Name: ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: חקור מנגנוני תיקון שבירות DNA כפולות בשרשרת בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP. השיטה מאפשרת השוואה כמותית של יעילות NHEJ ו-HR בזמן קצר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז היילונגג'יאנג בסין (YQ2022C036) וקרן החדשנות לתארים מתקדמים של האוניברסיטה הרפואית Qiqihar (QYYCX2022-06). איור 1 הופק באמצעות MedPeer.

1. בידוד פלסמיד
<ol><li>הפוך E. coli מוכשר עם פלסמידים EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-Sce I המבטא פלסמיד), ו- PCI2-HA-mCherry (mCherry המבטא פלסמיד) (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול הטרנספורמציה הסטנדרטי20. הערה: PCI2-HA-mCherry ניתן להחליף עם mCherry או DsRed אחרים המבטאים פלסמידים.</li>
	<li>טפחו את E. coli שעבר טרנספורמציה ב-500 מ"ל של LB בינוני נוזלי בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ"ל למשך הלילה ב-37°C עם רעידות.</li>
	<li>בודד את הפלסמידים באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מקסי ללא אנדוטוקסין הזמינה באופן מסחרי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>כמת את ריכוזי הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטרים של מיקרו-נפחים ננו-טיפתיים. כוונן את ריכוז הפלסמיד ל- 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.</li>
</ol>2. הכנת תאים וטרנספקציה
<ol><li>תרבית תאי HEK-293T בתווך DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי. ודא כי תאי HEK-293T או תאים יציבים HEK-293T מבוססים נמצאים במצב צמיחה טוב. הערה: תאים קפואים צריכים לעבור לפחות שני סבבים של פיצול לפני הטרנספקציה.</li>
	<li>ביום שלפני ההדבקה, זרעו תאי HEK-293T בצלחת 6 בארות ב 2 × 105 תאים / באר כדי להשיג סביב 60% מפגש למחרת.</li>
	<li>ביום הטרנספקציה, לאשר את מפגש התא, מכוון כ 60%. עבור בדיקת NHEJ, הדבק את תאי הדגימה הניסיוניים בצלחת 6 בארות עם 1 מיקרוגרם של EJ5-GFP, 1 מיקרוגרם של pCBASceI, ו 1 מיקרוגרם של פלסמידים PCI2-HA-mCherry, באמצעות מגיב טרנספקציה מסחרי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). עבור בדיקת HR, החלף את פלסמיד EJ5-GFP בפלסמיד DR-GFP.</li>
	<li>עבור פקדי כיול FACS, השאר באר של תאים לא נגועים כבקרה שלילית. העבר את התאים בצלחת של 6 בארות עם (1) 1 מיקרוגרם של EJ5-GFP (עבור מבחן NHEJ) או 1 מיקרוגרם של DR-GFP (עבור בדיקת HR), יחד עם 1 מיקרוגרם של pCBASceI כבקרת צבע יחיד של GFP, או (2) 1 מיקרוגרם של PCI2-HA-mCherry כבקרת צבע יחיד של mCherry.</li>
</ol>3. אנליזה של תאים חיוביים ל-GFP ותאי mCherry-positive לפי ציטומטריית זרימה
<ol><li>יומיים לאחר הטרנספקציה, לאשר את הביטוי של חלבונים GFP ו mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>שלושה ימים לאחר ההעברה, להסיר את המדיה מן הבארות, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולהוסיף 500 μL טריפסין לכל באר. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לנתק את כל התאים מהצלחת. במהלך שלב זה והשלבים הבאים, להגן על התאים מפני אור ישיר.</li>
