Name: גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: למדו לבנות וקטורי ביטוי גנים מורכבים ל-PRRSV בשיטת שיבוט חלקה. שיטה זו מאפשרת שילוב יעיל של מספר רב של קטעי DNA לתוך וקטור pVAX1 לחקר פונקציות גנים ויראליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי התמיכה הכספית של קרנות ייזום מחקר דוקטורט שסופקו על ידי אוניברסיטת סין מערב נורמלי (מס '20E059).

1. הכנת תבנית הגן PRRSV
<ol><li>הפשיר את מלאי הנגיף ב 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומערבבים היטב. דוגרים במשך 3 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה את התערובת במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 ° C. הערה: התערובת מחולקת לשלושה שלבים, כלומר, שלב מימי חסר צבע, שלב בין-פאזי ושלב פנול-כלורופורם אדום.</li>
	<li>מוציאים את הפאזה המימית חסרת הצבע החוצה ומעבירים אותה לצינור חדש.</li>
	<li>מערבבים היטב את הפאזה המימית עם 0.5 מ"ל איזופרופנול ודגרים במשך 10 דקות ב-4°C.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-12,000 × גרם ב-4°C. הערה: בתחתית הצינור יש משקע RNA לבן.</li>
	<li>השתמש micropipette כדי להשליך את supernatant של הצינור.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של אתנול 75% כדי להשעות מחדש את הגלולה ואת המערבולת לזמן קצר.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-7,500 × גרם ב-4°C. השתמש micropipette כדי להשליך את supernatant של הצינור.</li>
	<li>יבשו את הרנ"א למשך 5 דקות, הוסיפו 20-50 מיקרוליטר מים נטולי RNase כדי להשהות מחדש את הרנ"א, וערבבו היטב.</li>
	<li>המשך לביצוע תמלול הפוך; הגדר את התגובות לביצוע שעתוק לאחור כפי שמוצג בטבלה 1. הערה: כדי להבטיח שעתוק לאחור מוצלח, השתמש בתבניות RNA באיכות גבוהה.</li>
	<li>השתמש cDNA שנוצר עבור PCR או לאחסן אותו ב -20 ° C.</li>
</ol>2. עיצוב פריימר PCR
<ol><li>עיצוב הפריימר הקדמי<ol><li>פתח את התוכנה ובחר קובץ DNA חדש.</li>
		<li>הדבק את רצף הגנים PRRSV (GenBank: FJ548852.1) מ- NCBI לתוך התוכנה. לחץ על OK ליצירת קובצי הרצף.</li>
		<li>נתח את הרצף וסמן את צמתי השברים. עצבו את פריימר הרצף הספציפי קדימה של השברים. ברוב המקרים, טמפרטורת ההתכה העדיפה (Tm) היא בין 55 °C (55 °F) ל 62 °C (75 °F), ותכולת GC היא 40-60%.</li>
		<li>לחץ על פריימרים ובחר הוסף פריימר.</li>
		<li>הדבק את הרצף הספציפי והוסף רצפים חופפים של הווקטור לנוקלאוטיד 5' הראשון של פריימר הרצף הספציפי. ליד כל צומת, בחר 20-40 bp כדי לשמש כאזור החפיפה בין שני השברים הסמוכים.</li>
		<li>תן שם לפריימר הקדמי המכיל את התלויות ואת הרצף הספציפי (ראה איור משלים S1).</li>
		<li>לחץ על הוסף פריימר לתבנית.</li>
	</ol></li>
	<li>עיצוב פריימר הפוך<ol><li>נתח את הרצף וסמן את צמתי השבר בתוכנה. עצבו את פריימר הרצף הספציפי ההפוך של השברים.</li>
		<li>לחץ על פריימרים ובחר הוסף פריימר.</li>
		<li>הדבק את הרצף הספציפי והוסף את אתר ההגבלה לנוקלאוטיד 5' הראשון של פריימר הרצף הספציפי. הערה: אתרי ההגבלה שנוספו חייבים להיעדר מקטע ההוספה ומהווקטור, למעט אתרי השכפול המרובים.</li>
		<li>הוסף רצפים של 20-40 bp של וקטורים לנוקלאוטיד 5' הראשון של אתר ההגבלה.</li>
		<li>תן שם לפריימר ההפוך המכיל את התלויות ואת הרצף הספציפי (ראה איור משלים S1).</li>
		<li>לחץ על הוסף פריימר לתבנית.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR להגברת שברים
<ol><li>הגדר שש תגובות PCR נפרדות (טבלה 2): עבור מקטע 1, השתמש בפריימרים P1 ו- P2 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 2, השתמש בפריימרים P3 ו- P4 (ראה איור משלים S2); עבור מקטע 3, השתמש בפריימרים P5 ו- P6 (ראה איור משלים S2); עבור מקטע 4, השתמש בפריימרים P7 ו- P8 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 5, השתמש פריימרים P9 ו P10; והשתמשו בפריימרים P11 ו-P12 כדי להגביר את קטע 6 (ראו איור משלים S2). הערה: הפשרה, ערבב וצנטריפוגה קצרה כל רכיב לפני השימוש.</li>
	<li>הפעל את ה- PCR באמצעות פרוטוקול שלושת השלבים בטבלה 2.</li>
	<li>הוסף 1 μL של מאגר טעינת DNA 6x ל 5 μL של מוצר PCR, ערבב וצנטריפוגה קצרה את התכולה.</li>
	<li>נתח את הדגימות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.</li>
</ol>4. טיהור שברי PCR
הערה: טיהור מוצרי PCR מג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה טבלת חומרים) חשוב לבניית וקטור.
