Name: יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: חקור מנגנוני התחדשות רשתית בראשני Xenopus laevis. מחקר זה בוחן את תפקיד תאי Muller glia והדלקת עצבית בריפוי פגיעות רשתית, עם פוטנציאל לפיתוח טיפולים עתידיים למחלות ניווניות בעין האדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל- M.P. מהאגודה Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ו- UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) בשיתוף עם ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

יצירת ניוון רשתית כדי לחקור אסטרטגיות תיקון תאים בקסנופוס

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

יתרונות וחסרונות של פרדיגמות שונות של פגיעה ברשתית בראשנים של קסנופוס
פגיעה מכנית ברשתית פציעות כירורגיות שונות של הרשתית העצבית פותחו בראשנים של קסנופוס. הרשתית העצבית יכולה להיות מוסרת לחלוטין15,16 או נכרתה רק חלקית 16,17. הפגיעה המכנית המוצגת כאן אינה כרוכה בכריתת רשתית אלא ניקוב עין פשוט שפיתחנו בעבר בראשנים מסוג Xe...

מיליוני אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלות ניווניות שונות ברשתית המובילות לעיוורון, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). נכון להיום, מצבים אלה נותרו במידה רבה בלתי ניתנים לטיפול. הגישות הטיפוליות הנוכחיות הנמצאות בהערכה כוללות ריפוי גנטי, השתלות תאים או רקמות, טיפולים נוירופרוטקטיים, אופטוגנטיקה והתקנים תותבים. אסטרטגיה מתפתחת נוספת מבוססת על התחדשות עצמית באמצעות הפעלת תאים אנדוגניים בעלי פוטנציאל תאי גזע. תאי גליה מסוג מולר, סוג תאי הגליה העיקריים ברשתית, הם בין המקורות התאיים המעניינים בהקשר זה. לאחר פציעה, הם יכולים להתמיין, להתרבות, וליצור נוירונים 1,2,3. למרות שתהליך זה יעיל מאוד בדגי זברה או בקסנופוס, הוא אינו יעיל במידה רבה ביונקים.
עם זאת, הוכח כי טיפולים מתאימים עם חלבונים מיטוגניים או ביטוי יתר של גורמים שונים יכולים לגרום לכניסה מחודשת של מחזור תאי גליה של יונקים, ובמקרים מסוימים, לעורראת מחויבותם לנוירוגנזה 1,2,3,4,5. עם זאת, זה עדיין לא מספיק במידה רבה לטיפולים. לפיכך, הרחבת הידע שלנו על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתחדשות נחוצה כדי לזהות מולקולות המסוגלות להפוך ביעילות תכונות תאים דמויי גזע של מולר לאסטרטגיות טיפוליות תאיות חדשות.
במטרה זו, פיתחנו מספר פרדיגמות פציעה ב - Xenopus המעוררות ניוון תאי רשתית. כאן, אנו מציגים (1) פגיעה רשתית מכנית שאינה ספציפית לסוג התא, (2) מודל אבלציה מותנה והפיך של תאים באמצעות מערכת NTR-MTZ המכוונת לתאי מוט, (3) נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה המעורר ניוון מתקדם של תאי מוט, ו-(4) CoCl2-מודל ציטוטוקסי המושרה שעל פי המינון יכול להתמקד ספציפית בקונוסים או להוביל לניוון רחב יותר של תאי הרשתית. אנו מדגישים את הייחודיות, היתרונות והחסרונות של כל פרדיגמה.