	<li>הוסף מדיית DMEM מלאה של 500 μL לכל באר, השהה מחדש תאים, וודא שלא נראים גושים.</li>
	<li>מעבירים את כל התאים מכל באר לצינורות צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל, ולאחר מכן לתאי צנטריפוגות למשך 2 דקות בטמפרטורה של 1000 × גרם בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בזהירות להסיר את supernatant על ידי pipetting ולשטוף פעם אחת עם 1.0 מ"ל PBS.</li>
	<li>שוב, בזהירות להסיר את supernatant על ידי pipetting, resuspend את התאים ב 500 μL של PBS, ולהעביר את התאים צינורות FACS (ראה טבלה של חומרים). הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, התחל בניתוח ציטומטריה של זרימה מיד לאחר קצירת תאים. לחלופין, תאים יכולים להיות מאוחסנים על קרח במשך מספר שעות.</li>
	<li>כייל את FACS עם תאים לא נגועים (בקרה שלילית), EJ5-GFP/DR-GFP ותאים נגועים pCBASceI (בקרת צבע יחיד של GFP) ותאים נגועים mCherry (בקרת צבע יחיד mCherry). כוונן את המתח והפיצוי כדי למזער את זליגת הפלואורסצנטיות בין GFP ל-mCherry.</li>
	<li>לרכוש ולתעד לפחות 10,000 תאים שלמים מכל צינור.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
הערה: השלבים הבאים מבוצעים באמצעות תוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח את נתוני FACS. ניתן לבצע הליכים דומים בתוכנת ניתוח חלופית.
<ol><li>גרור את כל קבצי FACS ללוח המחוונים. לחץ פעמיים על אחד הקבצים כדי להציג את התוויית FSC/SSC.</li>
	<li>צרו שער מצולע לבחירת תאים שלמים, למעט לכלוך בפינה השמאלית התחתונה. תן לתת-אוכלוסייה זו את השם "תאים שלמים" וגרור שער זה לסרגל "כל הדגימות". גללו לאורך כל דגימה באמצעות הלחצן 'הדגימה הבאה ' כדי להבטיח התאמה לכל דגימה (איור 2A).</li>
	<li>לחץ פעמיים על תת-אוכלוסיית התאים השלמים של דגימת הבקרה השלילית (תאים לא נגועים) כדי להעלות תרשים חדש. שנה את הצירים ל- FL1-H (ציר x, GFP) ו- FL2-H (ציר y, mCherry).</li>
	<li>בחרו בכלי Quad Gating ולחצו על הקיצוניות הימנית העליונה של אוכלוסיית התאים השלילית (איור 2B). גרור את ארבעת השערים המלבניים לסרגל "תאים שלמים". גלול בין דגימות של פקד GFP בצבע יחיד או פקד צבע יחיד mCherry באמצעות הלחצן Next Sample כדי להבטיח gating מתאים להבחנה בין GFP חיובי או mCherry-חיובי לבין תאי ביקורת שליליים (איור 2C,D). כוונן את ה- quadrant gating במידת הצורך והחל gating זה על כל אוכלוסיות "תאים שלמים".</li>
	<li>לחץ על עורך הפריסה. לחץ לחיצה ימנית על החלקות המייצגות ובחר העתק לעורך הפריסה. בחרו בכל החלקות המייצגות ולאחר מכן לחצו פעמיים לפתיחת 'הגדרת תרשים'. התאם את תווית הציר, הוסף ביאורים ומקרא כרצונך.</li>
	<li>אחוז התאים החיוביים mCherry בדגימות ניסוי משמש כבקרת יעילות הטרנספקציה. חשב את יעילות תיקון ה- DNA היחסי על ידי השוואת מספר התאים החיוביים ל- GFP עם מספר התאים החיוביים mCherry באותה חלקה.</li>
</ol>