<ol><li>הוסף 9 μL של מאגר טעינת DNA 6x ל- 45 μL של מוצרי PCR, ערבב וצנטריפוגה קצרה את התכולה.</li>
	<li>בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז / גולדוויו 1% כדי להפריד את מקטעי ה- DNA. הערה: אין לעשות שימוש חוזר במאגר פועל TAE מכיוון שערך ה- pH שלו ישפיע על שחזור מקטע DNA.</li>
	<li>לאחר הפרדה נאותה של להקות, השתמש באזמל חד כדי להסיר בזהירות את רצועות ה- DNA. הערה: מזערו את גודל פרוסת הג'ל על ידי חיתוך עודפי אגרוז.</li>
	<li>שוקלים את פרוסת הג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל, מוסיפים נפח שווה של חיץ קשירה לפרוסת הג'ל (למשל, 0.3 מ"ל לפרוסה של 0.3 גרם), ודגרים בטמפרטורה של 60°C למשך 7 דקות.</li>
	<li>הכנס עמודה קטנה בצינור איסוף של 2 מ"ל. הוסף 700 μL של תמיסת DNA/agarose משלב 4.4 לעמודה הקטנה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 10,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.</li>
	<li>הוסף 300 μL של חיץ קישור וצנטריפוגה ב 13,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.</li>
	<li>הוסף 700 μL של חיץ כביסה וצנטריפוגה ב 13,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.</li>
	<li>סובב את העמודה הקטנה הריקה למשך 2 דקות במהירות מרבית כדי לייבש את מטריצת העמודות. מניחים את העמוד הקטן בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 20 μL של מים deionized ישירות למרכז קרום עמוד ולתת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות. צנטריפוגה במהירות של 13,000 × גרם למשך דקה.</li>
	<li>אחסן את ה- DNA ב -20 ° C.</li>
</ol>5. הכנת וקטור ליניארי
הערה: לאחר הכנת הפלסמיד, ניתן להשתמש באנזימים שנבחרו כדי לחתוך אותו. עיכול ארוך או עיכול אנזימי כפול חיוניים להבטחת העיכול של כל הדנ"א. זה יפחית את מספר השיבוטים החיוביים הכוזבים בניסויים הבאים.
<ol><li>ליניאריזציה של pVAX1
	<ol><li>הכינו את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר בסדר המצוין (טבלה 3). הערה: יש להוסיף את נפח המים כדי לשמור על נפח התגובה הכולל שצוין. כאן, 1 מיקרוגרם של פלסמיד התעכל עם אנזימים בתערובת התגובה. בהתאם לריכוז הפלסמיד, ניתן להתאים את נפח הפלסמיד בתערובת התגובה.</li>
		<li>מערבבים בעדינות; ואז לסובב למטה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום או בתרמוסטט מים למשך 60 דקות.</li>
		<li>בצע טיהור ג'ל בדומה לטיהור שברי PCR בסעיף 4 באמצעות ערכת מיצוי הג'ל (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>ליניאריזציה של pVAX1-F1 הערה: pVAX1-F1 הוא הווקטור המתקבל מהסבב הראשון של pVAX1 (NdeI ו-HindIII) ומקטע 1 מחדש. pVAX1-F2 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F1 (NdeI) ומקטע 2 רקומבינציה. pVAX1-F3 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F2 (NdeI) ומקטע 3 רקומבינציה. pVAX1-F4 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F3 (NdeI) ומקטע 4 רקומבינציה. pVAX1-F5 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F4 (EcoRV ו-NtoI) ומקטע 5 רקומבינציה.<ol><li>עבור כל וקטור, הכינו את תערובת התגובה בנפרד בטמפרטורת החדר בסדר המצוין (טבלה 3).</li>
		<li>מערבבים בעדינות; ואז לסובב למטה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום או בתרמוסטט מים למשך 60 דקות.</li>
		<li>בצע טיהור ג'ל בדומה לטיהור שברי PCR בסעיף 4 באמצעות ערכת מיצוי הג'ל (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
</ol>6. שיבוט לווקטור חדש
הערה: ניתן להשיג יעילות שיבוט טובה בעת שימוש ב- 50-200 ng של וקטור ותוספות.
