מטריצת קרום מרתף צבירת תאים עטופה לחקר היווצרות רקמת טחול מורין
28 ביוני 2024
מאמר זה מתאר פרוטוקול לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצת קרום מרתף מוצקה למחצה. מבני מטריצת קרום מרתף יכולים לשמש בתרבית תלת ממדית לחקר התפתחות אורגנואידים, או למחקרי השתלות in vivo והתחדשות רקמות.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לצבור ולעטוף תאים בתוך מטריצה מוצקה למחצה. לאחר מכן ניתן להשתמש בצברי תאים משובצים במורד הזרם בתרבית תלת-ממדית במבחנה, או ככלי לניסויי השתלות in vivo. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת במתודולוגיה פשוטה וציוד כדי להשיג צבירת תאים.
ניתן להחיל אותו גם על מגוון סוגי תאים ומספרים. טכניקה זו חשפה סוג תא ספציפי הנדרש לטחול להתחדש. זה יכול לחשוף רגולטורים נוספים של התחדשות רקמת הטחול, או לשמש פלטפורמה למחקרים רחבים יותר בהנדסת רקמות.
התחילו בקירור מראש של קופסת פיפטה 200 מיקרוליטר בתוך מקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לטבול את Parafilm באתנול 80% למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף 10 דקות ב-PBS. כדי להכין את תמיסת התא, aliquot את מספר התא הרצוי לתוך צינור חרוטי 14 מיליליטר.
צנטריפוגה את התאים ב 200 גרם ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. ואז בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כ 20 מיקרוליטר של נפח מאחור. לאחר מכן ניתן להשהות מחדש את כדורית התא בנפח הסופרנאטנטי שנותר.
בעזרת קצה פיפטה מצונן מראש, שואפים 2 מיקרוליטר של מטריג'ל קר כקרח. סובבו והוציאו בעדינות כדי להסיר את קצה הפיפטה. מותחים רצועה מעוקרת מראש של פרפילם ומניחים אותה על קצה קצה הפיפטה, תוך הקפדה שלא לנקב את הסרט.
המשיכו לעטוף את הפרפילם סביב הצד כדי לוודא שהקצה אטום. לאחר מכן שכבה את תמיסת התא בעדינות על Matrigel. השאירו את קצה הפיפט על קרח והכינו צינור חרוטי 14 מיליליטר עם צינור אשכול 1.2 מיליליטר ממוקם בפנים.
לאחר מכן ניתן להכניס את קצה הפיפט לתוך תצורת הצינור המקונן, ולצנטריפוגה במשקל 400 גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לדגור על הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ניתן להניח את הצינור על קרח עד לצורך נוסף.
בזהירות להסיר את Parafilm מן קצה פיפטה, ולאחר מכן להכניס בוכנה חוט דק, ולגרש את תקע Matrigel למדיום תרבית רקמות. התאים המצטברים יכולים להיות בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. יש לגלח את הפרווה באמצעות קוצץ חשמלי ולספוג את העור עם 80% אתנול.
בצע חתך של שני סנטימטרים בעור בניצב לעמוד השדרה, וחשף את דופן הצפק. חתך שני קטן יותר נעשה אז בקיר הצפק מעל הכליה. להפעיל לחץ ו outize הכליה.
ודא שהכליה נשמרת לחה על ידי יישום PBS סטרילי באופן קבוע. צבטו את כמוסת הכליה עם זוג מלקחיים עדינים במיוחד, ובעזרת זוג שני, קרעו בעדינות בכיוונים מנוגדים. בזהירות להפריד את קרום הקפסולה מן parenchyma הכליות.
הרימו את כמוסת הכליה עם זוג מלקחיים אחד והחליקו באיטיות את קצה הפיפט דרך הפתח. הכנס בעדינות בוכנה חוט לקצה פיפטה וגרש את תקע המטריגל. להרטיב את הכליה עם PBS ולהפנים מחדש לתוך חלל הצפק.
סגור את דופן הצפק עם תפרים 5-O-Vicryl, וסגור את החתך בעור באמצעות יישום AutoClip ושני קליפסים לפצע 9 מ"מ. שלב מפתח בפרוטוקול זה הוא צבירת תאים בתוך מטריצה מוצקה למחצה. מיקום שכבה אמצעית מושג באמצעות מהירויות צנטריפוגה אופטימליות.
מהירויות גבוהות יותר מניעות תאים עד קצה הפיפטה, בעוד שמהירויות לא מספיקות אוסרות על תנועת תאים דרך המטריצה. לאחר ההתמצקות, ניתן להוציא את מבנה המטריגל מקצה הפיפטה. מבני סטרומה של טחול אשר מתורבתים במבחנה יוצרים מבנים אורגנואידים כדוריים תלת ממדיים.
אורגנואידים מציגים מבנה לא חלול עם תאים נוכחים לאורך כל קוטר הרקמה. הם מורכבים משלוש אוכלוסיות תאים רחבות, כולל תאי דם לבנים, תאי דם אדומים ותאי סטרומה ואנדותל שאינם המופויאטיים. מבנים יכולים גם להיות מושתלים מתחת לכמוסת הכליה למחקרי התחדשות רקמות.
לאחר ארבעה שבועות ניתן להבחין במבנה מסודר של רקמת הטחול, כולל עורקים מרכזיים, זקיקי תאי B, תאים רשתית פיברובלסטיים, תאים מיאלואידים של מוך השן האדום, מקרופאגים מטלופיליים באזור השוליים, סינוסיואידים של מוך השן האדום ורשתות תאים דנדריטיים פוליקולריים, אזור תאי T, מקרופאגים של מוך השן האדום ותאים רשתית באזור השוליים. בעת ניסיון צבירת תאים ואנקפסולציה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ולשמור את כל החומרים על קרח. השלב החשוב ביותר להשתלות הוא הוצאת תקע המטריגל תוך משיכת קצה הפיפטה מהכליה.
