Name: מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של Vivo ברקמת שומן חומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 55 s
Description: למד שיטות למטבולומיקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכברים. הפרוטוקול מאפשר חקר חילוף מטבוליטים מוביל על ידי רקמת שומן חום ותרומה להבנת מחלות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי מעבדות צ'וי ויונג על הדיון המתודולוגי. אנו מודים ל- C. Jang ו- D. Guertin על העצה והמשוב. אנו מודים למ.ס. צ'וי על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי NRF-2022R1C1C1012034 ל- S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 ל-D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 ל- S.M.J. ו- D.W.C. עבודה זו נתמכה על-ידי האוניברסיטה הלאומית צ'ונגנם עבור W.T.K. איור 1 ואיור 2 נוצרו באמצעות BioRender (http://biorender.com/).

כל הניסויים נערכו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סונגקיונקוואן (IACUC). עכברים שוכנו במתקן בעלי חיים שאושר על ידי IACUC הממוקם בחדר נקי שנקבע על 22 מעלות צלזיוס ו-45% לחות, לאחר מחזור יומי של 12 שעות אור/חושך. הם הוחזקו במדפים מאווררים והייתה להם גישה לדיאטת צ'או סטנדרטית (המורכבת מ-60% פחמימות, 16% חלבון ו-3% שומן). מצעים וחומרי קינון הוחלפו על בסיס שבועי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 12 שבועות ובמשקל שבין 25 גרם ל-30 גרם. בעלי חיים אלה הגיעו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. אפנון הפעילות המטבולית של רקמת השומן החום באמצעות אקלום טמפרטורה וגירוי תרופתי
הערה: אקלום טמפרטורה במשך מספר ימים עד שבועות או גירוי תרופתי באמצעות אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי הן שיטות נפוצות לוויסות פעילות BAT1. לכן, סקירה תמציתית של השיטה מובאת להלן כדי לאפשר לקוראים לבחור את הגישה המתאימה כנדרש. כדי לקבל BAT לא פעיל מטבולית (פחות תרמוגני), נבחרה טמפרטורת חום בסיסית, המכונה ניטרליות תרמית (28-30 מעלות צלזיוס), עבור עכברי C57BL/6J. טווח זה מבטיח שהעכברים לא יצטרכו להוציא אנרגיה נוספת כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה. כדי להשיג BAT מטבולית צנועה או פעילה מאוד (תרמוגנית), ניתן לבחור בטמפרטורות קור קל (20-22 מעלות צלזיוס) או קור חמור (6 מעלות צלזיוס), בהתאמה. לצורך ניסוי זה, עכברים גודלו בתנאי דיור סטנדרטיים של 22 מעלות צלזיוס, אשר, למרות קור קל עבור עכברים, לא היו כרוכים בגירויים פרמקולוגיים כלשהם.
<ol><li>התאקלמות טמפרטורה<ol><li>הפרידו את העכברים כדי לאכלס עכבר אחד או שניים בכל כלוב לפחות שבוע לפני תחילת אקלום הטמפרטורה. הכינו אינקובטורים למכרסמים המצוידים בבקרת אוורור, טמפרטורה ולחות בתנאים הרצויים.</li>
		<li>העבירו את הכלובים לאינקובטורים המתאימים למכרסמים בימים המתאימים לסוג ההסתגלות הנבחר לטמפרטורה.</li>
		<li>ודא שהתפלגות מספרי העכברים אחידה בכל הקבוצות, עם עכבר אחד או שניים בכל כלוב. דיור יחיד מועדף מכיוון שהוא רגיש יותר לשינויים פיזיולוגיים הנגרמים על ידי טמפרטורה בהשוואה לדיור קבוצתי43. להלן תנאי הדיור הספציפיים לכל קבוצה:<ol><li>קבוצת ניטרליות תרמית (30°C): שמרו על העכברים בקבוצה זו ברציפות בטמפרטורה של 30°C למשך עד ארבעה שבועות.</li>
