Name: אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: למד אופטימיזציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי להובלה אקסונלית של מטען אנדוגני ב-Caenorhabditis elegans חי. פרוטוקול זה משפר ויזואליזציה של חלבונים ציטופלזמיים ומאפשר מחקר מתקדם בתחום הנוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>שיפור ניתוח תחבורה אקסונלית ב- C. elegans חיים באמצעות RAB-3 המתויג GFP

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonal+cytoskeleton%3A+from+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axonal cytoskeleton: from organization to function.</a> Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).</li>
<li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+unseen%3A+the+hidden+world+of+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport.</a> Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).</li>
<li>Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+are+selectively+delivered+to+axons+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons.</a> Elife. 12, e82568(2023).</li>
<li>Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap%2C+a+toolkit+for+high-throughput+CRISPR%2FCas9+gene+modification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+to+analyze+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons.</a> J Vis Exp. (128), e56690(2017).</li>
<li>Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cgc.umn.edu/">https://cgc.umn.edu/</a> (2023).</li>
<li>Ghanta, K. S., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melting+dsDNA+donor+molecules+greatly+improves+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).</li>
<li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NATF+%28Native+and+Tissue-Specific+Fluorescence%29%3A+A+strategy+for+bright%2C+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+Project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Takihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Li, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+kinesin+UNC-104%2FKIF1A+is+a+key+regulator+of+synaptic+aging+and+insulin+signaling-regulated+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory.</a> Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).</li>
<li>Viancour, T. A., Kreiter, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+fast+axonal+transport+rates+in+young+and+old+rat+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons.</a> Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).</li>
<li>Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+in+axonal+transport+measured+by+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo.</a> Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).</li>
<li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Hall, D. H., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+posterior+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+serial+reconstruction+of+identified+neurons+and+complete+pattern+of+synaptic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions.</a> J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+ventral+nerve+cord+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-binding+protein+1+promotes+specific+motor-cargo+association+in+the+cell+body+prior+to+axonal+delivery+of+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles.</a> Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+homology-directed+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody>פתקי כיסוי <tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>(22 מ"מ x 22 מ"מ, No1); זכוכית כיסוי חותם זהב</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ: מיקרוסקופ הפוך Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, מצלמת Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA מטרת טבילת שמן, סורק פוטוסטימולציה של ניקון ב-488 ננומטר עם מסנן פליטה ET525/36</td><td>מיקרוסקופ</td><td></td> קונפוקלי דיסק מסתובב של ניקון <td></td></tr><tr><td>&nbsp; NIS-elements AR</td><td>תוכנת Nikon</td><td></td><td>עבור Nikon Ti2&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופיה רגילות מנוקות מראש</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Nematode strainIdentifier</td><td></td> <td>Source rab-3</td><td></td></tr><tr><td>(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>יופקד ב- CGC (https://cgc.umn.edu/)</td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב caenorhabditis elegans חי