<ol><li>הגדר את תגובת השכפול וההרכבה החלקה של ExonArt (טבלה 4). התאם את נפח התגובה הכולל ל- 10 μL באמצעות H2O מעוקר ומערבב.</li>
	<li>לדגור את התגובה thermocycler במשך 15-60 דקות ב 50 ° C. אחסנו את הדגימות על קרח. הערה: הארכת הדגירה עד 60 דקות עשויה לשפר את יעילות ההרכבה.</li>
	<li>הפשירו DH5α תאים בעלי כשירות כימית על קרח.</li>
	<li>להוסיף 10 μL של מוצר הרכבה לתאים המוסמכים; לאחר מכן, מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה.</li>
	<li>מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>יש לחמם ב-45°C למשך 45 שניות ולהעביר את הצינורות לקרח למשך 3 דקות.</li>
	<li>הוסף 900 μL של מדיום SOC לצינור.</li>
	<li>נערו את הצינור במהירות 225 סל"ד למשך שעה באינקובטור רעד בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>צנטריפוגה את תגובת הטרנספורמציה ב 6,000 × גרם במשך 2 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של תווך SOC טרי.</li>
	<li>פזרו את תרחיף התא שעבר טרנספורמציה על צלחת LB נפרדת עם קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	<li>לדגור על כל הצלחות למשך הלילה ב 37 ° C. בחר מושבות בודדות בודדות מכל צלחת ניסוי.</li>
</ol>7. ניתוח הטרנספורמטורים
<ol><li>בחר שמונה מושבות לתוך 20 μL של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin.</li>
	<li>הגדר את תגובת ה-PCR של המושבה והפעל את ה-PCR (טבלה 5). הערה: עבור תגובת PCR של המושבה עבור קטע 1, השתמש בפריימרים P1 ו- P2 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 2, השתמש בפריימרים P3 ו- P4 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 3, השתמש בפריימרים P5 ו- P6 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 4, השתמש בפריימרים P7 ו- P8 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 5, השתמש פריימרים P9 ו P10; והשתמשו בפריימרים P11 ו-P12 כדי לזהות את מקטע 6 (ראו איור משלים S2).</li>
	<li>הוסף 1 μL של 6x מאגר טעינת DNA ל 5 μL של מוצר PCR, לערבב, ו צנטריפוגה קצרה את התוכן.</li>
	<li>נתח את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.</li>
	<li>בחר מושבה חיובית אחת לתוך 5 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ולגדול בן לילה ב 37 ° C.</li>
	<li>יש להשיג את הפלסמיד באמצעות ערכת מיני פלסמיד DNA (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>דמיינו את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.</li>
</ol>

שיבוט הגן PRRSV באורך מלא בווקטור הביטוי pVAX1

<ol><li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5(2008).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li>
<li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li>
<li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+fusion%3A+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li>
<li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li>
<li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome%3A+Impact+of+vaccination+effectiveness%2C+vaccine+price%2C+and+vaccination+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500(2020).</li>
<li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45(2012).</li>
<li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+%28PRRS%29+virus+isolated+from+field+cases+of+%26%2334%3Batypical%26%2334+PRRS%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &#34;atypical&#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+control+PRRS%3A+a+summary+of+field+and+research+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li>
<li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines%3A+Current+status+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li>
<li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%2C+a+member+of+the+arterivirus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li>
<li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+PRRS+virus+genome%3A+Updates+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li>
<li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms%3A+Based+on+cost+and+revenue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).</li>
<li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li>
<li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112%2C+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410(2011).</li>
<li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%3A+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

טכניקת ההרכבה של גיבסון (באנגלית: Gibson assembly technique) היא שיטת שיבוט מולקולרי מבוססת רקומבינציה חוץ גופית להרכבת מקטעי DNA8. שיטה זו מאפשרת הרכבה של מקטעי דנ"א מרובים לפלסמיד מעגלי בתגובה איזותרמית של צינור יחיד. עם זאת, אחד המכשולים לטכניקת הרכבת גיבסון הוא רכישת מקטעים ארוכים מ-cDNA. קשה להגביר במדויק את השברים הארוכים מסיבות רבות. לדוגמה, קל יותר לטעות בפריימרים במהלך תקופות הארכה ארוכות, cDNA עשוי שלא להיות באיכות טובה, או שאזורים עשירים ב-GC יפסיקו את פילמור ה-DNA. כאשר לא ניתן להשיג בקלות את המקטע באורך מלא מ- cDNA באמצעות PCR, יש לחלק את המקטע באורך מלא למספר מקטעים לצורך הגברה. עם זאת, ככל שמספרם ואורכם של מקטעי הדנ"א המוחדרים יגדלו, היעילות והשיבוטים החיוביים מבדיקת הרקומבינציה ההומולוגית יפחתו גם הם באופן משמעותי. לכן, ניסינו פתרון חלופי על ידי הכנסת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. לאחר מכן, נוכל להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר את מקטעי הדנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית ולחסל את אתרי ההגבלה הלא רצויים באמצעות תגובת הרקומבינציה ההומולוגית.