ניתוח FACS של תאי כתב GFP ו- mCherry להערכת יעילות NHEJ ומשאבי אנוש

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים לחשוף.

השיטה המתוארת כאן שימשה במספר מאמרים להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. שיטה זו רלוונטית להבהרת המנגנונים הבסיסיים של תיקון DNA DSB וזיהוי גורמים חדשים הקשורים ל- NHEJ ו- HR. לדוגמה, הפונקציה של תת-יחידה קטליטית תלוית DNA של חלבון קינאז (DNA-PKcs)9, חלבון ATPase גרעיני באינטראקציה עם קוילין (hCINAP)10, WASH11, גן Inducible חומצה רטינואית I (RIG-I)12, תיקון קרני רנטגן חלבון משלים צולב 4 (XRCC4)12, חלבון המכיל תחום HORMA 1 (HORMAD1)13, פרוטאז ספציפי ליוביקוויטין 44 (USP44)14ו- lncRNA NIHCOLE (RNA לא מקודד המושרה בקרצינומה הפטוצלולרית עם תפקיד אונקוגן ביעילות הקשירה) ב- NHEJ או HR נחשפו או אומתו באמצעות יישום שיטות חוץ-כרומוזומליות., בניגוד לגישה המשולבת כרומוזומלית, גישה חוץ-כרומוזומלית זו מאפשרת ניתוח מהיר של יעילות NHEJ או HR באמצעות ניצול קווי תאים יציבים מבוססים.
בדיקות NHEJ ו- HR חוץ-כרומוזומליות, אשר שימשו בעבר בתאי HEK-293T על ידינו ועל ידי אחרים 10,11,12, שימשו גם על ידי מספר קבוצות מחקר אחרות בקווי תאים שונים, כולל תאי U2OS 16,17, תאי קרצינומה עוברית17,19, HCT116 תאים 9, SUM159 תאים13, תאי HCC114313, MDA-MB-436 תאים13, תאי SUNE114, תאי Huh718 ותאי JHH618. הפרוטוקול כאן מספק תיאור מפורט של בדיקות NHEJ ו- HR שנערכו בתאי HEK-293T. בהתחשב ביעילות הטרנספקציה הבולטת של תאי HEK-293, שילוב של 1 מיקרוגרם של EJ5-GFP או 1 מיקרוגרם DR-GFP, יחד עם 1 מיקרוגרם pCBASceI, נחשב מתאים לתאי HEK-293T בתרבית בצלחת של 6 בארות. עם זאת, תנאי הטרנספקציה עשויים להיות שונים בקווי תאים שאינם HEK-293T 9,16,17, מה שמחייב את החוקר לקבוע בקפידה את התנאים המדויקים להעברה מוצלחת.
השגת מפגש התאים הנדרש לפני הטרנספקציה היא הליך מרכזי בפרוטוקול. מספר לא מספיק או מופרז של תאים יכול לעכב באופן משמעותי את היעילות של transfection. מספר לא מספיק של תאים מחמיר את הרעילות שלאחר הטרנספקציה, ובכך מעכב את ההערכה המדויקת של תיקון DSB. יתר על כן, חשוב להשתמש באותה תערובת של פלסמידים ומגיב טרנספקציה בתוך ניסוי אחד, שכן סטיות בתערובת של EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry, ומגיב טרנספקציה עשויות להשפיע על התוצאה.
בנוסף ל- NHEJ ו- HR, זוהו חיבורי קצה חלופיים (a-EJ) וחישול חד-גדילי (SSA) כמנגנונים נוספים לתיקון DSB. עם זאת, בתאים מסוג פראי, NHEJ ו- HR הם המסלולים העיקריים לתיקון DSB, בעוד a-EJ ו- SSA תורמים רק תרומה מינורית בהקשר זה. ראוי לציין כי בדיקת NHEJ המשתמשת בפלסמיד EJ5-GFP מזהה הן אירועי NHEJ והן אירועי a-EJ, ולכן יכולה להיחשב כבדיקה עבור סך NHEJ, כולל NHEJ ו- a-EJ5. ניתוח פרטני של a-EJ יכול להיות מושג פשוט על ידי החלפת EJ5-GFP עם EJ2-GFP18. בדיקות דומות יכולות להתבצע גם כדי לנתח את יעילות התיקון של SSA על ידי החלפת כתב GFP משובש ב- hprtSAGFP21.

