Name: בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני במורד הזרם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני. השיטה מאפשרת לחקור את הרכב התאים והפרופילים התעתיקיים הספציפיים של IMAT במחלות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לבריאן ברגמן, PhD מאוניברסיטת קולורדו על שסיפק את התמונה של ביופסיית IMAT באיור 1C ממחקר MoTrIMAT (R01AG077956). אנו אסירי תודה על מחקר השרירים, הניידות וההזדקנות המספק את מדגם IMAT שממנו מוצגים הנתונים בסעיף התוצאות המייצגות. המכון הלאומי להזדקנות (NIA) מימן את המחקר של שרירים, ניידות והזדקנות (SOMMA; R01AG059416) והמחקרים הנלווים שלה SOMMA AT (R01AG066474) ו- SOMMA Knee OA (R01AG070647). התמיכה בתשתית המחקר מומנה בחלקה על ידי NIA Claude D. Pepper Older American Independence Centers באוניברסיטת פיטסבורג (P30AG024827) ואוניברסיטת ווייק פורסט (P30AG021332) והמכונים למדע קליני ותרגומי, שמומנו על ידי המרכז הלאומי לקידום מדע תרגומי, באוניברסיטת ווייק פורסט (UL1 0TR001420).

בידוד גרעיני תא בודד מ- IMAT לחקר פרופילי ביטוי גנים 

<ol><li>Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+adipose+tissue+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intermuscular adipose tissue in metabolic disease.</a> Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).</li>
<li>Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+significance+of+intermuscular+adipose+tissue%3A+Is+IMAT+a+friend+or+a+foe+to+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health.</a> Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).</li>
<li>Gallagher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+muscle%3A+A+novel+depot+similar+in+size+to+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue.</a> Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).</li>
<li>Manini, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+physical+activity+increases+intermuscular+adipose+tissue+in+healthy+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults.</a> Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).</li>
<li>Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+fat%3A+A+review+of+the+consequences+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intermuscular fat: A review of the consequences and causes.</a> Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Sachs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+adipose+tissue+directly+modulates+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).</li>
<li>Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+heterogeneity+in+the+single-cell+era%3A+From+mice+and+humans+to+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle.</a> Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+bulk+RNA+sequencing+reveal+cellular+and+transcriptional+mechanisms+underlying+lipid+dynamics+in+high+marbled+pork%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Sci+Food%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork.</a> NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+diverse+cell+populations+in+skeletal+muscles+and+biomarkers+for+intramuscular+fat+of+chicken+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).</li>
<li>Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+heterogeneity+of+cultured+bovine+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells.</a> Front Genet. 12, 742077(2021).</li>
<li>Fitzgerald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MME%2B+fibro-adipogenic+progenitors+are+the+dominant+adipogenic+population+during+fatty+infiltration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle.</a> Commun Biol. 6 (1), 111(2023).</li>
<li>Cummings, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+muscle%2C+mobility+and+aging+%28SOMMA%29%3A+A+unique+cohort+study+about+the+cellular+biology+of+aging+and+age-related+loss+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).</li>
<li>Whytock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+frozen+human+subcutaneous+adipose+tissue+for+full-length+single-nuclei+transcriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).</li>
<li>10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf">https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf</a> (2022).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictionary+learning+for+integrative%2C+multimodal+and+scalable+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis.</a> Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).</li>
<li>McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoubletFinder%3A+Doublet+detection+in+single-cell+RNA+sequencing+data+using+artificial+nearest+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors.</a> Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biol. 21 (2), 57(2020).</li>
<li>Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data">https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data</a> (2022).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Whytock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+full-length+transcriptome+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+reveals+unique+and+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations.</a> iScience. 25 (8), 104772(2022).</li>