כאחד הפתוגנים המשמעותיים ביותר מבחינה כלכלית בשווקים העולמיים, PRRSV תמיד משך את תשומת הלב של החוקרים במהלך 30 השנים האחרונות 10,21,22. זהו נגיף RNA חיובי, שאורכו כ-15 קילו-בתים, ולא ניתן להגדיל בקלות את מקטע הדנ"א הארוך מ-cDNA. לכן, כדי לחקור אם שיטה זו יכולה לשמש לשיבוט של מקטעים ארוכים, השתמשנו ב-PRRSV כתבנית לשיבוט גנום באורך מלא. במחקר זה, חילקנו את הרצף באורך מלא לשישה מקטעים והוספנו אתרי הגבלה מתאימים לפריימר ההפוך, וקיבלנו שישה מקטעים באמצעות PCR. לאחר מכן השגנו בהצלחה את וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV באורך מלא על ידי מספר סבבים של תגובות רקומבינציה. בנוסף, וקטור הביטוי PRRSV הבנוי יכול לשמש כתבנית לשעתוק חוץ גופי להשגת RNA מוגבל למחקר טרנספקציה או חיסון mRNA. בינתיים, פלסמיד וירוס mRNA שנבנה יכול לשמש לבדיקת אצווה של תרכובות טבעיות אנטי ויראליות במבחנה באמצעות טכניקות אינטראקציה מולקולרית, כגון תהודה פלסמון פני השטח23,24. פלסמיד pVAX1 עומד בדרישות מכיוון שבדיקת שעתוק חוץ גופית דורשת פלסמיד בעל העתקה גבוהה עם מקדם T7. חוץ מזה, פלסמיד pVAX1-PRRSV המכיל את מקדם CMV יכול להיות מועבר לתוך BHK-21cells עבור ביטוי גנום ויראלי25,26.
לסיכום, באמצעות פרוטוקול זה, אנו מראים כי ניתן לחלק גנים ארוכים באורך מלא למספר מקטעים המתקבלים על ידי הגברת PCR. חשוב שהפריימרים ההפוכים יוכנסו לאתרי ההגבלה המתאימים, כך שניתן יהיה לקבל את וקטור ביטוי הגן באורך מלא על ידי מספר סבבים של תגובות רקומבינציה. שיטה זו יכולה לשמש עבור גנים באורך מלא שלא ניתן להשיג ישירות על ידי PCR יחיד או עבור גנים באורך מלא שלא ניתן להשיג על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות. לפיכך, גישה זו היא תוספת חשובה לטכניקת הרכבת גיבסון, אנו צופים כי ניתן יהיה להשתמש בה באופן נרחב לשיבוט של מקטעי DNA ארוכים ובניית גני היתוך.

כטכניקה חיונית לבניית כלים ניסיוניים מבוססי דנ"א לביטוי בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים, שיבוט מולקולרי הוא מרכיב חשוב מאוד בביולוגיה הניסויית. שיבוט מולקולרי כרוך בארבעה תהליכים: רכישת DNA מוחדר, קשירת האינסרט לווקטור המתאים, טרנספורמציה של הווקטור הרקומביננטי ל- Escherichia coli (E. coli), וזיהוי השיבוטים החיוביים1. עד כה אומצו שיטות רבות לצירוף מולקולות DNA באמצעות אנזימי הגבלה 2,3 ורקומבינציה בתיווך PCR 4,5,6. רקומבינציה הומולוגית, הידועה בשם טכנולוגיית שיבוט חלק, היא קבוצת שיטות שיבוט, המאפשרת החדרה בלתי תלויה ברצף וללא צלקת של מקטע DNA אחד או יותר לתוך וקטור. טכנולוגיה זו כוללת שיבוט בלתי תלוי ברצף וקשירה (SLIC), תמצית שיבוט קשירה חלקה (SLiCE), In-Fusion והרכבת גיבסון. הוא משתמש באקסונוקלאז כדי לפרק גדיל אחד של האינסרט ובווקטור כדי ליצור קצוות מלוכדים, או תיקון in vivo או רקומבינציה במבחנה כדי לצרף באופן קוולנטי את התוספת לווקטור על ידי יצירת קשרי פוספודיסטר. היכולת לחבר תוספת בודדת לווקטור בכל רצף ללא צלקות מושכת מאוד. יתר על כן, לטכנולוגיה יש את היכולת לחבר 5-10 שברים בסדר קבוע מראש ללא מגבלות רצף.
