צביעה אדומה של פיקרוזיריוס להערכה היסטופתולוגית כמותית למחצה של שקיעת קולגן במודלים עכבריים של דחיית אלוגרפט ריאה כרונית
21 במרץ 2025
צביעה אדומה של פיקרוזיריוס היא שיטה כמותית למחצה להערכה אובייקטיבית של שקיעת קולגן בשיפוץ פיברוטי ריאתי של עכברים באופן פתור מרחבי. מלבד הערכת שקיעת הקולגן הכוללת, צביעת Picrosirius Red מאפשרת להבדיל בין סיבי קולגן בעוביים שונים.
המחקר שלנו מתמקד בניתוח התפתחות פיברוזיס בדחיית השתלת ריאות כרונית. לכן אנו מעוניינים בשיטות המאפיינות את תא הרקמה הפיברוטית. כדי לשחזר מחלות הקשורות להשתלה, אנו משתמשים במודל העכברי של השתלת ריאה בודדת שהצגנו לפני מספר שנים.
במודל זה, הוכח כי השתלת ריאה בין זני עכברים אלוגניים גורמת לרמות שונות של פיברוזיס בשתלים. נתונים היסטולוגיים על שיפוץ רקמות פיברוטיות מוצגים לעתים קרובות באופן איכותי. השיטה שלנו המשתמשת בצביעה אדומה של פיקרוזיריוס מציעה יתרון של הערכה חצי כמותית ומבדילה בין סיבי קולגן עבים ודקים.
כדי להתחיל, יש להרטיב את דגימות הריאות של העכבר המוטבעות בפרפין בריכוזי אתנול יורדים למשך שתי דקות כל אחת. צבעו את השקופית במשך שמונה דקות בתמיסת ההמאלום של מאייר. שטפו את המגלשה במשך 10 דקות תחת מי ברז זורמים, ולאחר מכן דגרו את המגלשה למשך שעה בתמיסת Picrosirius Red.
טובלים את השקופית חמש עד 10 פעמים בתמיסת חומצה אצטית של 0.5%. נער בעדינות את השקופית כדי להסיר את התמיסה. כעת ייבשו את המגלשה בריכוזי אתנול הולכים וגדלים ו-100% קסילול למשך חמש דקות כל אחד.
הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה על הדגימה להטמעה וכסה בהחלקת כיסוי. הניחו למגלשות להתייבש מתחת למכסה אדים. תחת מיקרוסקופ אור, השתמש בתוכנת הדמיה מתאימה כדי למקד את הדגימה עד לקבלת תמונה ברורה וחדה.
התאם את מידת מסנן הקיטוב עד שהרקע כהה או שחור לחלוטין. סרוק את הדגימה בהגדלה של פי 20 וייצא את התמונות בפורמט TIFF. העבר את התמונות לתוכנת פיג'י.
לחץ על Edit ובחר Clear Outside. לאחר מכן לחצו על 'נתח' ולאחר מכן על 'מדידה' כדי למדוד את שטח הפנים הכולל. כדי למדוד את תכולת הקולגן הכוללת בכל דגימה, לחצו על Image ולאחר מכן על Adjust ו-Color Threshold.
הגדר את הגוון בין 2 ל-130 ואת הבהירות בין 35 ל-255. לאחר מכן לחץ על נתח ובחלון ניתוח חלקיקים, הגדר את הגודל ל -1 מינוס אינסוף וסמן את התיבות נקה וסיכום. התאימו את הגוון לאדום לניתוח סיבי קולגן עבים ולירוק צהוב לסיבי קולגן דקים, ומדדו את ספירת הקולגן הכוללת.
לבסוף, לחץ על תוספים, פקודות מאקרו והקלטה כדי להגדיר את המאקרו לעיבוד אוטומטי. הטריכרום של מאסון, הצביעה האדומה של הרוביצ'י ופיקרוסיריוס המחישו שקיעת קולגן פרברונכיאלית ופרה-וסקולרית נרחבת במודל הלא תואם של קומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרית. המודל הלא תואם הקטן הראה בעיקר חדירות לימפוציטיות צפופות עם שקיעת קולגן פחות אינטנסיבית.
צביעה אדומה של פיקרוסיריוס עם מסנן קיטוב חשפה מראה ירוק של הסיבים המופקדים בשני הדגמים. בקרות איזוגרפט הראו קולגן מוגבל לגבולות פרברונכיאלים ופרא-וסקולריים, בדומה לריאות עכברים נאיביות. ניתוח תמונה דיגיטלית חשף קולגן כולל מוגבר בשתלי ריאות לא תואמים של קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי בהשוואה לשתלים קלים לא תואמים, רקמת ריאה נאיבית בצד ימין או ריאות שמאל נאיביות BALB/c.