			<li>קבוצת קור קשה: בתחילה, לשכן את העכברים בקבוצה זו ב 18 מעלות צלזיוס ללא כל חומרי קינון. הם יחוו ירידה הדרגתית בטמפרטורה השבועית, ויגיעו ל -6 °C (66 °F) בשבוע הרביעי. התקדמות הטמפרטורה היא כדלקמן: 18 °C → 14 °C (75 °F) → 10 °C (75 °F) → 6 °C (66 °F).</li>
			<li>קבוצת קור קלה (20-22 מעלות צלזיוס): מאכלסים את העכברים בקבוצה זו באינקובטורים של מכרסמים באותם תנאים כמו תנאי דיור סטנדרטיים שהוזכרו קודם לכן.</li>
			<li>אתגרי קור אקוטיים: לאתגרי קור אקוטיים, הניחו 1-2 עכברים בכל כלוב ללא חומרי קינון וחשפו אותם לאינקובטור מכרסמים בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך עד 8 שעות. הערה: תנאי דיור אלה ושינויי טמפרטורה חיוניים לחקר ההשפעות של סביבות טמפרטורה שונות על פעילות BAT וחילוף חומרים.</li>
		</ol></li>
		<li>החליפו כלובים וחדשו מזון ומים מדי שבוע. יש להקדים את הכלובים לפחות 24 שעות לפני נטילת התוסף, בטמפרטורה המתאימה להם (אינקובטור מכרסמים). הערה: כדי למנוע הפרעה של גירוי הטמפרטורה המתאים, חשוב לא לספק העשרה עכברית שעלולה להוביל לבניית קן. בתגובה לקור עז, עכברים מוציאים יותר אנרגיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, וכתוצאה מכך צריכת מזון מוגברת ושיעורי הפרשה גבוהים יותר. לכן, חשוב לבדוק את הכלובים לפחות פעמיים-שלוש בשבוע (בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות) כדי לוודא שלעכברים יש אספקה נאותה של מזון ומים ושהכלובים אינם רטובים יתר על המידה. ניטור זה חיוני לשמירה על רווחתם ובריאותם של העכברים במהלך המחקר.</li>
	</ol></li>
	<li>גירוי פרמקולוגי1 באמצעות אגוניסט לקולטן β3-אדרנרגי CL316,243<ol><li>כדי למקסם את אפקט הגירוי, מקמו את העכברים בטמפרטורה של ניטרליות תרמית (30°C) למשך 2-4 שבועות לפני הזרקות.</li>
		<li>לאחר תקופת ההתאקלמות, יש להזריק תוך צפקית 1 מ"ג/ק"ג CL316,243. הערה: עבור גירוי כרוני עם אגוניסט קולטן β3-adrenergic (למשל מ 3 ימים עד שבועות 1,44,45), זריקות יומיות נדרשות עקב יציבות התרופה. CL316,243 מדולל צריך להיות מוכן ביום ההזרקה עקב יציבות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. דגימת דם עורקית
הערה: עכברים מעל 12-14 שבועות מומלצים ביותר לדגימת דם עורקית. ייתכן שלעכברים צעירים יותר אין וורידים בגודל מספיק של זולצר, כלי דם נפרד המנקז באופן ספציפי דם ורידי מה-BAT46 הבין-סקפולרי.
<ol><li>מרדימים בעדינות באמצעות וופורייזר מכויל עם 3% איזופלורן לאינדוקציה (בתא בגודל 205 x 265 x 200 מ"מ) ו-2% איזופלורן לתחזוקה (עם מסכת הרדמה גז). הערה: יש לבצע את כל הליך דגימת הדם העורקי מיד לאחר ההרדמה. ניתן להשתמש בכרית חימום מחוממת במים במהלך ההרדמה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה. אזהרה: איזופלורן נדיף מאוד ורעיל בשאיפה. לכן, הרדמה ראשונית חייבת להתבצע תחת מכסה אדים.</li>
	<li>אמת את הרפלקסים של בעל החיים כגון נסיגת כפות כדי לוודא שההרדמה הגיעה לעומק מתאים.</li>
	<li>איסוף דם ורידי מווריד הזלצר<ol><li>מקם את העכבר כדי לחשוף את העור הגבי, לאשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן ממש לפני ביצוע החתך. יש להרטיב את העור הגבי עם אתנול בשפע של 70% כדי למנוע ניתוק שיער, ולבצע חתך לאורך הגב מהחלק התחתון של בית החזה עד הצוואר. הערה: העטלף הבין-סקפולרי ממוקם ממש מתחת לעור, ומורכב משתי רפידות שומן המכוסות ברקמות שומן לבנות דקות. חשוב לוודא כי העכבר נשאר תחת הרדמה באמצעות מסכת הרדמה גז.</li>