כאחת מטכניקות דנ"א רקומביננטיות רבות, טכניקת הרכבת גיבסון, כיום שיטת השיבוטהיעילה ביותר 7,8, היא שיטה חזקה ואלגנטית מבוססת אקסונוקלאז להרכבת מקטע DNA ליניארי אחד או יותר בצורה חלקה. תגובת הרכבת גיבסון מבוצעת בתנאים איזותרמיים באמצעות תערובת של שלושה אנזימים, כלומר אקסונוקלאז 5', פולימראז בנאמנות גבוהה וליגאז DNA תרמויציב. תעלות חד-גדיליות 3' שנוצרו על ידי אקסונוקלאז 5'-3' תורמות לחישול של שברים בעלי משלימות בקצה אחד. הפולימראז בעל הנאמנות הגבוהה ממלא ביעילות את הפערים באזורים החד-גדיליים המחושלים על ידי הוספת dNTPs, וליגאז הדנ"א התרמו-יציב אוטם את הניקים ליצירת מולקולות DNA משותפות8. לפיכך, שיטה טכנית זו כבר בשימוש נרחב לבניית וקטורים ביטוי גנים.
תסמונת הרבייה והנשימה של חזירים (PRRS) היא מחלה נגיפית המובילה לפגיעה במערכת הרבייה וכשל נשימתי בחזירים הנגרמת על ידי PRRSV בכל גיל9. התסמונת מתבטאת בחום, אנורקסיה, דלקת ריאות, עייפות, דיכאון ומצוקה נשימתית. יתר על כן, סימנים קליניים, כולל שינוי צבע אדום / כחול של האוזניים, נצפו בכמה מגיפות. כחבר בנגיף העורקים המשפחתי, PRRSV מועבר באופן נרחב למדינות המייצרות בשר חזיר על ידי מגע ישיר והחלפת נוזלים, כולל שתן, קולוסטרום ורוק. בשל התפשטות PRRSV בארצות הברית, סך ההפסדים הכלכליים של תעשיית בשר החזיר הוערך בכ -664 מיליון דולר בשנה, בהתבסס על היקף הרבייה של 5.8 מיליון זורעים ו -110 מיליון חזירים 10,11. דו"ח השירות לפיקוח על בריאות בעלי חיים וצמחים מראה כי 49.8% מהחזירים הלא מחוסנים מראים נוכחות של PRRSV בסרום12 ורמות נמוכות של PRRSV בחזירים נגועים מופרשות דרך רוק, הפרשות מהאף, שתן וצואה13. אסטרטגיות מרובות יושמו כדי לשלוט בהתפשטות PRRSV 14,15,16. בנוסף להליכי חיסול ליצירת אוכלוסיות שליליות לחלוטין לנגיף או שיפור הבטיחות הביולוגית והניהול, מתן חיסונים הוא אמצעי יעיל לשליטה ב- PRRS.
PRRSV הוא נגיף RNA עטוף, חד-גדילי, בעל חוש חיובי באורך של כ-15 קילו-בסיסים (kb). גנום PRRSV מורכב מלפחות 10 מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), אזור קצר 5' לא מתורגם (5' UTR), וזנב פולי(A) במסוף 3' (איור 1A)17. הגנום של נגיף RNA בעל גדיל שלילי אינו מדבק ואילו הגנום של נגיפי RNA בעלי גדיל חיובי הוא מדבק. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות עבור RNA ו DNA transfection ליצירת צאצאים וירוס18. עם זאת, שיבוט המקטע באורך מלא המתאים לגנום הרנ"א הוא חיוני לבניית שיבוטים זיהומיים. בשל אופיו הארוך והמורכב של גנום PRRSV, לא ניתן להשיג בקלות את הגנום באורך מלא באמצעות PCR בבת אחת. בנוסף, למרות שהסינתזה המלאכותית של גנים PRRSV היא פתרון יעיל, סינתזה של מקטעים ארוכים היא לעתים קרובות יקרה. לפיכך, כדי לקבל את וקטור הביטוי באורך מלא PRRSV, ניסינו ליצור אותו על ידי שיטת הרקומבינציה ההומולוגית19,20 של הוספות מרובות. למרבה הצער, לא הצלחנו להשיג את וקטור ביטוי הגנים באורך מלא. לכן, במחקר זה, הוספנו אתרי הגבלה מתאימים לפריימר ההפוך והשגנו בהצלחה את וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי מספר סבבים של תגובות רקומבינציה הומולוגיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה גם להשיג מחיקה או מוטציה של גני המטרה ולצרף ביעילות מספר רב של מקטעי DNA לווקטור הביטוי.