<li>Probst, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+full-length+transcript+single+cell+mRNA+sequencing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols.</a> BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).</li>
<li>CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf">https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf</a> (2018).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transcript+enrichment+and+detection+bias+in+single-nucleus+RNA-seq+for+mapping+of+distinct+human+adipocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages.</a> Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+of+cell+type+deconvolution+pipelines+for+transcriptomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data.</a> Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם מספר אתגרים מובנים בעבודה עם IMAT. בנוסף לנגישותו המוגבלת, התפוקה של חומר הדגימה היא לעתים קרובות נדירה מאוד, וכמעט בלתי אפשרי להימנע מ"זיהום" של שרירי השלד. כדי לקבל את הדגימה האיכותית ביותר, יש לחדור לשריר הפאשיה בעת החדרת מחט הביופסיה (כדי להקפיד שלא לאסוף רקמת שומן תת עורית) ולהסיר כמה שיותר רקמת שריר על ידי ניתוח הדגימה תחת מיקרוסקופ מיד לאחר האיסוף, ולאחר מכן עיבוד להיסטולוגיה, הקפאת הצמדה וכו'. זוהי השיטה הראשונה להשתמש בדגימות IMAT שנאספו באופן פרוספקטיבי ונותחו משרירי השלד. באופן השוואתי, נתוני snRNA-seq קודמים ב- IMAT עברו בידודים גרעיניים של תערובת של ביופסיות שרירי שלד עם הסננה שומנית ידועה ולא IMAT בלבד.
IMAT צפוף יותר באופיו בהשוואה לרקמות שומן תת עוריות, מה שהופך כתישה נכונה של הרקמה במהלך בידוד גרעינים חיונית לשחרור גרעינים ממבנה הרקמה. כתישה לא נכונה עלולה להוביל לתשואת גרעינים נמוכה יותר, שהיא שלילית עם כמות מוגבלת של רקמות. יתר על כן, חישוב מספר הגרעינים הנכון בתמיסת הגרעינים המוכנה הוא צעד קריטי כדי להבטיח מספיק גרעינים (אך לא רבים מדי) להעמיס על השבב ליצירת GEM. יותר מדי גרעינים, או נוכחות של אשכולות גרעינים גדולים או פסולת, יכולים לגרום לסתימה, להשפיע על ריכוז cDNA הסופי, ובסופו של דבר, על פלט הריצוף. עקיפת גושי גרעינים ופסולת בהכנת הגרעינים הבודדים קשה ומושפעת מאיכות הדגימה. ניתן להפחית את התגבשות הגרעינים ו/או נוכחות הפסולת על ידי הוספת שלב סינון נוסף עם מסננת התאים בגודל 30 מיקרומטר.
חשוב לעבד דגימות במהירות כדי להפחית את הסיכון לפירוק RNA. שמירה על תמיסות על קרח או מקורר במהלך כל השלבים האפשריים של בידוד גרעינים, כמו גם תוספת של כמות מספקת של מעכבי RNAse, יכולים למזער את ההתפרקות. בשל חשיבות זמן העיבוד של כל דגימה, המלצנו להריץ מקסימום שתי דגימות בכל פעם. יתר על כן, יש לטפל בתמיסת הגרעינים בזהירות כדי לא להפוך את הגרעינים לשבירים מדי. גרעינים שבירים רגישים להתפוצצות ביצירת GEM, מה שעלול לגרום לכמויות גדולות של RNA סביבתי בדגימה. בפרוטוקול זה, שלב הסינון באמצעות מזרק (המתואר בפרוטוקול STAR16) לא נכלל כדי לשמור על שלמות הגרעינים.
בחירת שיטת הכנת הספרייה תלויה בשאלת המחקר. עבדנו הן בגישה מבוססת טיפות והן בגישה של גרעינים בודדים מבוססי ננו-באר. הגישה מבוססת הננו-באר מציגה פרופילים של 1200-1600 גרעינים וכ-3000-6000 גנים שזוהו לכל גרעינים16. יתר על כן, גישה זו תומכת בשעתוק באורך מלא, המאפשר לחקור שונות מבנית, פסאודו-גנים וגרסאות splice27. לשם השוואה, ניתן ליצור פרופיל של יותר מ-10,000 גרעינים בגישה מבוססת טיפות, אך על חשבון מספר גנים נמוך יותר המתגלה לכל גרעין (נמוך פי 2-3). עבור פרוטוקול זה, בחרנו להשתמש באחת הפלטפורמות מבוססות הטיפות מכיוון שהמספר הגדול יותר של גרעינים בפרופיל נותן לנו יכולת גדולה יותר לזהות סוגי תאים נדירים עם שפע נמוך28.
המגבלה העיקרית של snRNA-seq היא אובדן התוכן הציטוסולי, המגביל את ניתוח הביטויים לתעתיקים גרעיניים. הגרעין מכיל פי 10-100 פחות mRNA מזה של תא29 כולו, מה שיכול להיות מדאיג לחשיפת כל סוגי התאים ברקמה. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה על ידי Gupta et al. מצא כי תעתיק גרעיני - בהשוואה לשעתוק תאים שלמים29 - זיהה אוכלוסיות תאים דומות ופרופילי ביטוי של גנים רלוונטיים ביולוגית בפראדיפוציטים בתרבית ובאדיפוציטים בוגרים. תוצאות דומות נמצאו בסוגי תאים אחרים30,31.
לבידוד גרעינים בודדים יש יתרונות במתן דפוסי ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד (sc) של תאים שבירים שאינם תואמים ל- scRNA-seq. יתר על כן, דגימות ביובנק קפואות ניתן להשתמש, בידוד גרעינים אינו דורש עיכול אנזימטי של הרקמה, אשר יכול לגרום לתגובת מתח בתאים, המשפיעים על transcriptome32. על ידי שימוש ב- snRNA-seq, הצלחנו לתעתק פרופיל אדיפוציטים וסוגי תאים אחרים הקיימים ב- IMAT, דבר שלא היה אפשרי עם scRNA-seq מכיוון שהאדיפוציטים עמוסים בשומנים ואינם תואמים לגישה מבוססת טיפות.
יישום חשוב של snRNA-Seq של IMAT הוא לפענח את הרכב התא ואת הבדלי השעתוק של IMAT במצבים מטבוליים משתנים. יתר על כן, ניתן להשתמש במערכי נתונים של snRNA-seq כדי לבטל את השימוש ב- RNA-seq בתפזורת ב- IMAT כדי להעריך הבדלים בהרכב התא בקנה מידה גדול יותר33. בנוסף, ניתוח פסאודו-זמן של נתוני snRNA-seq יכול לשמש לזיהוי מסלולים של התבגרות התא, אשר מעניין במיוחד רקמות כגון IMAT, שבו המקורות התאיים של האדיפוציטים הבוגרים עדיין שנויים במחלוקת.