		<li>הרימו בעדינות את ה-BAT הבין-סקפולרי בעזרת מלקחיים מכופפים וחתכו בזהירות את הרקמות המצורפות, שרובן שרירים. הרימו את כרית השומן לכיוון הראש, המשיכו לחתוך את הרקמות המחוברות ופתחו בזהירות את האזור עד לחשיפת וריד הזולצר (כלי דם אדום כהה גדול בצורת 'Y' המחובר לשתי כריות השומן של עטלף בין-סקפולרי). הערה: היזהר לא לחתוך את כלי הדם הנימים של רקמות שריר הקשורים לאזור הקדמי והצידי של BAT interscapular, שכן פעולה זו תפחית באופן משמעותי את כמות ואיכות הדם המתנקז מווריד זולצר.</li>
		<li>בזהירות לחתוך את הווריד של Sulzer, ולאסוף כ 40 μL של דם באמצעות חתך תחתון 200 μL פיפטה קצוות פיפטה פיפטה P100. אחסנו את הדם בצינור איסוף דם ושמרו את הצינורית על קרח עד לתהליך איסוף הסרום. הערה: חשוב לאסוף דם ממש מתחת לנקודת החלוקה בצורת Y של וריד זולצר, כדי למנוע זיהום דם מהווריד הוורידי העליון קאווה47. איסוף יותר מדי דם יפחית את המאפיינים של הווריד של זולצר. לכן, הקפד לאסוף את כמות הדם המינימלית הדרושה מן הווריד של Sulzer לניתוח. היו מתחשבים בבחירת צינורות איסוף הדם, שכן סרום ופלזמה מניבים פרופילי מטבוליטים שונים 48,49,50. עבור אוסף פלזמה, יש צורך להשתמש צינורות מצופים הפרין. בניסוי זה נבחרו צינורות מצופים אקטיבטור קרישה לקבלת סרום. בשום פנים ואופן אין להשתמש בצינורות מצופים EDTA, מכיוון ש- EDTA משפיע באופן משמעותי על אותות ספקטרומטריית מסה51,52.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף דם עורקי מהחדר השמאלי<ol><li>הפוך את העכבר מבלי לאבד מגע עם חרוט האף, כדי לחשוף את העור הגחוני. יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן לפני ביצוע החתך. להרטיב את העור הגחוני עם כמות מספקת של 70% אתנול כדי למנוע ניתוק שיער, בזהירות לפתוח את חלל החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב מבלי לפגוע בכל מבנה פנימי.</li>
		<li>נקב במדויק את אזור הקודקוד של החדר השמאלי באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 29 גרם (1/2 אינץ'). הכניסו שני שלישים של מחט בגודל 1/2 אינץ' ל-3-5 מ"מ לרוחב הימני של קודקוד הלב (איור 1B), ומשכו את המזרק לאחור כדי לאסוף דם מהחדר השמאלי (50-100 מיקרוליטר). דם מהחדר השמאלי הוא דם עורקי מחומצן שהוא אדום בוהק. אחסנו את הדם בצינור איסוף דם, ושמרו את הצינורית על קרח עד לתהליך איסוף הסרום. הערה: יש לבצע חתך מינימלי בחלל החזה לצורך גישה ללב. חתך יתר עלול להוביל לדימום מקומי, אשר עלול לגרום לאחר מכן ללחץ דם נמוך. זה יכול להשפיע על איכות הדם העורקי שנאסף מהחדר השמאלי. הימנע סיבוב או היפוך הלב, כפי שהוא יקשה על קביעת המיקום המדויק של החדר השמאלי.</li>
		<li>לבצע המתת חסד ולהבטיח אותה בשיטה מתאימה בהתאם להנחיות המוסדות המקומיים. לדוגמה, המתת חסד יכולה להתבצע באמצעות פריקת צוואר הרחם ואושר על ידי הפסקת פעימות הלב.</li>
	</ol></li>
	<li>דגימות דם צנטריפוגטיות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה. הסופרנאטנט צריך להכיל סרום או פלזמה בהתאם לסוג צינור איסוף הדם בו משתמשים. אפשר לעצור כאן ולאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד עיבוד הסרום לניתוח GC-MS. הערה: ייתכן שהמוליזה התרחשה אם נצפית סופרנאטנט בצבע אדום. כדי למנוע המוליזה, מערבלים את הדגימה לפני השלמת הקרישה. חלק מהמטבוליטים המועשרים בכדוריות דם אדומות, כולל גלוטמין ולקטט, עלולים להוביל לפרשנות שגויה של נתונים, אם כי רוב המטבוליטים עשויים שלא להיות מושפעים באופן משמעותי מהמוליזה. מומלץ לנתח את הסרום/פלזמה תוך שבוע.</li>
</ol>3. מיצוי מטבוליטים מסרום ופירוק כימי