<table><tbody><tr><td>1 kb פלוס DNA סולם</td><td>טיאנגן ביוכימיה טכנולוגיה (בייג'ינג) ושות', בע"מ</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x אוניברסלי ירוק PCR מאסטר מיקס</td><td>רונג ווי גן ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>ספסל מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>ספסל נקי</td><td>Sujing Antai אוויר טכנולוגיה&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>DNA אלקטרופורזה ציוד</td><td>Cleaver Scientific&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>DNA טעינת מאגר (6x)</td> <td>Biosharp ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. ערכת מיני DNA פלסמיד I</td><td>אומגה ביו-טק ושות', בע"מ</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>מטפח טמפרטורת עמידה לחימום אלקטרו</td><td>שנחאי Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>ExonArt ערכת שיבוט והרכבה חלקה</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix עם dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td> <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>תרמו פישר Scientific&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל Doc XR</td><td>ביו-ראד מעבדות ושות', בע"מ</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview חומצת גרעין ג'ל כתם</td><td>שנחאי Yubo ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr><tr><td>מכונת יצרנית קרח</td><td>שנחאי Bilang מכשיר ייצור ושות', בע"מ</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen פלטינום SuperFi II DNA פולימראז</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר צלחת (קנמיצין)</td> <td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB מדיום נוזלי סטרילי (Kanamycin)</td> <td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטורים</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td>Panasonic Electric (סין) ושות', בע"מ</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>שייקרים אורביטליים</td><td>שנחאי Zhicheng מכשירים אנליטיים ייצור ושות', בע"מ</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>וירוס PRRSV</td><td>האוניברסיטה החקלאית של סצ'ואן</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>לעיצוב פריימרים</td></tr><tr><td>T100 PCR שיפוע Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp; Co., Ltd</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol ריאגנט</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp; ושות', בע"מ</td><td>15596026</td><td>מגיב מיצוי RNA</td></tr></tbody></table>

גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

בניית וקטורים של ביטוי גנים היא מרכיב חשוב בעבודת מעבדה בביולוגיה ניסויית. עם פיתוחים טכניים כמו Gibson Assembly, הבנייה הווקטורית הופכת לפשוטה ויעילה יחסית. עם זאת, כאשר הגנום באורך מלא של וירוס הרבייה והנשימה החזירי (PRRSV) אינו יכול להיות מוגבר בקלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז יחידה (PCR) מ- cDNA, או שקשה לרכוש וקטור ביטוי גנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות במבחנה, טכניקת הרכבת גיבסון הנוכחית אינה מצליחה להשיג מטרה זו.
כתוצאה מכך, מטרתנו הייתה לחלק את גנום PRRSV למספר מקטעים ולהכניס אתרי הגבלה מתאימים לתוך הפריימר ההפוך לקבלת מקטעים מוגברים PCR. לאחר חיבור מקטע הדנ"א הקודם לווקטור על ידי טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית, הווקטור החדש רכש את אתר המחשוף של אנזים ההגבלה. לפיכך, אנו יכולים ליצור ליניאריזציה של הווקטור באמצעות אתר מחשוף האנזים החדש שנוסף ולהציג את מקטע הדנ"א הבא במורד הזרם של מקטע הדנ"א במעלה הזרם.
אתר המחשוף של אנזים ההגבלה שהוכנס בקצה 3' של מקטע הדנ"א במעלה הזרם יבוטל, ואתר מחשוף חדש יוכנס לקצה 3' של מקטע הדנ"א במורד הזרם. בדרך זו אנו יכולים לחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה. שיטה זו ישימה לבנייה מוצלחת של וקטור ביטוי PRRSV והיא שיטה יעילה להרכבת מספר רב של שברים לווקטור הביטוי.

במאמר זה אנו מציגים מערכת רקומבינציה במבחנה להרכבה ותיקון של מולקולות דנ"א חופפות באמצעות פריימר הפוך באמצעות אתרי הגבלה שמוצגים ללא הרף (איור 1B). מערכת זו היא הליך פשוט ויעיל הכולל את הכנת הווקטור הליניארי ואת קטעי ההוספה המכילים שלוחות שהוכנסו על ידי PCR עם פריימרים בעלי רצפי הרחבה מתאימים של 5 אינץ' ואתרי הגבלה; תגובה איזותרמית יחידה במבחנה וטרנספורמציה כימית סטנדרטית של מוצרי רקומבינציה לחיידקים מארחים מתאימים; ובחירת מושבה חיובית וקבלת הווקטור הרקומביננטי לסבב השיבוט הבא. לקבלת וקטור pVAX1-PRRSV שלב אחר שלב, יש להיעדר אתרי הגבלה מההוספות ומאתרי השיבוט המרובים של הווקטור הרקומביננטי.