שבר דנ"א דו-גדילי (DSB) הוא הצורה המזיקה ביותר של נזק לדנ"א, שעלולה להוביל לחוסר יציבות גנומית, סידור מחדש של כרומוזומליים, הזדקנות תאית ומוות תאי אם לא יתוקן מיד1. שני מסלולים מבוססים היטב, הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR), מוכרים ביעילותם בטיפול ב- DNA DSBs 2,3. HR נחשב למנגנון נטול שגיאות לתיקון DSB, תוך שימוש ברצפים הומולוגיים בכרומטיד האחות כתבנית לשחזור התצורה המקורית של מולקולת הדנ"א הפגועה3. NHEJ, לעומת זאת, הוא מסלול תיקון DSB מועד לשגיאות שמצטרף לקצוות הדנ"א השבורים מבלי להסתמך על תבנית2 כלשהי.
בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות קלאסיות שפותחו במקור במעבדה של ג'סין במרכז הסרטן ממוריאל סלואן-קטרינג ושימשו לכימות היעילות של NHEJ ו- HR, בהתאמה 4,5,6,7. בדיקות אלה ממלאות תפקיד מכריע בחקירת המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים ל- NHEJ ו- HR 8,9,10,11,12,13,14. שתי הבדיקות מסתמכות על יישום של שני כתבי GFP משובשים, EJ5-GFP ו- DR-GFP, כדי לפקח על תיקון DSB המושרה על ידי I-SceI endonuclease. כתב EJ5-GFP מועסק במבחן NHEJ, ואילו כתב DR-GFP מנוצל במבחן משאבי אנוש. כל כתב מתוכנן בעדינות כך שניתן לתקן את ה- DSB המושרה על ידי I-SceI-Induced רק על ידי מסלול תיקון ספציפי כדי לשחזר קלטת ביטוי GFP 4,5.
ניתן לבצע את בדיקת NHEJ ובדיקת HR באמצעות גישה משולבת כרומוזומלית או גישה חוץ-כרומוזומלית15,16. הגישה המשולבת כרומוזומלית מחייבת שילוב של כתבי GFP משובשים בגנום, ומאפשרת ניתוח של תיקון DSB בהקשר כרומוזומלי 6,15. עם זאת, גישה זו דורשת מעבר תאים ממושך ואינה מתאימה למחקרים השוואתיים המערבים קווי תאים מרובים עקב אינטגרציה כרומוזומלית שרירותית, המציגה גורם מבלבל נוסף מלבד הבדלים מובנים. בפרוטוקול זה אנו מתארים את מבחני NHEJ ו-HR החוץ-כרומוזומליים, הכוללים טרנספקציה חולפת של פלסמידים GFP ו-I-SceI משובשים לתאי HEK-293T, ולאחר מכן ניתוח ציטומטריית זרימה (זרימת העבודה של הניסוי מוצגת באיור 1). מבחני כתבים לא משולבים אלה דווחו במקור על ידי מעבדתו של ג'סין לחקר תיקון קישורים צולבים של DNA16 ושימשו להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש על ידי מספר מעבדות 9,10,11,12,13,14,17,18,19, כולל שלנו11. גישות חוץ-כרומוזומליות אלה מקלות על ניתוח תיקון DSB במחקרים השוואתיים הכוללים מספר קווי תאים יציבים מבוססים.

<table><tbody><tr><td>כלים 6 ס"מ&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6 לוחות באר</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>ריכוז עבודה: 100 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>DH5 ואלפא; תאים מוכשרים</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid&nbsp; ערכת</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>ערכת מיצוי פלסמיד חלופית ללא אנדוטוקסין ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בצינורות FACS</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בסרום בקר עוברי</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSניתן</td><td></td></tr><tr><td>להשתמש בתוכנת ניתוח אלטרנטיבית</td>של <td>Treestar FlowJo</td><td>V.10.1</td> Treestar <td></td></tr><tr><td>תאי HEK-293T</td><td>תשתית לאומית של משאב קו תאים</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>ניתן להשתמש בעוצר טרנספקציה חלופי</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>SceI המבטא פלסמיד</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mניתן</td><td></td><td></td><td>להשתמש בפלסמידים חלופיים המכילים DsRed</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי hek-293t באמצעות מערכות דיווח מבוססות gfp