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

סקירה כללית של מערכת המודל והליך המדידה כדי להמחיש הובלה אקסונלית של מבשרי שלפוחית סינפטית, עקבנו אחר GFP אנדוגני שכותרתו RAB-3. כאן אנו עושים שימוש בזן GFP שנוצר לאחרונה::Flip-on::RAB-3 זן6, שבו ביטוי של רקומבינאז פליפאז תחת מקדם ספציפי לתא (glr-4p) מתייג RAB-3 אנדוגני בנוירון המוטורי DA9. DA9 הוא תא עצב מוטורי דו-קוטבי, שגוף התא שלו ממוקם בחלק האחורי של החיה בצד הגחוני, קרוב לפי הטבעת (איור 1A). הוא מכיל דנדריט קצר העובר קדמית לאורך חוט העצב הגחוני ואקסון ארוך העובר אחורי, יוצר קומיסורה ולאחר מכן רץ קדמי לאורך חוט העצב הגבי, שם הוא יוצר סינפסות עוברות המעצבבות את השריר הגבי ואת נוירון VD 22,23,24. אנו מדמיינים תחבורה אקסונלית באזור האסינפטי; את רוב אירועי התחבורה ניתן לצלם באמצעות מישור מוקד יחיד (איור 1A). שלב ראשוני של הלבנת תמונות מיושם כדי להפחית את הרקע של שלפוחיות נייחות באזור הזה, שלעתים קרובות נוטות לעצור באזור הזה (איור 1B). סרטוני קיטועי זמן מוקלטים במשך 3 דקות, והאות RAB-3 לאורך האזור האסינפטי משורטט לתוך קימוגרף כדי לחלץ אירועי הובלה בודדים (איור 1C).
התאמת פרמטר הרכישה כדי למטב את התצוגה החזותית של תעבורה אקסונלית כדי להתגבר על עוצמת האות הנמוכה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים אנדוגניים, יש לייעל את פרמטרי הרכישה של המיקרוסקופ. לכימות חזק של אירועי תחבורה, עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים צריכה להיות בהירה ככל האפשר על רקע ציטופלזמי או מטען נייח מושהה. מבשרי שלפוחית סינפטית עוצרים לעתים קרובות באזור האסינפטי בבריכות שלפוחית נפרדות, מה שמפריע לזיהוי שלפוחיות נכנסות חדשות ומקשה על מעקב אחר עקבות ההובלה שלהן7.
שלב הלבנה פלואורסצנטי ראשוני יחיד יכול להפחית באופן משמעותי את האות הפלואורסצנטי הנובע מבריכות השלפוחיות כדי לשפר את זיהוי התנועה של שלפוחיות נכנסות חדשות (איור 2A). שלב ההלבנה שיפר רק במעט את האות של העברת בועיות RAB-3 מעל עוצמת הרקע הציטופלזמית, ככל הנראה מאחר שהחלק הציטופלזמי של RAB-3 נמוך מאוד (איור 2D).
השימוש בבינינג מספק שכבה נוספת לשיפור האות על רקע אירועי תעבורה בודדים על ידי שילוב מערך פיקסלים לפיקסל יחיד. בינינג של 2 x 2 יפחית בחצי את הרזולוציה המרחבית (כאן מ-108.33 ננומטר לפיקסל ל-216.7 ננומטר לפיקסל), וזה עדיין מספיק כדי לעקוב אחר חלקיקי הובלה בודדים של RAB-3 (איור 2B), אבל משפר מאוד את עוצמת האות של שלפוחיות בודדות (איור 2D). אלא אם כן נדרשת רזולוציה מרחבית גבוהה מאוד, ניתן להחיל כריכה גם כדי להמחיש מטענים אקסונליים רבים אחרים.
לאחר מכן, שאלנו כיצד שינויים בזמן החשיפה יכולים לשפר את עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים. כללנו במיוחד זמן חשיפה בניתוח כדי להראות גם שזמן חשיפה של עד 500 מילישניות עם 700 מילישניות בין נקודות זמן הדמיה עוקבות עדיין מספק רזולוציה טמפורלית שבה ניתן לעקוב אחר מבשרי שלפוחית סינפטית (איור 2C,D).
יצירה וניתוח קימוגרפים עם פיג'י כדי ליצור קימוגרף ולנתח אירועי הובלה בודדים לפי השלבים באיור 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של מערכת המודל כדי להמחיש הובלה אקסונלית של RAB-3 פלואורסצנטי אנדוגני. (A) פאנל עליון: סקירה כללית של הנמטודה עם ציר אחורי-קדמי וגחוני-גבי מסומן. תא העצב המוטורי DA9 מסומן בכחול. לוח אמצע: הגדלת התצוגה של האזור הארוז המוצג בלוח העליון עם מידור DA9 מצוין. סינפסות En passant מודגשות בירוק, * מציין את פי הטבעת. שימו לב שהאקסון ממשיך בחוט העצב הגבי עד שהוא עובר את הפות. התיבה האדומה מציינת את אזור האזור האסינפטי. פאנל תחתון: תמונת מיקרוסקופ קונפוקלי של GFP אנדוגני המסומן RAB-3 באקסון הפרוקסימלי במישור מוקד יחיד. שימו לב שישנם כיורי שלפוחית של RAB-3 משהה ארוך יותר באזור האסינפטי, אם כי רוב צבירי האותות של RAB-3 באזור הסינפטי. האזור האסינפטי מסומן באדום. קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של הקלטה בהילוך מהיר כדי להמחיש העברה אקסונלית. כדי לשפר את העקיבות של חלקיקי הובלה בודדים על פני חלקיקים נייחים, האזור האסינפטי מלבין בתחילה. לוחות תחתונים באזור הקופסה הסגולה מציגים דוגמה לאירוע תנועה של אנטרוגרד (ראש חץ כתום) ונסיגה (ראש חץ כחול). חלוניות מלמעלה למטה מייצגות נקודות זמן רצופות. (C) רישום קיטועי זמן ב-(B) שורטט כקימוגרף (ייצוג דו-ממדי של זמן על מיקום). קווים אלכסוניים מייצגים אירועי תנועה שבהם השיפוע מציין את המהירות. קווים אנכיים מציגים אירועים נייחים. תיבה סגולה היא התקרבות של הקימוגרף כדי להדגיש את אירועי ההובלה המוצגים גם ב- (B) ולעקוב אחר אירועי התחבורה האנטרוגרדיים (כתום) והנסיגה. קווים אנכיים מקווקווים מציינים את אירועי ההשהיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> איור 2: אופטימיזציה של שלבי רכישה ופרמטרים לשיפור ההדמיה של מטען אקסונלי אנדוגני. GFP אנדוגני::RAB-3 הודגמו באזור האסינפטי של אקסון DA9 וצילמו תמונות של מישור מוקד יחיד במיקרוסקופ דיסק מסתובב קונפוקלי. קימוגרפים נרכשו כדי להמחיש אירועי הובלה בודדים בכיוון אנטרוגרד (מימין לשמאל) ובכיוון נסיגה (משמאל לימין) (A-C). (A) קימוגרפים מראים אירועי הובלה של RAB3 ללא (קימוגרפים שמאליים) או עם שלב הלבנה משולב. שים לב ששלב ההלבנה משפר את התצוגה החזותית של אירועי השהיה (מסומנים על-ידי ראשי חצים צהובים) בין אירועי העברה עוקבים (ראשי חץ כתומים). (B) יישום כריכה של 2 x 2 מסייע לשפר את עוצמת האות של אירועי הובלה חלשה של RAB3. התמונות נרכשו בזמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה, ועם (C) עלייה מצטברת של זמן החשיפה (מ-100 מילישניות בקצה השמאלי ל-500 מילישניות בקצה הימני) מסייעת לשפר את עוצמת האות של אירועי תעבורה בודדים. התמונות נרכשו ב 2 x 2 binning ובאמצעות שלב photobleaching ראשוני. כל הקימוגרפים מציגים משך כולל של 3 דקות והם מצוירים באותו קנה מידה, כך שקימוגרפים עם פחות נקודות זמן רכישה עקב חלוף זמן ארוך יותר בין נקודות הדמיה עוקבות הם בעלי אורך כולל קצר יותר של הקימוגרף. (D) כימות עוצמת האות לאירוע תעבורה לאחר חיסור פלואורסצנטיות רקע מקימוגרפים ב-(A-C). שימו לב שהכריכה ושלב האקונומיקה נרכשו בזמן חשיפה של 300 מילישניות. השוואה סטטיסטית באמצעות n אירועים עבור 100 מילישניות (nאירועים = 27בn בעלי חיים = 2), 200 מילישניות (nאירועים = 30 ב- nבעלי חיים = 2), 300 מילישניות (nאירועים = 88 ב- nבעלי חיים = 6), 500 מילישניות (nאירועים = 12 ב- nבעלי חיים = 1), 300 מילישניות ללא (w.o.) בינינג (nאירועים = 31 ב- n בעלי חיים = 3), 300 מילישניות עם (w) בינינג (nאירועים = 88 ב- nבעלי חיים = 6) ו- 300 מילישניות , 2 x 2 כריכה עם הלבנה (nאירועים = 88בn בעלי חיים = 6) וללא הלבנה. כל נקודת נתונים מייצגת את עוצמת האות של אירוע תעבורה בודד של RAB-3 לאחר חיסור רקע (ציטופלסמה של האקסון) בנקודת זמן אחת לאורך העקבה שנבחרה באופן אקראי. זמן החשיפה הושווה באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס ואחריו ההשוואה המרובה של דאן, בינינג והלבנת תמונות הושוו באמצעות מבחן מאן-ויטני זוגי. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> איור 3: צעד אחר צעד כדי ליצור קימוגרף ולמדוד אירועי הובלה בודדים. (A) לאחר טעינת הקלטת הווידאו לפיג'י, כלי הקו המקוטע משמש למעקב אחר קו לאורך המקטע האקסונלי שעומד להיות מנותח. (B) קימוגרף (פאנל ימני) נוצר באמצעות תוסף Kymoreslicewide עם הפרמטרים המתוארים בחלונית השמאלית. (C) אירועי הובלה בודדים מאותרים באמצעות כלי הקו הליניארי ומאוחסנים אצל מנהל החזר ההשקעה. החלונית הימנית מציגה את קביעות המדידה המשמשות ליצירת טבלת התוצאות. (D) התוצאות בטבלה משמשות לחישוב פרמטר התעבורה. תיבות מציינות פרמטרים חשובים המתוארים בסעיף שיטות של הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