מאחר שקשה להשיג רצפי גנים מורכבים באורך מלא עם PCR יחיד, ניתן היה להגביר מקטעים של PRRSV רק באמצעות שש תגובות PCR (איור 1C). במהלך הסבב הראשון של הרקומבינציה, קטע 1 של PRRSV הוכנס בהצלחה לווקטור pVAX1, והפלסמיד הרקומביננטי החדש עם אתרי ההגבלה שהוכנסו (NheI, אתר פיצול אנזים יחיד) נקרא pVAX1-F1 (איור 1D). בסבב השני של הרקומבינציה, וקטור pVAX1-F1 עבר ליניאריזציה עם אנזים ההגבלה NheI. מקטע 2 הוכנס בהצלחה לווקטור pVAX1-F1, והניב פלסמיד רקומביננטי pVAX1-F2 עם אתרי הגבלה (NheI, אתר מחשוף אנזימי יחיד) (איור 1D). עבור הסבב השלישי של רקומבינציה, כפי שניתן לראות באיור 1D, קטע 3 הוכנס בהצלחה לווקטור pVAX1-F2 כדי לקבל pVAX1-F3 עם אתרי הגבלה (NheI, אתר מחשוף אנזים יחיד). בסבב הרביעי של הרקומבינציה, השגנו את וקטור pVAX1-F4 על ידי החדרת מקטע 4 עם אתרי הגבלה EcoRV (אתר מחשוף אנזים יחיד). לאחר מכן, וקטור pVAX1-F4 עבר ליניאריזציה על ידי אנזים ההגבלה EcoRV ולא I. מקטע 5 שובט לווקטור pVAX1-F4 כדי לקבל pVAX1-F5 עם אתרי הגבלה (NotI, אתר פיצול אנזים יחיד). לאחר הסבב האחרון של רקומבינציה, וקטור ביטוי יתר באורך מלא של PRRSV (pVAX1-PRRSV) התקבל בהצלחה (קובץ משלים 1). כפי שמודגם באיור 1D, הפלסמיד הרקומביננטי החדש נעשה גדול יותר ויותר עם הצגה מתמשכת של שברים. לפיכך, תוצאות אלה הצביעו על כך שהשילוב של הוספת אתרי הגבלה מתאימים ושימוש בטכניקת הרכבת גיבסון יכול להשיג החדרה יעילה של מקטעי DNA לווקטור.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg"> איור 1: ארגון ובנייה של וקטורים pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) באמצעות רקומבינציה הומולוגית. (A) ארגון גנום PRRSV. ORF1b מקודד RNA פולימראז תלוי RNA, הליקז RNA ותחומים רב-גרעיניים קושרי אבץ. ORFs אחרים מקודדים גליקופרוטאינים הקשורים לקרום (GP2, GP3, GP4 ו-GP5), חלבון E, חלבון מעטפת הממברנה וחלבון הנוקלאוקפסיד. (B) תרשים סכמטי של תהליך היצירה של וקטור pVAX1-PRRSV. (C) ג'ל אגרוז DNA מראה הגברה PCR של מקטעי מטרה. (D) עם החדרת המקטעים, גודל הווקטור הרקומביננטי גדל בהדרגה. קיצורים: PRRSV = וירוס הרבייה והנשימה החזירית; ORF = מסגרת קריאה פתוחה; GP = גליקופרוטאין; E = חלבון E; M = חלבון מעטפת הממברנה; N = חלבון נוקלאוקפסיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>PRRSV RNA</td>
			<td>2 מיקרוליטר (25 נ"ג)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>מים ללא RNase</td>
			<td>11 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תערובת תגובות פי 5</td>
			<td>4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תערובת אנזימים עליונה</td>
			<td>3 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>טמפרטורה</td>
			<td>משך</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr><tr><td>25°C</td>
			<td>10 דק'</td>
			<td>הסרת DNA גנומי, פריימרים אקראיים משולבים עם תבניות RNA</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>15 דק'</td>
			<td>השבתה מהירה של dsDNase ושעתוק לאחור</td>
		</tr><tr><td>85 °C</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>השבתת תעתיק לאחור</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: הגדרת תמלול לאחור ותנאים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x מאגר SuperFi II</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>פריימר 10 מיקרומטר קדימה</td>
			<td>2.5 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>פריימר הפוך 10 מיקרומטר</td>
			<td>2.5 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 mM dNTPs</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>cDNA (PRRSV)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>פלטינום SuperFi II DNA פולימראז</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>32 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>שלב מחזור</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>משך</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr><tr><td>דנטורציה ראשונית</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 שניות</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>דנטורציה</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 שניות</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>חישול</td>
			<td>60°C</td>
			<td>10 שניות</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>סיומת</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>הארכה סופית</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>אחז</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: הגדרת תגובת PCR ותנאים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>ליניאריזציה של pVAX1</td>
			<td>ליניאריזציה של pVAX1-F1</td>