<table><tbody><tr><td>1,2-פרופנדיול (פרופיל ואגרייב; ne glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט ו-GE; 99.8%</td> <td>כימיקלים VWR</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד קספאז 3 שסוע (ארנב)</td><td>איתות תאים</td><td>9661S</td><td>דילול 1/300</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP (עוף)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>דילול 1/500</td></tr><tr><td>נוגדן נגד M-Opsin (ארנב)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>דילול 1/500</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עכבר, Alexa Fluor 594 (עז)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>דילול 1/1,000</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Otx2 (ארנב)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>דילול 1/100</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 488 (עז)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>דילול 1/1,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 594 (עז)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>דילול 1/1,000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד התאוששות (ארנב)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>AB5585</td><td>דילול 1/500</td></tr><tr><td>נוגדן נגד רודופסין (עכבר)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MABN15</td><td>דילול 1/1,000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד S-Opsin (ארנב)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>AB5407</td><td>דילול 1/500</td></tr><tr><td>ערכת זיהוי אפופטוטיס (מערכת TUNEL פלואורמטרית ללא מוצא)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>בנזוקאין&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>פתרון מלאי 10%</td></tr> <tr><td>bisBenzimide H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>תמיסת מלאי 10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>בוטאנול-1 &ge; 99.5%</td> <td>כימיקלים VWR</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.02382</td><td>שימוש ב-0.1 מ'</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>קלארק זכוכית נימית דגם GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Device)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>קובלט (II) כלוריד הקסהידראט (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>תמיסת מלאי 100 מ"מ</td></tr><tr><td>Coverslip 24 x 60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab מדלל&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום סיבובי אלקטרוני</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אאוזין 1% אבחון</td><td>RAL</td> מימי <td>312740</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין ליזין דקסטרן&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>גליצרין אלבומין acc. Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>שימוש ב-3% במים</td></tr><tr><td>Hematoxylin (Mayer's Hemalun)</td> <td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מלח</td> <td>אשלגןSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי</td><td>MSD בריאות בעלי חיים</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>אידוי חומצה הידרוכלורית, 37% (HCl)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (SAFC)</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7880</td><td>שימוש ב-2% ב-0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4, 7H< תת>2O)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סופלקו)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>מטרונידזול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' (Supelco)</td><td>M3761</td><td>השתמש בקצות מיקרו-מטען של 10 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>5242956003</td><td></td>אפנדורף</tr><tr><td>(P-97 Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>דגם P-97</td><td>תוכנית: חום 700 / משיכה 100 / וול 75 / זמן 90 / לא נעול p = 500</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה לשימור פלואורסצנטיות, מגיב FluorSave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 להב Ultra Microtome</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>מחט Agani 25 G x 5/8''</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק סיכה מצופה ניקל</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>רקמת סינון ניילון (בד ניפוי) NITEX, פתח רשת 1,000 ומיקרו; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>שעוות היסטו-פרפין ללא DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד (32%)</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>EM-15714-S</td><td>שימוש ב-4% ב-1x PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>תבניות הטבעה חד פעמיות מתקלפות בכיוון</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ</td><td>קורנינג גוסלין</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 55 מ"מ</td><td>קורנינג גוסלין</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-הזרקה פיקו-שפריצר</td><td>מוצרי מכשור פארקר</td><td>פיקו שפריצר III</td><td></td></tr><tr><td>פינים&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>פוליסוכרוז (Ficoll PM 400)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>שימוש ב-3% ב-0.1x MBS</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>אבקת מזון מטוגן: sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp;</td><td>&nbsp; קניטל זכוכית</td><td>VS11171076FKA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי קונץ</td> <td>מחממי שקופיות</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט מלח טריסודיום דיהידראט (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>VWR כימיקלים</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד 30% תמיסה מימית (NaOH)</td><td>כימיקלים VWR</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים Omnifix-F מזרקים חד פעמיים סולו 1 מ"ל</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>crRNA טרנס-אקטיבי (tracrRNA)</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator</td><td>X-Cite&nbsp;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>קסילן &ge; 98.5%&nbsp;</td><td>כימיקלים VWR</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית הן הגורמים המובילים לעיוורון. בין אסטרטגיות טיפוליות רבות הנחקרות, גירוי תיקון עצמי התגלה לאחרונה כמושך במיוחד. מקור עניין תאי לתיקון רשתית הוא תא הגליה מולר, הטומן בחובו פוטנציאל תאי גזע ויכולת התחדשות יוצאת דופן באנמניוטים. עם זאת, פוטנציאל זה מוגבל מאוד ביונקים. חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הרשתית במודלים של בעלי חיים בעלי יכולות התחדשות אמור לספק תובנות כיצד לפתוח את היכולת הסמויה של תאי מולר של יונקים לחדש את הרשתית. זהו צעד מפתח לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית. לשם כך פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס: פגיעה מכנית ברשתית, קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז, מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ומודל ציטוטוקסי המונע על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות. הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם, אנו מתארים כאן סדרה זו של פרוטוקולים היוצרים מצבים ניווניים שונים ומאפשרים את המחקר של התחדשות הרשתית ב Xenopus.