רקמת שומן בין-שרירית (IMAT) היא מחסן שומן חוץ רחמי השוכן בין סיבי שרירוסביבם 1. כפי שתואר בפירוט בסקירה שנערכה לאחרונה על ידי Goodpaster et al., ניתן לזהות IMAT באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת ברזולוציה גבוהה (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI) (איור 1A,B) והוא נמצא סביב ובתוך סיבי שריר בכל הגוף1. כמות ה- IMAT משתנה מאוד בין אנשים ומושפעת מ- BMI, גיל, מין, גזע וישיבה 2,3,4. יתר על כן, תצהיר IMAT נראה בדרך כלל במצבים פתולוגיים הקשורים לניוון שרירים5, ומחקרים רבים תיעדו מסת IMAT מוגברת אצל אנשים עם השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, תסמונת מטבולית ותנגודת לאינסולין 6,7,8,9. עם זאת, התכונות הסלולריות והביולוגיות של IMAT רק מתחילות להיחשף. הנגישות המוגבלת והשונות במיקומים ובתוכן של IMAT בכל הגוף אתגרו את איסוף הדגימות ממחסן השומןהייחודי הזה 2. יתר על כן, דגימות "מזוהמות" בקלות בשרירי השלד (SM) בעת האיסוף, מה שהופך את ההפרדה בין התרומה הביולוגית מהרקמות השונות לקשה לפענוח (איור 1C). לשם כך, ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA-seq), שזכה לתשומת לב רבה בעשור האחרון, משמש כמתודולוגיה אידיאלית המאפשרת הפרדה של דפוסי ביטוי גנים שמקורם ב-IMAT וב-SM ברזולוציה של תא יחיד. יתר על כן, בידוד גרעינים שימושי במיוחד עבור רקמת שומן בשל אדיפוציטים גדולים עמוסי שומנים, אשר בלתי אפשרי לנתק לתוך תרחיף תא יחיד מבלי לפגוע בשלמות התאים. לבסוף, טכנולוגיה זו טומנת בחובה פוטנציאל לגלות סמנים חדשים של אדיפוציטים ספציפיים ל- IMAT ולחשוף את ההרכב והנוכחות של אוכלוסיות תאי אב שונות, כמו גם לחקור את השונות של הרכב התא בתנאים פתולוגיים ונורמליים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig01.jpg"> איור 1: תמונות של IMAT. תמונת תהודה מגנטית מייצגת (MRI) של IMAT מ (A) נקבה רזה בגיל העמידה ו (B) זכר בגיל העמידה עם השמנת יתר. אדום: רקמת שומן תת עורית, צהוב: רקמת שומן בין-שרירית, ירוק: שריר השלד, כחול: עצם. התמונה באדיבות הת'ר קורנל, מכון המחקר התרגומי AdventHealth. (C) דגימת רקמה טרייה עם IMAT (מוקפת בקו שחור מקווקו). התמונה באדיבות מייגן הוף, מכון המחקר התרגומי AdventHealth ובריאן ברגמן, אוניברסיטת קולורדו. נתון זה שונה באישור Goodpaster et al.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מספר מחקרים פורסמו מתעשיית בעלי החיים וחקרו את גידול הבשר (IMAT בפרט) בחזירים, תרנגולות ובקר באמצעות תא יחיד (sc) ו-snRNA-seq10. מחקרים אלה זיהו מספר תת-אוכלוסיות של אדיפוציטים וסמנים של תאי אב פוטנציאליים של IMAT 11,12,13; עם זאת, לא ידוע אם הרכבים תאיים אלה מיתרגמים ל- IMAT אנושי. למיטב ידיעתנו, רק מחקר אחד בדק את ההטרוגניות התאית של שריר אנושי עם הסננה שומנית, המתקבלת מחולים גברים עם דלקת מפרקים ניוונית בירך, באמצעות snRNA-seq14. החוקרים דיווחו על אוכלוסיית אדיפוציטים קטנה ועל מספר תת-אוכלוסיות של אבות פיברו-אדיפוגניים (FAP) בתוך האוכלוסייה הגדולה של מיונוקליי14. המחקר שלנו הוא הראשון שפיתח שיטה לחקור ישירות IMAT שנותח ידנית משריר אנושי להרכב תאי באמצעות snRNA-seq.
חשוב לציין, פרוטוקולים עבור snRNA-seq צריכים להיות מותאמים אישית עבור הרקמה הספציפית שנחקרה, שכן כמות הרקמה הזמינה והתכונות הפיזיות של הרקמה הספציפית יכתיבו את שלבי העיבוד האופטימליים. תפוקת הרקמה עבור IMAT היא בדרך כלל קטנה, לעתים קרובות לא עולה על 50 מ"ג, גם בעת ביצוע ביופסיות מונחות אולטרסאונד. לפיכך, עיבוד נכון של רקמה נדירה זו הוא חיוני. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה ישמש משאב רב ערך לחוקרים החוקרים IMAT אנושי.