<ol><li>הכנה למיצוי הערה: כל השיטות, כולל מיצוי מטבוליטים, דה-ריווטציה וניתוח נתונים, הן גרסאות מעט שונות של שיטותשתוארו קודם לכן 53,54.<ol><li>הכן את מאגר המיצוי על ידי הוספת תמיסת 100 מיקרומטר של DL-norvaline, תקן פנימי (ראה טבלת חומרים), למתנול ברמת MS.</li>
		<li>ודא שכל הליכי הניסוי מתבצעים על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים 10 μL של נסיוב עכברים המופק מווריד הזולצר או מהחדר השמאלי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 40 μL של חיץ מיצוי.</li>
	<li>כדי להסיר פסולת תאים וחלבון, מערבל לזמן קצר את דגימות הסרום, ולאחר מכן את הצנטריפוגה במהירות מרבית (18,000 x גרם) במשך 30 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, מעבירים בזהירות 40 μL של supernatant לתוך בקבוקון זכוכית ואחריו 3 שעות של ייבוש בצנטריפוגת ואקום ב 4 ° C. הערה: מומלץ להוסיף זכוכית (ראה טבלת חומרים) במקום צינורות פלסטיק עקב כימיקלים תגובתיים מפלסטיק המשמשים לאורך שלב הפירוק הבא.</li>
	<li>יש להעביר את הדגימות המיובשות לשני שלבי דה-ריווטציה רצופים לצורך ניתוח GC-MS של המטבוליטים בסרום. הערה: יש לבצע את השלבים הבאים תחת מכסה אדים עקב סיכוני גירוי של הממסים.<ol><li>יש להשהות מחדש את תמציות הסרום המיובשות ב-30 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל מתוקסיאמין הידרוכלוריד (ראו טבלת חומרים) מומס בפירידין ולדגור עליו בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.</li>
		<li>נטרל דגימות עבור סילילציה של מטבוליטים עם 70 μL של N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoroacetamide (MTBSTFA, ראה טבלה של חומרים) ב 70 ° C במשך 1 שעות. הערה: מומלץ להשתמש במזרק זכוכית במקום בקצה פלסטיק בשלבים הבאים עקב ממיסי הפירוק המגיבים עם פלסטיק.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח מטבולומיקה באמצעות GC-MS
הערה: GC-MS מרובע יחיד (ראה טבלת חומרים) שימש למדידת המטבוליטים השונים בסרום, כולל פחמימות, חומצות אמינו ומתווכי מחזור TCA בדגימות שעברו דיבוע מווריד זולצר ומהחדר השמאלי. לחלופין, ניתן להשתמש בעמודות אחרות, אם כי הגדרות הניסוי כולל תוכנית הטמפרטורה עשויות להשתנות בהתאם לסוגי העמודות בהן נעשה שימוש.
<ol><li>הזריקו 1 μL של הדגימה המפורקת ל-GC במצב מפוצל ב-280°C (טמפרטורת כניסה), תוך שימוש בהליום כגז נשא עם קצב זרימה של 1,500 מ"ל/דקה (נקודה מוגדרת).</li>
	<li>הגדר את המרובע ב- 200 ° C עם ממשק GC-MS ב- 300 ° C. הערה: תוכנית התנור עבור כל ניתוחי המטבוליטים מתחילה ב 60 ° C, מוחזקת במשך דקה אחת, ולאחר מכן מוגברת בקצב של 10 ° C / min עד הטמפרטורה מגיעה 320 ° C.</li>
	<li>אסוף נתונים על ידי יינון אלקטרונים (EI) המוגדר על 70 eV וקבל את נתוני הדגימה במצב סריקה (50-550 m/z)53. כל המטבוליטים ששימשו במחקר זה אומתו בעבר עם תקנים לאישור ספקטרום מסה וזמני שמירה.</li>
	<li>בצע אינטגרציה של אזור שיא באמצעות תוכנת ניתוח זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>התאימו את התרכובות למכפלה של כל נגזרת TBMDS. לאחר מכן, השג את כרומטוגרמה יון החילוץ (EIC) על ידי שילוב ערך m/z של יון המקטע באזור השיא המתאים, ולאחר מכן יצא אותו. יוני שבר מוצגים בטבלה 1. הערה: ה-EIC של כל תרכובת נורמל על ידי זה של DL-norvaline בכל דגימה. הנתונים מיוצגים על ידי וריד Log2 Sulzer לחדר השמאלי (Log2(SV/LV)) באמצעות כל ערך EIC מנורמל.</li>
</ol>