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

שברי DNA דו-גדיליים (DSBs) מייצגים את נגעי הדנ"א המסוכנים ביותר, המסוגלים לגרום לאובדן מידע גנטי משמעותי ולמוות תאי. בתגובה, תאים משתמשים בשני מנגנונים עיקריים לתיקון DSB: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR). כימות היעילות של NHEJ ומשאבי אנוש בנפרד הוא חיוני לבחינת המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים לכל אחד מהם. בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות מבוססות המשמשות למדידת היעילות של מסלולי התיקון שלהם. שיטות אלה מסתמכות על פלסמידים שתוכננו בקפידה המכילים גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משובש (GFP) עם אתרי זיהוי עבור אנדונוקלאז I-SceI, אשר משרה DSBs. כאן, אנו מתארים את בדיקת NHEJ החוץ-כרומוזומלית ובדיקת HR, הכוללים העברה משותפת של תאי HEK-293T עם פלסמידים EJ5-GFP/DR-GFP, פלסמיד המבטא I-SceI ופלסמיד המבטא mCherry. תוצאות כמותיות של יעילות NHEJ ו- HR מתקבלות על ידי חישוב היחס בין תאים חיוביים ל- GFP לתאים חיוביים mCherry, כפי שנספר על ידי ציטומטריית זרימה. בניגוד לבדיקות משולבות כרומוזומלית, בדיקות חוץ-כרומוזומליות אלה מתאימות יותר לביצוע חקירות השוואתיות המערבות מספר קווי תאים יציבים מבוססים.

כדי להבטיח את הדיוק של ניתוח NHEJ ומשאבי אנוש, יש צורך ביישום אסטרטגיית התאמת תגמול והתאמה מתאימה. בדרך כלל, פלואורסצנטיות mCherry אינה מתבטאת בגלאי GFP בעת שימוש במסנן 530 ננומטר. עם זאת, במקרים של תאים המציגים ביטוי GFP גבוה מאוד, פלואורסצנטיות GFP עלולה לזהם את גלאי mCherry בעת שימוש במסנן 575 ננומטר. כדי להתמודד עם חששות אלה, נעשה שימוש בבקרה שלילית, בקרת GFP בצבע יחיד ודגימות בקרה בצבע יחיד mCherry לפיצוי ולוויסות אסטרטגיית ה- gating. תוצאות FACS אופייניות של תאי הבקרה מוצגות באיור 2. אסטרטגיית התאמת פיצוי ו-gating אמורה למקם את רוב התאים החיוביים ל-GFP ברביע הימני התחתון (איור 2C) ואת רוב התאים החיוביים ל-mCherry ברביע השמאלי העליון (איור 2D).
החלקות המייצגות הסופיות מוצגות באיור 3A,B. לאחר השראת DSB על ידי I-SceI, אירועי תיקון מוצלחים ירכיבו מחדש את הגן GFP. לפיכך, אחוז התאים החיוביים ל- GFP מתאים ליעילות של תיקון DNA DSB ויעילות טרנספקציה. אחוז התאים החיוביים mCherry מתאים רק ליעילות הטרנספקציה. ניתן לחשב את היעילות היחסית של תיקון DSB בדנ"א כיחס בין תאים חיוביים ל-GFP לתאים חיוביים לתאים חיוביים ל-mCherry-positive (איור 3C).
דוגמה מוחשית לבדיקת NHEJ לאפיון התפקיד של חלבון תסמונת ויסקוט-אולדריץ' והומולוג SCAR (WASH) בתיקון דנ"א מוצגת באיור 4. בדוגמה זו ביצענו את בדיקת NHEJ כדי להעריך את יעילות ה-NHEJ של תאי shControl ותאי shWASH (איור 4). ברור שאובדן המים, התברואה וההיגיינה הביא לירידה ביעילות ה-NHEJ, ואישר את תפקידו של המים, התברואה וההיגיינה בקידום יעילות ה-NHEJ כפי שנקבע על-ידי בדיקת NHEJ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה עבור בדיקת NHEJ/HR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> איור 2: אסטרטגיית Gating לניתוח ציטומטריית זרימה. (A) FSC-H/SSC-H על תאים שלמים. (B) תאי HEK-293T לא נגועים שימשו כבקרה שלילית להרחקת תאים אוטופלואורסצנטיים. (C) תאי HEK-293T שהודבקו בפלסמידים מסוג EJ5-GFP ו-pCBASceI שימשו לקביעת ה-gating לתאים חיוביים ל-GFP. (D) תאי HEK-293T שהודבקו בפלסמידים mCherry שימשו להגדרת ה-gating עבור תאים חיוביים ל-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> איור 3: תוצאות אופייניות. (A) חלקות מייצגות הממחישות את ניתוח NHEJ. (ב) חלקות מייצגות הממחישות את ניתוח משאבי אנוש. (ג) תרשים מודל של שיטת החישוב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> איור 4: מים, תברואה והיגיינה מקדמים יעילות NHEJ. (A) חלקות מייצגות הממחישות את ניתוח יעילות NHEJ בתאי shControl ובתאי shWASH. (B) תוצאות סטטיסטיות מייצגות המשווה יעילות NHEJ בין shControl ותאי shWASH. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