<table><tbody><tr><td>0.2 ומיקרו; מסנני מזרק קורנינג M&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431229</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל DNA LoBind צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>צינורות בעלי קשירה נמוכה</td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>100X מעכב פרוטאז</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>10X מפריד מגנטי</td><td>10X גנומיקה</td><td>230003</td><td></td></tr><tr><td>10X מתאם מערבולת</td><td>10X 10X גנומיקה</td><td></td><td></td>330002</tr><tr><td>צינורות קנוניים 15 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,54,502</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,47,254</td><td></td></tr><tr><td>CellRanger</td><td>Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chromium iX ערכת גישה</td><td>10X גנומיקה</td><td>PN1000323</td><td></td></tr><tr><td>בקר Chromium iX</td><td>10X גנומיקה</td><td>PN1000326</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM שבב G ערכת תא יחיד&nbsp;</td><td>10X גנומיקה</td><td>PN1000127</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכת חרוזי ג'ל v3.1&nbsp;</td><td>10X גנומיקה</td><td>PN1000129</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM ערכת GEM תא יחיד v3.1</td><td>10X גנומיקה</td><td>PN1000130</td><td></td></tr><tr><td>רוזנת 3 מונה תאים אוטומטי</td><td>תרמו פישר AMQAX2000</td><td></td><td>מונה תאים אוטומטי</td></tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים רוזנת תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DoubletFinder</td><td>R&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס כפול TT Set A, 96 rxns</td><td>10X גנומיקה</td><td>PN1000215</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN2000048</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>Corning Life Science</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>Corning Life Science</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>גליצרין (גליצרול), 50% (v/v) תמיסה מימית</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>Library Construction Kit v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000196</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30&micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Nexus Gradient Thermal</td><td>cycler Eppendorf</td><td>6331000017</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mortar and pestel</td><td>לוגיסטיקה של שירותי בריאות&nbsp;</td><td>14075</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Ready Probes Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water (לא מטופל ב-DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Probumin בקר סרום אלבומין ללא חומצות שומן, אבקת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>820024</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB Qiagen</td><td></td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNAse ריבולוק</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>R&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SUPERasin 20 U/&micro; L</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AM2695</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>5382000015 הומוגנייזר רקמות</td><td>Glass-Col</td><td>099C K54</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC327372500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Gibco</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף rna חד-גרעיני במורד הזרם