optimizing-visualization-axonal-transport-endogenous-cargo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

הובלה תוך-תאית של מטענים, כגון שלפוחיות או אברונים, מתבצעת על ידי חלבונים מוטוריים מולקולריים העוקבים אחר מיקרו-צינורות מקוטבים. פרוטוקול זה מתאר את המתאם בין כיווניות ההובלה של חלקיקי מטען בודדים הנעים בתוך נוירונים, לכמות היחסית והסוג של חלבונים מוטוריים קשורים.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיית מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות מרובות של C. elegans במהלך ההזדקנות.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

כאן אנו מספקים הוראות לשימוש יעיל ב-SegElegans, מערכת למידה עמוקה שפיתחנו לפילוח אוטומטי של תולעים בודדות בתמונות מיקרוסקופיה רחבות, לשימוש מאוחר יותר בתוכנות ניתוח תמונות כגון ImageJ. אנו מספקים דרכים להשתמש במערכת הן באופן מקוון והן באופן לא מקוון.

ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans

למד אופטימיזציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי להובלה אקסונלית של מטען אנדוגני ב-Caenorhabditis elegans חי. פרוטוקול זה משפר ויזואליזציה של חלבונים ציטופלזמיים ומאפשר מחקר מתקדם בתחום הנוירומדע.

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

גלה סרטונים נוספים