			<td>ליניאריזציה של pVAX1-F2</td>
			<td>ליניאריזציה של pVAX1-F3</td>
			<td>ליניאריזציה של pVAX1-F4</td>
			<td>ליניאריזציה של pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
			<td>נפח</td>
			<td>נפח</td>
			<td>נפח</td>
			<td>נפח</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>וקטור</td>
			<td>10 μL (1 מיקרוגרם) של pVAX1</td>
			<td>6 μL (1 מיקרוגרם) של pVAX1-F1</td>
			<td>3.5 μL (1 מיקרוגרם) של pVAX1-F2</td>
			<td>7.5 μL (1 מיקרוגרם) של pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 מיקרוגרם) של pVAX1-F4</td>
			<td>15 μL (1 מיקרוגרם) של pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>אנזים הגבלה 1</td>
			<td>1 μL של NdeI</td>
			<td>1 μL של NdeI</td>
			<td>1 μL של NdeI</td>
			<td>1 μL של NdeI</td>
			<td>1 μL של EcoRV</td>
			<td>1 μL של NotI</td>
		</tr><tr><td>אנזים הגבלה 2</td>
			<td>1 μL של HindIII</td>
			<td>1 μL של HindIII</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר של CIAP</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר של CIAP</td>
			<td>1 μL של NotI</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>מאגר FastDigest 10x</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
			<td>13 מיקרוליטר</td>
			<td>9 מיקרוליטר</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>סך</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: תערובת ליניאריזציה של pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 ו-pVAX1-F5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
		</tr><tr><td>ערכת שכפול והרכבה חלקה של ExonArt</td>
			<td>5 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>וקטור ליניארי</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>רסיס</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>עד 10 מיקרוליטר</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 4: הגדרת תגובת שכפול והרכבה חלקה של ExonArt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2x תערובת מאסטר PCR ירוקה אוניברסלית</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>פריימר 10 מיקרומטר קדימה</td>
			<td>0.4 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>פריימר הפוך 10 מיקרומטר</td>
			<td>0.4 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תבנית</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>8.2 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>סך</td>
			<td>20 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>טמפרטורה</td>
			<td>משך</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr><tr><td>95 °C</td>
			<td>30 שניות</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>10 שניות</td>
			<td>28</td>
		</tr><tr><td>56 °C</td>
			<td>10 שניות</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 5: הגדרת PCR מושבה ותנאים.
איור משלים S1: סכמטי של תהליך עיצוב פריימר. עיצובי פריימר אחרים כגון P5 ו- P6 מוצגים גם כן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: רצפי פריימר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: נתוני ריצוף DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

פרוטוקול זה מדגים בנייה של וקטור ביטוי גנים ארוך ומורכב. כאשר לא ניתן להשיג מקטע DNA באורך מלא על ידי PCR יחיד מ- cDNA, או שלא ניתן להשיג את וקטור ביטוי הגנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית מרובת כניסות במבחנה, שיטה זו ישימה. כיום, שיבוט קשירה מרובת כניסות משמש להשגת מקטע DNA באורך מלא לשיבוט לווקטור מתאים.שיטה זו יכולה להשיג מחיקה או מוטציה של גני מטרה ולצרף ביעילות מספר רב של מקטעי DNA לווקטור הביטוי.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ"ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

ניתן להשתמש במתודולוגיות מיקוד גנים כדי ליצור עכברים טרנסגניים עם אללים נוק-אאוט, נוק-אין ומתויגים.  כאן, אנו מתארים שיטה משופרת של קומבינר מחדש ב-E. coli, שאנו מכנים 'תת-שיבוט פלוס הכנסה', שניתן להשתמש בה כדי ליצור וקטורים מכוונים לגנים מותאמים אישית במהירות.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) משמש כפלטפורמה וקטור לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומהירה לדור של recombinant חיסונים HVT-הווקטורי שימוש משולב NHEJ-CRISPR/Cas9 ומערכת Cre-לקס.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

למדו לבנות וקטורי ביטוי גנים מורכבים ל-PRRSV בשיטת שיבוט חלקה. שיטה זו מאפשרת שילוב יעיל של מספר רב של קטעי DNA לתוך וקטור pVAX1 לחקר פונקציות גנים ויראליים.

גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה

גלה סרטונים נוספים