Isolation of Nuclei from Human Intermuscular Adipose Tissue and Downstream Single-Nuclei RNA Sequencing

רקמת שומן בין-שרירית (IMAT) היא מחסן שומן לא נחקר יחסית הממוקם בין סיבי שריר. תוכן IMAT עולה עם הגיל וה- BMI וקשור למחלות מטבוליות וניווניות שרירים; עם זאת, הבנה של התכונות הביולוגיות של IMAT ויחסי הגומלין שלו עם סיבי השריר שמסביב חסרה מאוד. בשנים האחרונות, ריצוף RNA חד-תאי וגרעיני סיפק לנו אטלסים ספציפיים לסוג התא של מספר רקמות אנושיות. עם זאת, ההרכב התאי של IMAT אנושי נותר במידה רבה לא נחקר בשל האתגרים המובנים של נגישותו מאיסוף ביופסיה בבני אדם. בנוסף לכמות המוגבלת של רקמות שנאספות, עיבוד IMAT אנושי מסובך בשל קרבתו לרקמת שריר השלד והפאשיה. האופי עמוס השומנים של האדיפוציטים הופך אותו לבלתי תואם לבידוד של תא יחיד. לפיכך, ריצוף RNA של גרעינים בודדים הוא אופטימלי להשגת שעתוק ממדי גבוה ברזולוציה של תא בודד ומספק את הפוטנציאל לחשוף את הביולוגיה של מחסן זה, כולל ההרכב התאי המדויק של IMAT. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד גרעינים והכנת ספרייה של IMAT אנושי קפוא לריצוף RNA של גרעינים בודדים. פרוטוקול זה מאפשר יצירת פרופיל של אלפי גרעינים בגישה מבוססת טיפות, ובכך מספק את היכולת לזהות סוגי תאים נדירים ובעלי תפוצה נמוכה.

