוגיות (איור 1). על ידי ביצוע פרוטוקול מפורט זה, חוקרי cryoEM יכולים להכין באופן משכפל עשרות רשתות תמיכה גרפן באיכות גבוהה ביום אחד. ניתן לבחון בקלות את איכות הרשתות מצופות הגרפן באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים בהולכה נמוכה (TEM) המצויד בנימה LaB6.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>215589-500 גרם</td><td>מסוכן; היזהר מאוד</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>הידוק בלוק מחזיק רשת TEM עבור 45 רשתות</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>מאוורר מחשב</td><td>אמזון (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>תלושי כיסוי סטנדרטיים</td></tr><tr><td>צלחת התגבשות</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Electronics duster</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td> אבק <td>סיכות</td><td>סיכות N/A</td><td></td></tr><tr><td>ניירות סינון</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עם קצה עדין</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>סופרמרקט</td><td>מזלג</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פסטור זכוכית</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>גרפן / Cu</td><td>Graphenea</td><td>N / A</td><td>CVD חד שכבתי גרפן cu</td></tr><tr><td>שוקת</td> <td>ציפוי רשתלאד תעשיות מחקר</td><td>10840</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td> שביר <td>פישר סיינטיפיק</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>קלטת קפטון</td><td>אמזון (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>סרט פולימיד</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Long twzeer</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק רשת מתכת</td><td>טד פלה</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU חומרים מתקדמים</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>דליק</td></tr><tr><td>דגם 10 תנור מעבדה</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FO19013 צלחת פטרי</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td>מספריים <td>N / A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי אנלוגי סטנדרטי</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2 / 1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>רשתות זהב Holey</td></tr><tr><td>מערכות ניקוי אוזון אולטרה סגול</td><td>UVOCS</td><td>דגם T10X10 / OES</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לחקר המבנה האטומי של קומפלקסים מקרומולקולריים. הכנת דגימות עבור cryoEM דורשת שימור דגימות בשכבה דקה של קרח זגוגית, בדרך כלל תלוי בתוך החורים של סרט תמיכה fenestrated. עם זאת, כל גישות הכנת הדגימות הנפוצות למחקרי cryoEM חושפות את הדגימה לממשק אוויר-מים, ומציגות השפעה הידרופובית חזקה על הדגימה שלעתים קרובות גורמת לדנטורציה, צבירה ודיסוציאציה מורכבת. יתר על כן, אינטראקציות הידרופוביות מועדפות בין אזורי הדגימה לבין ממשק אוויר-מים משפיעות על הכיוונים שאומצו על ידי המקרומולקולות, וכתוצאה מכך שחזורים תלת-ממדיים עם רזולוציה כיוונית אנאיזוטרופית. 
ספיחה של דגימות cryoEM לשכבה אחת של גרפן הוכחה כמסייעת בהפחתת אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים תוך מזעור הכנסת רעשי רקע. תמיכת גרפן מציעה גם את היתרון של הורדה משמעותית של הריכוז הנדרש של חלבונים הדרושים להדמיית cryoEM. למרות היתרונות של תמיכות אלה, רשתות מצופות גרפן אינן בשימוש נרחב על ידי קהילת cryoEM בשל ההוצאות האוסרות של אפשרויות מסחריות והאתגרים הקשורים לייצור בקנה מידה גדול בתוך הבית. מאמר זה מתאר שיטה יעילה להכנת קבוצות של רשתות cryoEM בעלות כיסוי כמעט מלא של גרפן חד-שכבתי.