חקר חילוף מטבוליטים ברקמת שומן חום

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לדווח עליהם.

צעד קריטי בהבנת הפוטנציאל המטבולי של BAT במאזן האנרגיה של כל הגוף הוא להגדיר אילו חומרים מזינים הוא צורך, כיצד הם מעובדים מטבולית, ואילו מטבוליטים משתחררים למחזור הדם. פרוטוקול זה מציג טכניקת דגימה עורקית מיוחדת המאפשרת גישה לכלי הדם הוורידיים של BAT בין-סקפולרי וכלי דם עורקיים מערכתיים בעכברי C57BL/6J, אשר פותחה ואומתה לאחרונה על ידי Park et al42. להלן נקודות מפתח שעליך לשקול באופן ביקורתי בעת ביצוע הפרוטוקול.
עבור גירוי תרמוגני, שיקול מרכזי הוא בחירת הסוג המתאים ביותר...

רקמת שומן חומה (BAT) היא בעלת תכונת הוצאת אנרגיה ייחודית הידועה בשם תרמוגנזה לא רועדת (NST), הכוללת הן את המנגנונים התלויים בחלבון 1 (UCP1) והן במנגנונים שאינם תלויים ב-UCP1 (UCP1) ו-UCP1 שאינםתלויים ב-UCP1 1,2,3,4,5. מאפיינים ייחודיים אלה משלבים BAT בוויסות חילוף החומרים המערכתי ובפתוגנזה של מחלות מטבוליות, כולל השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם וסרטן קכסיה 6,7,8. מחקרים רטרוספקטיביים אחרונים הראו קשר הפוך בין מסת BAT ו / או הפעילות המטבולית שלה עם השמנת יתר, היפרגליקמיה, ובריאות cardiometabolic בבני אדם 9,10,11.
לאחרונה, BAT הוצע ככיור מטבולי האחראי על שמירה על NST, מכיוון שהוא דורש כמויות משמעותיות של חומרים מזינים במחזור כמו דלק תרמוגני 6,7. יתר על כן, BAT יכול ליצור ולשחרר גורמים ביו-אקטיביים, המכונים אדיפוקינים חומים או BATokines, הפועלים כאותות אנדוקריניים ו / או פרקריניים, המצביעים על מעורבותו הפעילה בהומאוסטזיס מטבולי ברמת המערכת 12,13,14,15. לכן, הבנת חילוף החומרים התזונתי של באט אמורה לשפר את הבנתנו את משמעותו הפתופיזיולוגית בבני אדם, מעבר לתפקידו הקונבנציונלי כאיבר תרמו-רגולטורי.