פגיעה מכנית ברשתית קטעי רשתית של ראשנים הנתונים לפגיעה המכנית המתוארת בפרוטוקול סעיף 1 מראים שהנגע ברשתית מקיף את כל שכבות הרקמה תוך שהוא נשאר מוגבל לאתר הניקוב (איור 2A,B).
אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ העיניים של ראשנים טרנסגניים מורדמים Tg (rho:GFP-NTR) שטופלו בטיפול MTZ, כמתואר בסעיף 2 של פרוטוקול, נותחו תחת הסטריאומיקרוסקופ (איור 3A,B</stro...

פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

המעבדה שלי עובדת על התחדשות הרשתית. אנו משתמשים בצפרדע Xenopus כמערכת מודל. דו-חי זה אכן מרתק למדי מכיוון שבניגוד ליונקים, כמונו, הוא יכול לחדש את הרשתית שלו ביעילות רבה במקרה של פציעה.ואנו חוקרים את המנגנון הבסיסי מכיוון שבעתיד, זה יכול להיות שימושי כדי לעורר התחדשות רשתית בחולים אנושיים הסובלים ממחלות נוירודגנרטיביות ברשתית. לאחרונה גילינו כי בנוסף לתאי גזע בפריפריה של הרשתית ואפיתל פיגמנט ברשתית, ניתן לגייס גם תאי נוירוגליה להתחדשות הרשתית במקרה של פציעה. ולכן אנו חוקרים כעת את הקשרים בין דלקת עצבית לבין יכולת ההתחדשות של התאים האלה.ואכן, נראה כי הנישה הנוירו-דלקתית היא שחקן מפתח באפנון התחדשות הרשתית. כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים המעורבים בהתחדשות הרשתית, פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס. הראשון הוא פגיעה רשתית מכנית.השני הוא קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של פוטורצפטור בתיווך ניטרורדוקטאז. השלישי הוא מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ולסיום, מודל ציטוטוקסי המונע על ידי הזרקה תוך עינית של קובלט כלוריד או CoCl2. המעבדה המארחת שלי הראתה שלמרות שקסנופוס יכול לחדש את הרשתית שלו, היעילות משתנה מאוד ותלויה בשלבי הראשנים או במינים, Xenopus laevis או tropicalis.זה הופך את Xenopus למודל פנטסטי להמחשת המנגנונים המולקולריים המפעילים או מגבילים את התחדשות הרשתית.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

הסרטון מדגים שיטה לגידול תאי גנגליון רשתית ראשוניים מעוברי דגי זברה. עוברים בשלב מוקדם עוברים דיסקציה כדי לבודד את העיניים, אשר לאחר מכן מנותקים מכנית לתוך השעיה של תאי גנגליון הרשתית. תרחיף תאים זה מתורבת על גבי כיסויים המצופים בחלבוני דבק כדי להקל על התפתחות האקסון.

יצירת תרביות תאי גנגליון רשתית ראשוניים מעוברי דגי זברה

סרטון זה מדגים הליך לגרימת ניוון רשתית בדגי זברה בוגרים באמצעות פגיעה בלייזר. הלייזר מכוון לתאים קולטי אור ברשתית, וגורם למוות תאי ולתהליך ניווני. נזק זה מפעיל תאי גליה מולר (MG), מה שמוביל להתמיינותם לאבות תאי גזע המסייעים בהתחדשות הרשתית.

מידול ניוון והתחדשות הרשתית בדגי זברה באמצעות פגיעת לייזר מוקדית

פרוטוקולי נזק קלים מרובים כבר תאר לקולטני אור וכתוצאה מכך לנזק לגרום תגובת התחדשות רשתית בדג זברה מבוגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה משופרת, שניתן להשתמש בבעלי החיים פיגמנט ושפוגע ברוב המכריע של מוט וקולטני אור חרוט על פני כל הרשתית.

פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

חקור מנגנוני התחדשות רשתית בראשני Xenopus laevis. מחקר זה בוחן את תפקיד תאי Muller glia והדלקת עצבית בריפוי פגיעות רשתית, עם פוטנציאל לפיתוח טיפולים עתידיים למחלות ניווניות בעין האדם.

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

גלה סרטונים נוספים