זרימת עבודה זו תוכננה להנחות את העיבוד של דגימות IMAT אנושיות קפואות כדי להשיג פרופילי ביטוי גנים ברזולוציית גרעינים יחידים, המאפשרים זיהוי סוג תא. כאן מוצג מדגם IMAT מייצג אחד ממשתתף במחקר SOMMA.
הצעד הראשון של כל ניתוח של נתוני snRNA-seq הוא להעריך את איכות הנתונים כדי לזהות גרעינים באיכות ירודה, אשר יש להסיר פוטנציאלית ממערך הנתונים. חשוב לציין, שלבי הסינון וערכי הסף צריכים להיקבע עבור סוג המדגם ומערך הנתונים הספציפיים שיש לך ביד, מכיוון שהמדדים המוערכים בדרך כלל יכולים להיות שונים בין רקמות וסוגי תאים22,23. איור 4A מספק חזותיים של כמה ממדדי המפתח המשמשים להערכת האיכות של נתוני snRNA-seq שנוצרו. מספר הגנים המתגלים בכל גרעינים תלוי בעומק הריצוף ובסוג התא, אך צפוי להיות מעל 200 עבור גרעינים באיכות טובה18,23. נמצא כי הנתונים המופקים באמצעות פרוטוקול זה נמצאים בטווח הצפוי עם חציון של 1134 גנים לגרעינים, מתוך סך של 4662 גרעינים.
אחוז הקריאות במיטוכונדריה מוערך מכיוון שרמה גבוהה של זיהום מיטוכונדריאלי יכולה לנבוע מגרעינים פגומים או RNA סביבתי המתחברים לגרעינים, מה שמצביע על גרעינים באיכות ירודה. במערך הנתונים המוצג כאן, נמצא אחוז קריאה מיטוכונדריאלי חציוני של 2.65, שהוא הרבה מתחת לסף 5%-20% הנפוץ בספרות 24,25,26. אחוז הקריאות הריבוזומליות שונה בין סוגי תאים ורקמות. עם זאת, מכיוון שחלק גדול מהגנים הריבוזומליים יכולים להשפיע על קיבוץ הנתונים, מומלץ לבדוק את אחוז הקריאה הריבוזומלית ואולי להסיר גנים ריבוזומליים או גרעינים עם רמות גבוהות של גנים ריבוזומליים ממערך הנתונים לפני האשכולות. הנתונים שנוצרו עם פרוטוקול זה הראו רמה נמוכה של קריאות ריבוזומליות עם חציון של 2.46% ומקסימום של 16.5%, ולכן לא סיננו על סמך מדד זה. לבסוף, ציון סיבוכיות התא חושב בהתבסס על יומן(10) מספר הגנים שזוהו חלקי מספר הלוגים(10) של הקריאות שזוהו. גרעינים באיכות טובה צפויים להיות מעל 0.8, וחציון של 0.92 התקבל במדגם ששימש במחקר זה. בהתבסס על מדדי QC אלה, ניתן להחליט אילו גרעינים לסנן מתוך מערך הנתונים. לצורך הניתוח, בחרנו לסנן גרעינים עם פחות מ-200 או יותר מ-10,000 גנים לכל גרעינים, יותר מ-10% קריאות מיטוכונדריאליות וציון מורכבות נמוך מ-0.8.
לאחר שלב הערכת האיכות והסינון הראשוני, ניתן ליצור UMAP כדי להמחיש קיבוץ אשכולות של הגרעינים. האשכולות בוצעו על בסיס 2000 הגנים המשתנים ביותר באמצעות טרנספורמציית SCT. ניתן להשתמש בשלבי האשכולות הראשוניים כדי לבדוק אם אחת מתכונות ה-QC מתקבצת יחד, למשל, גרעינים עם קריאות מיטוכונדריאליות גבוהות. יתר על כן, מידע אשכולות נדרש עבור כמה שיטות זיהוי כפול, כולל DoubletFinder20, אשר שימש בפרוטוקול זה. נעשה שימוש ב-DoubletFinder עם שיעור מכפיל צפוי שנקבע ל-4.8% כפי שהציעו ספקי הפלטפורמה מבוססת הטיפות. לאחר הסרה כפולה, הוערכה רמת זיהום ה-RNA הסביבתי, תופעה שכיחה במיוחד בתכשירים של גרעינים בודדים, שכן ה-RNA משתחרר מהציטופלסמה עם ליזה התא ומוזרם לתוך ג'ל חרוזים בתחליב (GEMs) ומוגבר בשלבי הכנת הספרייה הבאים. לפיכך, פותחו מספר כלים לתיקון הבעיה האינהרנטית של זיהום RNA סביבתי (ראה טבלה 3). השתמשנו בחבילת R decontX21, שבה מטריצת הרקע הגולמי (הכוללת רק טיפות ריקות) משמשת להתאמת מטריצת ביטוי הגנים, ובכך משפרת את חתימת ביטוי הגנים האמיתית.
ההתקבצות והיכולת לזהות סוגי תאים בשפע נמוך תלויים במספר הגרעינים. מחקר זה זיהה את כל סוגי התאים העיקריים הצפויים ב-IMAT (איור 4B) מתוך סך של 3817 גרעינים לאחר סינון QC, הסרה כפולה והתאמת רנ"א סביבתי. אלה כללו תאי גזע, אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואדיפוציטים בוגרים, כמו גם פריציטים, תאי שריר חלק, תאי חיסון, תאי אב שריר ומיונוצלי מזיהום תאי שריר השלד.
בסך הכל, הוכחנו כי פרוטוקול זה מייצר נתוני גרעינים בודדים ברזולוציה גבוהה המאפשרים זיהוי של ביאור סוג התא החשוב לפענוח הביולוגיה והמקורות התאיים של IMAT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig04.jpg"> איור 4: הערכת איכות, קיבוץ באשכולות וביאור סוג תא של נתוני ריצוף. (A) תרשימי כינור של מדדים חיוניים להערכת ביצועי הדגימה והריצוף, כולל מספר הגנים שזוהו לכל גרעינים, אחוז הקריאות במיטוכונדריה, אחוז הקריאות הריבוזומליות ומורכבות התא שנמדדה כמספר הלוגים(10) של הגנים שזוהו חלקי מספר הקריאות log(10) שזוהו. ערכי החציון עבור כל מדד ניתנים בתיבות סגורות. סה"כ גרעינים: 4662. (B) UMAP המציג אשכולות של גרעינים בודדים ו- DotPlot המתאים המציג ביטוי גנים יחסי של גנים סמן מסוג תא עבור כל אשכול לאחר סינון. מספר גרעינים: 3817. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: הקוד לניתוח QC ואשכולות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/Supplementary_File_1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