שברים דו-גדיליים בדנ"א מייצגים את נגעי הדנ"א המסוכנים ביותר. בתגובה, תאים משתמשים בשני מנגנונים עיקריים לתיקון שבר דו-גדילי DNA, NHEJ ו-HR. כימות היעילות של NHEJ ומשאבי אנוש בנפרד הוא חיוני לחקר המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים אליהם. בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות מבוססות המשמשות למדידת היעילות של NHEJ ו- HR. שיטות אלה מסתמכות על פלסמידים שתוכננו בקפידה ומכילים גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משובש עם אתרי זיהוי עבור אנדונוקלאז I-SceI להשראת DSBs.ניתן לבצע את בדיקת NHEJ ואת בדיקת משאבי אנוש באמצעות גישה משולבת כרומוזומלית או חוץ-כרומוזומלית. הגישה המשולבת כרומוזומלית מאפשרת ניתוח של תיקון DSB בתוך תחרות כרומוזומלית. עם זאת, הגישה המשולבת כרומוזומלית דורשת תאים ממושכים ואינה מתאימה למחקרים השוואתיים המערבים קווי תאים מרובים.בפרוטוקול זה, אנו מתארים את מבחני NHEJ ו- HR החוץ-כרומוזומליים הכוללים טרנספקציה חולפת של פלסמידים GFP ו- I-SceI משובשים לתאי HEK-293T וניתוח ציטומטריית זרימה לאחר מכן. מבחני כתבים לא משולבים אלה שימשו להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש על ידי מספר מעבדות, כולל שלנו. בניגוד לגישה המשולבת כרומוזומלית, גישה חוץ-כרומוזומלית זו מאפשרת ניתוח מהיר של יעילות NHEJ או HR באמצעות ניצול קווי תאים מבוססים ויציבים.

analysis-nonhomologous-end-joining-homologous-recombination

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר GFP מבוססי...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ"א על ​​ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

Assay HO-מגורה טרנסלוקציה מפקחת גדיל יחיד חישול בעקבות הקמתה של גדיל הדנ"א הכפול הפסקות בבית לוקוסים מספר...

Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae</em

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

כאן, אנו מתארים שיטה לוויזואליזציה מבוססת תאים, לוקאליזציה תת-תאית וניתוח כמותי של מוקדים מועשרים בפולי(ADP-ריבוז) (PAR) בתאי יונקים קבועים. מבחן זה מאפשר לכימות אתרים של הפעלת PARP הנגרמת מנזק DNA, כולל זה הקשור לתיקון כריתת בסיס או תיקון שבירה חד-גדילית, בגרעינים של תאים שנחשפו לגנוטוקסין.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי

חקור מנגנוני תיקון שבירות DNA כפולות בשרשרת בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP. השיטה מאפשרת השוואה כמותית של יעילות NHEJ ו-HR בזמן קצר.

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

גלה סרטונים נוספים