מחקרים מטאבולומיים המשתמשים בעוקבי איזוטופים יציבים, בשילוב עם מחקרי ספיגת חומרים מזינים קלאסיים המשתמשים ברדיוטרייסרים שאינם ניתנים לחילוף חומרים, שיפרו באופן משמעותי את הבנתנו אילו חומרים מזינים נלקחים באופן מועדף על ידי BAT וכיצד הם מנוצלים 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27. לדוגמה, מחקרי נותב רדיואקטיבי הראו כי BAT המופעל בקור לוקח גלוקוז, חומצות שומן הקשורות לליפופרוטאין, וחומצות אמינו מסועפות שרשרת 16,17,18,19,20,21,22,23,27. מעקב איזוטופים עדכני בשילוב עם מחקרים מטבוליים אפשרו לנו למדוד את הגורל המטבולי והשטף של חומרים מזינים אלה בתוך רקמות ותאים בתרבית 24,25,26,28,29,30. עם זאת, ניתוחים אלה מתמקדים בעיקר בניצול אינדיבידואלי של חומרים מזינים, ומשאירים אותנו עם ידע מוגבל על התפקידים ברמת המערכות של BAT בחילוף מטבוליטים של איברים. שאלות לגבי הסדרה הספציפית של חומרים מזינים במחזור הדם הנצרכים על ידי BAT ותרומותיהם הכמותיות במונחים של פחמן וחנקן נותרו חמקמקות. בנוסף, המחקר האם BAT יכול לייצר ולשחרר BATokines שמקורם במטבוליטים (למשל, ליפוקינים) באמצעות חומרים מזינים רק מתחיל 12,13,14,15,31,32.
ניתוח דם עורקי הוא גישה פיזיולוגית קלאסית המשמשת להערכת ספיגה או שחרור ספציפיים של מולקולות במחזור הדם באיברים/רקמות. טכניקה זו יושמה בעבר על BAT interscapular של חולדות כדי למדוד חמצן וכמה מטבוליטים, ובכך ביסס BAT כאתר העיקרי של תרמוגנזה אדפטיבית עם הפוטנציאל הקטבולי שלה 33,34,35,36,37. לאחרונה, מחקר עורקי באמצעות BAT interscapular של חולדות שולב בשילוב עם גישה טרנס-אומיקס, מה שהוביל לזיהוי של BATokines שלא התגלו ששוחררו על ידי BAT38 מגורה תרמוגנית.
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסה מבוססת כרומטוגרפיית גז וכרומטוגרפיה נוזלית ברגישות גבוהה (GC-MS ו- LC-MS) הציתה מחדש את העניין במחקרים עורקיים לניתוח כמותי של חילופי מטבוליטים ספציפיים לאיברים 39,40,41. טכניקות אלה, עם כוח הרזולוציה הגבוה שלהן ודיוק המסה שלהן, מאפשרות ניתוח מקיף של מגוון רחב של מטבוליטים באמצעות כמויות מדגם קטנות.
בהתאם להתקדמות זו, מחקר שנערך לאחרונה התאים בהצלחה מטבולומיקה עורקית לחקר BAT ברמת העכבר, ואיפשר ניתוח כמותי של פעילויות חילופי מטבוליטים ב- BAT בתנאים שונים42. מאמר זה מציג פרוטוקול מטבולומיקה עורקית ממוקד BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר C57BL/6J.