יש להקפיד לא לנקב את קרום הקפסולה או לקרוע את פרנכימה בכליות. פרוטוקול זה שימש לחקר הדרישות לשתי אוכלוסיות תאי סטרומה בהתחדשות רקמת הטחול. בניסוי מייצג זה, רק צברים שהתרוקנו מתאים שליליים MAdCAM חיוביים לגורם גדילה שמקורם בטסיות דם לא הצליחו ליזום צמיחת רקמות, דבר המצביע על כך שאוכלוסיית תאים מסוימת זו חיונית להתחדשות הטחול.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לאגרגציה ואנקפסולציה של תאי טחול בתוך מטריקס חצי-מוצק של קרומ הבסיס. ניתן להשתמש בטכניקה זו לתרבית תלת-ממדית לצורך חקר התפתחות אורגנואידים, או למחקרים של השתלה in vivo והסקי של רקמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אגרגציה של תאים
- הנדסת רקמות
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- הפרוטוקול מאפשר את הכמוסת התאים במטריצה חצי-מוצקה.
- ניתן ליישמו על סוגים ומספרים שונים של תאים.
- שיטה זו חשפה סוגי תאים ספציפיים הנחוצים לה regeneration של הטחול.
- היא משמשת כפלטפורמה למחקרי הנדסת רקמות רחבים יותר.
מטרת המחקר
- לאגרגציה ומסגור של תאי טחול בתוך מטריצת קרומב בסיס (basement membrane matrix).
- לאפשר תרבית תלת-ממדית במבחנה (in vitro).
- לאפשר ניסויי השתלה בתוך הגוף (in vivo).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אגרגציה של תאי טחול.
- כלילה בתוך מטריקס של קרומי בסיס חצי-מוצק.
- שימוש במתודולוגיה ובציוד פשוטים.
- יישום על סוגי תאים שונים.
תוצאות עיקריות
- אגרגציה וכמיסה מוצלחות של תאי טחול.
- זיהוי סוגי תאים ספציפיים הדרושים לרגנרציה של הטחול.
- פוטנציאל לחשיפת רגולטורים נוספים של רגנרציה של רקמות.
- ביסוס פלטפורמה למחקרי הנדסת רקמות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה פשוטה לאגרגציה של תאים.
- יש לו השלכות על הבנת התחדשות רקמת הטחול.
- טכניקה זו עשויה לשפר מחקרים עתידיים בהנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אגרגציה של תאים המעטופים במטריקס של קרומי בסיס מאפשרת חקירה מבוקרת של הדרישות התאיות ליצירת רקמת טחול של עכברים, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי. פלטפורמה זו מספקת ביטחון חיזוי לזיהוי אוכלוסיות תאי סטרומה חיוניות ברגנרציה של רקמות, ומספקת מידע ישיר לאישור מטרות ולאסטרטגיות של הנדסת רקמות. יכולת ההסתגלות של השיטה הן לתרבית אורגנואידים in vitro והן להשתלה in vivo ממצבת אותה כיכולת רב-פעמית עבור פורטפוליו של מו"פ ברפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של המנגנונים התאיים העומדים בבסיס התחדשות רקמת הטחול.
- תומך בתיקוף תפקודי של אוכלוסיות תאי סטרומה הקריטיות לאורגנוגנזה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים באמצעות בידוד ובדיקה של סוגי תאים ספציפיים.
- מספק פלטפורמה למחקרים מונחי-השערה על דרישות ליצירת רקמה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות אורגנואידים תלת-ממדיות שעברו תיקוף לצורך אנליזות המשך.
- מייצב את התהליכים של כיסוי (encapsulation) ואגרגציה להשגת מבני רקמה הניתנים לשחזור.
- מפיק פלטים כמותיים על מבנה האורגנואיד וההרכב התאי.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של תרומות אוכלוסיות תאים ליצירת רקמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישם התאמה בין מודלים במבחנה (in vitro) ומודלים בתוך הגוף (in vivo) להבטחת רצף תרגומי בהנדסת רקמות.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של אסטרטגיות רגנרטיביות המבוססות על תוצאות רקמתיות תפקודיות.
- מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר רגנרציה של איברי מערכת החיסון.
- מסייע בזיהוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים הקשורים ליצירה מוצלחת של רקמה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת הכמיסה והאגרגציה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, הסריקה והתיקוף הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למניפולציה מבוקרת ולהערכה של אוכלוסיות תאים הן במודלים של אורגנואידים והן במודלים של השתלה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מניעים תאיים של התחדשות רקמת הטחול.
- סריקה: מספקת מבני אורגנוידים כמותיים וניתנים לשחזור למחקרים השוואתיים.
- אנליטיקה: מספקת פלטיים מדידים על ארכיטקטורת הרקמה ותרומות של סוגי תאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים in vitro ליצירת רקמה in vivo ולתוצאות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לתוכניות מגוונות של הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באוכלוסיות תאי מטרה עבור רגנרציה של רקמות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של אנקפסולציה ואגרגציה לצורך תהליכי עבודה הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go לקידום אסטרטגיות רגנרטיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון של גישות להנדסת רקמות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של בידוד תאים, אנקפסולציה (encapsulation) וגידול אורגנואידים.
- נדרשת גישה לצנטריפוגה, עבודה בסטריליות וציוד להשתלה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח שחזוריות בין ניסויים שונים.
- ניתן להתאימו לסוגי תאים ומודלים של רקמות שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר הוא חיוני כדי למנוע נזק לרקמה או לאיבר במהלך שלבי ההשתלה.