ביצוע מוצלח של פרוטוקול ייצור רשת הגרפן המתואר כאן יביא לרשתות EM המצופות במלואן בשכבה אחת של גרפן. ניתן לבדוק את כיסוי הגרפן של הרשתות באמצעות כל TEM. מאחר ששכבה אחת של גרפן נקי היא כמעט בלתי נראית ב-TEM, יש לבחון אותה באמצעות מצב העקיפה של המיקרוסקופ ולצפות בכתמי בראג המתאימים לארגון המשושה של אטומי הפחמן המרכיבים את הגרפן (איור 3A). זה נורמלי לראות מדי פעם כמה קמטים של גרפן חד-שכבתי, אשר מוצגים במהלך ציפוי MMA (איור 3B). אפשר גם לבדוק את רמת הזיהום הקיימת בגרפן על-ידי קבלת תמונת הגדלה גבוהה במרכז אחד החורים המכוסים בגרפן (איור 3C). אם היא נרכשת עם גלאי ברזולוציה גבוהה, התמרת פורייה של תמונה זו צריכה להכיל כתמי בראג המתאימים לריווח פחמן-פחמן ב-2.14 Å (איור 4C). שכבה אחת של אטומי פחמן אינה מייצרת מספיק פיזור אלקטרונים כדי ליצור ניגודיות פאזה, ולכן תמונה של גרפן נקי לא תציג טבעות תון הקשורות לפונקציית העברת הניגודיות בהתמרת פורייה של התמונה. אולם קשה מאוד למנוע זיהום של רשתות גרפן לאחר ייצורן, ושטיפה לא מספקת של רשתות EM או הסרת MMA לאחר ציפוי גרפן תגרום למזהמים בולטים על הרשתות שנראים בתמונות החלל האמיתי (איור 3C). כפי שניתן לראות באיור 4, לרשתות גרפן יש השפעה מרוכזת על דגימה, כפי שנצפה כאשר משווים 0.5 מ"ג/מ"ל של אפופריטין מוחל על רשתות זהב חוריות עם (איור 4A) וללא תמיכת הגרפן (איור 4B). פרוטוקולים דומים לייצור גרפן תוארו בעבר כדי לפתור מבני cryoEM של חלבונים כגון אפופריטין ברזולוציה גבוהה25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> איור 1: סכמה להכנת רשתות cryoEM מצופות גרפן. מתוארים שלבים מרכזיים בתהליך ייצור רשת הגרפן. קיצורים: cryoEM = מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני; MMA = מתיל מתקרילט; APS = אמוניום פרסולפט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> איור 2: החומרים הדרושים ליצירת רשתות גרפן. (A) החומרים הדרושים לציפוי רשתות cryo-EM מסומנים בהתאם. (B) מבט מקרוב על המעיל עם גיליון גרפן/Cu מודבק על נייר כתמים על שקופית זכוכית. ניתן להרכיב את מעיל הספין על ידי רכישת חלקים מחנות מחשבים / חומרי בניין מקומית. (C) מבט מקרוב על שוקת ציפוי הרשת המחוברת למזרק שניתן להשתמש בו כדי לשלוט במפלס המים. רשתות מונחות על גבי נייר ניקוי על רשת נירוסטה. נייר הניקוי מסייע בתמרון מיקום הרשתות כך שניתן יהיה להתאים אליו את יריעת הגרפן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> איור 3: תמונת תבנית עקיפה מייצגת ותמונות שדה בהירות של רשת גרפן המראות קמטים או זיהום MMA . (A) רשתות EM המכוסות בשכבה אחת של גרפן יראו פסגות בראג המתאימות לסריג המשושה של הגרפן כאשר הן מצולמות ב-TEM במצב עקיפה. פסגת בראג המתאימה לריווח פחמן-פחמן של 2.14 Å מוקפת ומסומנת בחץ. (B) תמונת שדה בהיר של רשת גרפן חד-שכבתית עם כמה קמטים (מסומנים בחץ) בחד-שכבה של גרפן. (C) תמונת שדה בהיר של גרפן חד-שכבתי עם זיהום MMA (מסומן בחץ). פסי קנה מידה = 100 ננומטר (B,C). קיצורים: EM = מיקרוסקופ אלקטרונים; MMA = מתיל מתקרילט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> איור 4: אפופריטין על רשתות זהב מכוסות גרפן: (A) מיקרוגרף CryoEM של 0.5 מ"ג/מ"ל אפופריטין על רשתות זהב מכוסות גרפן. (B) אפופריטין המצולם באותו ריכוז נראה בריכוז נמוך משמעותית כאשר מכינים אותו באמצעות רשתות זהב חוריות ללא גרפן. (C) FFT של מיקרוגרף cryoEM של 0.5 מ"ג/מ"ל אפופריטין על רשתות זהב מכוסות גרפן, כאשר פסגות בראג מתאימות לסריג הגרפן המשושה מסומן. פסי קנה מידה = 100 ננומטר (A,B). קיצורים: cryoEM = מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני; FFT = התמרת פורייה מהירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום שכבה אחת של גרפן על רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים וכיצד להכין אותם לשימוש בקביעת מבנה cryoEM.

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

כיום, שימור אופטימלי של דגימות ביולוגיות הוא אתגר גדול בהשגת מבני CryoEM ברזולוציה גבוהה. במהלך תהליך הכנת הדגימה, הדגימות נחשפות לממשק אוויר-מים הידרופובי, שיש לו השפעות דנטורינג על הדגימות ויכול לגרום לדגימות יציבות לאמץ אוריינטציה מועדפת בקרח, המונעת קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. ציפוי רשתות CryoEM בשכבה דקה של פחמן של תחמוצת גרפן רכה, שימש בדרך כלל לטיפול בבעיות הקשורות לאינטראקציות עם ממשק אוויר-מים.עם זאת, שכבות אלה מגבירות לעתים קרובות את רעשי הרקע בתמונות שלנו, אשר פוגעות ברזולוציות של המבנה שלנו. ציפוי הרשת בשכבה אחת של גרפן משיג הגנה דומה מבלי להכניס רעשי רקע משמעותיים. שימוש ברשתות CryoEM מצופות גרפן יכול לעזור להתגבר על בעיות הקשורות לאינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, עם זאת, רשתות גרפן מסחריות הן יקרות ומעבדות רבות רואות ברשתות גרפן מסובכות מדי להכנה פנימית.חוקרים בתחום CryoEM יכולים כעת להשתמש בפרוטוקול שלב אחר שלב זה כדי לשחזר עשרות גרפנים באיכות גבוהה המיוצרים במלואם ביום אחד.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להשתמש במכשיר נוירון microfluidic בלי מליטה פלזמה.

Non-Bonding פלזמה של PDMS עבור ייצור זולה של מכשירים microfluidic

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור סיבים אלקטרודות פחמן. אלקטרודות משמשות לאחר מכן כדי לזהות שחרור קטכולאמינים מתוך שלפוחית ​​עם amperometry סיבי פחמן.

המצאה של אלקטרודות Amperometric

ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש ב- Spotiton, מערכת רובוטית חדשנית, כדי לספק שתי דוגמאות של עניין על רשת ננו-חוטים עצמית המערבבת לפחות 90 אלפיות השנייה לפני vitrification בקריוגן נוזלי.

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

למדו לייצר רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון. שיטה זו מפחיתה רעש רקע ומשפרת את שימור הדגימות הביולוגיות בתהליך ההדמיה.

ייצור רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון

גלה סרטונים נוספים