לא הודגמו הבדלים בסיבי קולגן עבים. ניתוח של סיבי קולגן דקים הראה נוכחות מוגברת במודל הלא תואם העיקרי בהשוואה למודל הלא תואם הקטן, רקמת ריאה ימנית נאיבית או ריאות שמאל BALB/c נאיביות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התפתחות הפיברוזיס בדחייה כרונית של השתלת ריאה באמצעות מודל השתלה בעכברים. המתודולוגיה המרכזית עושה שימוש בצביעת Picrosirius Red כדי לספק הערכה חצי-כמותית של שקיעת קולגן, המאפשרת הבחנה בין סיבי קולגן עבים לדקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- דחייה כרונית של השתלת ריאה
- אפיון רקמה פיברוטית
- מודלים של השתלה בעכברים
רקע
- הערכה איכותנית של remodeling פיברוטי היא נפוצה, אך מחקר זה מציע גישה כמותית יותר.
- נצפו רמות שונות של פיברוזיס של השתלה בין זני עכברים אלוגניים.
- ניתוח היסטולוגי חיוני להבנת חיות השתל ותגובת הרקמה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צביעת Picrosirius Red להערכת קולגן
- מודל עכברי להשתלת ריאות
- ניתוח תמונות דיגיטלי באמצעות תוכנה ייעודית
תוצאות עיקריות
- עלייה בכמות הקולגן הכוללת בשתלים עם אי-תאימות של קומפלקס ההיסטו-תאימות מרכזי (major histocompatibility complex) בהשוואה לשתלים עם אי-תאימות מינורית.
- סיבי קולגן דקים היו נפוצים יותר במודלים של אי-תאימות מרכזית לעומת קבוצות הביקורת.
- לא נמצאו הבדלים משמעותיים בסיבי קולגן עבים בין התנאים השונים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים את יעילות הצביעה ב-Picrosirius Red להערכת שינויים פיברוטיים בהשתלות ריאות.
- הממצאים רלוונטיים להבנת דחיית הש Transplant ופיברוזיס בביולוגיה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרות ניהוליות
הערכה כמותית של פיברוזיס היא אתגר קריטי במודלים פרה-קליניים של דחייה כרונית של השתקת ריאה, המשפיעה ישירות על מידת הביטחון החזאית של מחקרים תרגומיים. צביעת Picrosirius Red מאפשרת הערכה חצי-כמותית של שקיעת קולגן, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות במודלים של מחלות פיברוטיות. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בניהול הפורטפוליו על ידי אספקת נתונים הדירים בעלי רזולוציה מרחבית על רה-ארגון (remodeling) של הרקמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים פיברוטיים וכימות של עיצוב מחדש של קולגן במערכות רלוונטיות למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין סיבי קולגן עבים לדקים ברקמות אלוגרפט.
- מסייע בביטחון ניבוי באימות מטרות עבור אסטרטגיות אנטי-פיברוטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין נקודות קצה היסטופתולוגיות מתוקפות עבור סריקת תרכובות בהמשך בניסויים במודלים של עכברים.
- מנstandardize מדידה חצי-כמותית של קולגן לצורך הדירות בין מחקרים.
- מאפשר תהליכי עבודה של ניתוח דיגיטלי של תמונות הניתנים להרחבה עבור פלטים כמותיים של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרן את הכימות של פיברוזיס בשלב הפרה-קליני עם פיתוח ביומרקרים תרגומיים במחקר על השתלת ריאות.
- מספק רציפות ממחקרי מנגנונים בשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של התערבויות אנטי-פיברוטיות.
- תומך בהחלטות קידום מבוססות סיכון על ידי כימות חומרת עיצוב מחדש של הרקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו נטמעת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת כימות רב-משתנים של פיברוזיס במודלים של השתקת ריאה במישור העכברי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על רמיodeling פיברוטי ומעורבות של מסלולים בדחייה כרונית.
- סינון: מספק קריאות קולגן כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק פלטי ניתוח תמונות דיגיטליות להשוואה סטטיסטית של קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין נקודות סיום של פיברוזיס בשלב הפרה-קליני לבין אסטרטגיות פוטנציאליות של סממנים ביולוגיים קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להערכת פיברוזיס במגוון מודלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר פיברוזיס.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של ניתוח היסטופתולוגי.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נקודות סיום כמותיות חסונות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים ומודלים אנטי-פיברוטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטופתולוגיה ובניתוח תמונות דיגיטלי.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה, למסנני קיטוב ולתוכנה לעיבוד תמונות (למשל, Fiji).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הצביעה והניתוח.
- ייתכן שיידרש התאמה לסוגי רקמות שונים או למודלים של בעלי חיים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות שונות בעוצמת הצביעה ובסף הפיסול (thresholding) של התמונה.