<table><tbody><tr><td>0.5-20 ומיקרו; L טיפים מסננים</td><td>Axygen</td><td>AX. מזרק TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל עם מחט מחוברת - 26 גרם 5/8 אינץ'</td> <td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 5977B GC/MSD (גלאי סלקטיבי מסה)</td> <td>Agilent</td><td>G7077B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7693A דגימה אוטומטית</td><td>Agilent</td><td>G4513A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 8890 GC System</td><td>Agilent</td><td>G3542A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent J& עמודת W GC (עמודת קפילרי) HP-5MS UI Agilent</td><td></td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>תחנת עבודה Agilent MassHunter software_MS ניתוח כמותי (Quant-My-way)</td> <td>Agilent</td><td>G3335-90240</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J עכבר</td><td>DBL</td><td>C57BL / 6JBomTac</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -50 & deg; C מלכודת קרה (עם מכסה נירוסטה)</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7811041</tr><tr><td>DL-Norvaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7502-25G</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה של אפנדורף 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>תוספת זכוכית 250 &mu; L&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5181-1270</td><td></td></tr><tr><td>מתנול (בדרגת LC-MS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Q34966-1L</td><td></td></tr><tr><td>מתוקסיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>226904-5G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרובט&nbsp; 200 סרום, 200 ומיקרו; L, מכסה אדום, בסיס שטוח</td><td>Sarstedt</td><td>20.1290.100</td><td></td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>394882-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פירידין (נטול מים, 99.8%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270970-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מרכזי ואקום בקירור</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7310041 תזונת מכרסמים</td><td>בטוחה</td><td>בטוחה R+40-10</td><td></td></tr><tr><td>חממת מכרסמים</td><td>Power Scientific</td><td>RIT33SD</td><td></td></tr><tr><td>מחטי עט עדינות במיוחד - 29 גרם 1/2 אינץ'</td> <td>BD Biosciences</td><td>328203</td><td></td></tr><tr><td>כובע בקבוקון 9 מ"מ</td><td>Agilent</td><td>5190-9067</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון, ambr scrw wrtn 2 מ"ל</td><td>Agilent</td><td>5190-9063</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון, ambr scrw wrtn 2 מ"ל + A2: C40</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr></tbody></table>

מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של vivo ברקמת שומן חומה

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד מכריע בוויסות הומאוסטזיס מטבולי באמצעות תהליך ייחודי של הוצאת אנרגיה המכונה תרמוגנזה שאינה רועדת. כדי להשיג זאת, BAT משתמשת בתפריט מגוון של חומרים מזינים במחזור כדי לתמוך בביקוש המטבולי הגבוה שלה. בנוסף, BAT מפריש גורמים ביו-אקטיביים שמקורם במטבוליטים שיכולים לשמש כדלקים מטבוליים או מולקולות איתות, מה שמקל על תקשורת תוך-רקמתית ו/או בין-רקמתית בתיווך BAT. זה מצביע על כך ש- BAT משתתף באופן פעיל בחילופי מטבוליטים מערכתיים, תכונה מעניינת שמתחילה להיחקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור metabolomics arteriovenous BAT ממוטב ברמת עכבר in vivo . הפרוטוקול מתמקד בשיטות רלוונטיות לגירויים תרמוגניים ובטכניקת דגימת דם עורקית באמצעות וריד זולצר, המנקז באופן סלקטיבי דם ורידי בין-סקפולרי שמקורו ב-BAT ודם עורקי סיסטמי. לאחר מכן, מודגם פרוטוקול מטאבולומיקה מבוסס כרומטוגרפיית גז באמצעות דגימות דם אלה. השימוש בטכניקה זו אמור להרחיב את ההבנה של חילופי מטבוליטים מווסתים על ידי BAT ברמה הבין-איברית על ידי מדידת ספיגה נטו ושחרור של מטבוליטים על ידי BAT.

איור 1 מדגים את סכמת הניסוי של מטבולומיקה AV ממוטבת BAT. כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול, כדי להשיג רקמות שומן חום מגורה באופן דיפרנציאלי, עכברים עוברים אקלום טמפרטורה באמצעות אינקובטורים מכרסמים או מקבלים טיפול תרופתי כגון אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי. לאחר מכן, עכברים מורדמים, ודגימות דם נאספות לצורך ניתוח מטאבולומי (איור 1A). עבור דגימת דם, דם ורידי שמתנקז במיוחד מ-BAT בין-סקפולרי נאסף דרך הווריד של זולצר, בעוד שדם עורקי נאסף ישירות מהחדר השמאלי של הלב (<st...

בפרוטוקול זה מתוארות שיטות רלוונטיות למטבוליקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר. שיטות אלה מאפשרות רכישת תובנות יקרות ערך לגבי חילופי מטבוליטים בתיווך BAT ברמת האורגניזם.

מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של Vivo ברקמת שומן חומה

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

המעבדה שלנו מעוניינת לזהות מנגנונים שבאמצעותם מסלולי איתות ומסלולים מטבוליים משתפים פעולה כדי לווסת את חילוף החומרים של רקמת השומן ואת הפיזיולוגיה. ובאמצעות גישה זו, אנו שואפים למצוא דרך למנוע או להתמקד במחלות מטבוליות הנגרמות על ידי חוסר איזון אנרגטי כגון השמנת יתר וסוכרת. היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא שעברנו ממודל החולדות הקונבנציונלי לשימוש במודל עכברי לדגימת דם ורידי עורקים וניתוח מטבולי.אנו מאמינים כי מעבר זה יאפשר לנו לאמת את ממצאינו באמצעות מודלים גנטיים של תקן הזהב במהירות רבה יותר למחקר שומן חום.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

השיטה המוצגת כאן משתמשת 18 F-fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה / ממוחשבת (PET-CT) והדמיה שומן-מים מופרדים בתהודה מגנטית (MRI), כל שנסרקו הבא 2 חשיפה לשעת thermoneutral (24 ° C ) ותנאים קרים (17 מעלות צלזיוס) כדי למפות רקמת שומן חומה (BAT) בבני אדם בוגרים.

בסיס מיון רקמה האנושי בראון שומן בדיקה מחולק באופן אוטומטי על ידי פוזיטרון פליטת טומוגרפיה / טומוגרפיה ממוחשבת ורשום תמונות תהודה מגנטית

באמצעות תוכנה חופשית, קוד פתוח, פיתחנו גישה אנליטית לכמת פעילות חילוף החומרים של בת באמצעות 18F-FDG כן ונפח הכולל ואזוריים חום רקמת שומן...

כל הגוף ואת אזורי כימות של האדם פעיל חום רקמת שומן באמצעות 18F-FDG PET/CT...

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

הדמיה פונקציונלית וכמות של מחסני שומן תרמוגניים בעכברים באמצעות גישה מבוססת הדמיה מיקרו-PET /MR.

הדמיה וכימות של רקמות שומן חום ובז' בעכברים באמצעות [18F]FDG מיקרו-PET/MR הדמיה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל ואת היכולת החמצונית של אדיפוזיטים תרמוגניים בעכברים שמנים.

קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לכימות המשמעות הפיזיולוגית של השפעת פעילות רקמת השומן החום (BAT) על חילוף החומרים האנושי. זה מושג על ידי שילוב העמסת פחמימות וקלורימטריה עקיפה עם מדידות של שינויים supraclavicular בטמפרטורה. גישה חדשנית זו יכולה לסייע בפיתוח יעד פרמקולוגי לתרמוגנזה BAT בבני אדם.

שימוש בשילוב של קלורימטריה עקיפה, תרמוגרפיה אינפרא אדומה ורמות גלוקוז בדם כדי למדוד תרמוגנזה של רקמת שומן חום בבני אדם

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד, תרבית ופנוטיפ של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מרקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVECs). בנוסף, אנו מתארים מודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

חקר שיחות צולבות של תאי אנדותל שומן/אדיפוציטים ברקמת שומן תת-עורית אנושית

כתב יד זה מתאר כיצד למסך מוטציות thermostabilizing, לטהר את טרנספורטר הסרוטונין האדם, ליצור נוגדנים זיקה גבוהה, ולגבש במתחם טרנספורטר-נוגדן סרוטונין מאוגד -citalopram S תרופה נגד דיכאון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם המחקר של מובילי קרום מאתגר אחרים, קולטנים, ותעלות.

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

המטרה של הפרוטוקול היא להכין את hydrolysate קרטין מן נוצות העוף הידרוליזה אלקליין אנזימטיות, כדי לבדוק אם הוספת hydrolysate קראטין לתוך משחה קוסמטיקה הבסיס משפר את תפקוד מחסום העור (מגביה הידרציה ו צמצום איבוד המים transepidermal). הבדיקות נערכות על גברים ואישה מתנדבים.

הכנת קרטין Hydrolysate של נוצות העוף ויישומו בתחום הקוסמטיקה

למד שיטות למטבולומיקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכברים. הפרוטוקול מאפשר חקר חילוף מטבוליטים מוביל על ידי רקמת שומן חום ותרומה להבנת מחלות מטבוליות.

מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של Vivo ברקמת שומן חומה

גלה סרטונים נוספים