הביולוגיה של רקמת השומן הבין-שרירית (IMAT) לא נחקרה במידה רבה בשל הנגישות המוגבלת של רקמת האדם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד גרעינים והכנת ספרייה של IMAT אנושי קפוא לריצוף RNA של גרעינים בודדים כדי לזהות את ההרכב התאי של מחסן שומן ייחודי זה.

בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני במורד הזרם

Intermuscular adipose tissue (IMAT) is a relatively understudied adipose depot located between muscle fibers. IMAT content increases with age and BMI and ...

קבוצת המחקר שלנו מנסה להבין את הרכב התא ואת פרופילי השעתוק הספציפיים לתאים של רקמת שומן בין-שרירית או IMAT בבני אדם. IMAT הוא למעשה מחסן שומן חוץ רחמי השוכן בין סיבי שריר וסביבם. טומוגרפיה ממוחשבת ו- MRI הצליחו לכמת נפח IMAT והראו לאחרונה כי הוא עולה הן עם הגיל והן עם ה- BMI, והוא קשור גם למחלות ניווניות שרירים.מחקרי הפרשה חוץ גופית הראו לאחרונה כי לחלבונים המופרשים ב- IMAT יש יכולת להשפיע על רגישות לאינסולין, על פרופילים דלקתיים וגם על ביטויי חלבונים מתכווצים בשרירי השלד האנושי. הכמות המוגבלת של רקמת IMAT שנאספה במהלך ביופסיות והאופי עמוס השומנים של האדיפוציטים הופכים רקמה זו לבלתי תואמת לעיכול רקמות ולרנ"א של תא בודד. לכן, רצינו לפתח פרוטוקול שמבצע בידוד גרעינים על כמויות קטנות של רקמה שניתן להשתמש בו במורד הזרם של RNA-Seq של גרעינים בודדים.פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לקבוע את שינויי השעתוק המורכבים והספציפיים לתאים המתרחשים ב- IMAT במצבי מחלה מטבוליים שונים ובתגובה להתערבויות. אנו מקווים שמידע זה יהיה חיוני בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות שיסייעו להקל על מחלות מטבוליות על ידי התמקדות ישירה ב- IMAT או בגורמים המופרשים שלו. בתחום חסרים מאוד נתונים על הביולוגיה של IMAT, מקורותיו התאיים, ותקשורת עם תאים אחרים, השוכנים הן בתוך IMAT והן מחוצה לו, כמו גם תגובותיו המולקולריות להתערבויות באורח החיים, כגון דיאטה ופעילות גופנית או טיפול תרופתי.כל אלה הן שאלות מחקר מרכזיות עבור הקבוצה שלנו.

isolation-nuclei-from-human-intermuscular-adipose-tissue-downstream

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

הטרוגניות תוך-גידולית היא תכונה אינהרנטית של גידולים, כולל גליומות. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בשילוב של חוצצים וצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות למחקרי רצף גרעין יחיד ו- ATAC.

בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמות כבד מוקפאות בהבזק, בארכיון עבור RNA-seq, ATAC-seq ומולטיומיקה של מפרקים (RNA-seq ו-ATAC-seq).

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

אנו מדווחים על הליך לבידוד RNA עם שלמות גבוהה מלבלב העכבר העשיר בריבונוקלאז.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

למדו פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני. השיטה מאפשרת לחקור את הרכב התאים והפרופילים התעתיקיים הספציפיים של IMAT במחלות מטבוליות.

בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני במורד הזרם

גלה סרטונים נוספים