Name: הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: חקור שיטה להנדסת תאים דמויי מיקרוגליה ממונוציטים אנושיים לחקר דלקת מוח והפרעות נוירופסיכיאטריות. מודל תאי זה מאפשר הערכה דינמית של תפקוד מיקרוגליה ומגשר על פערים בין נתוני חיות למחלה אנושית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקי הסיוע הבאים למחקר מדעי: (1) האגודה היפנית לקידום המדע (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 JP22H00494 ל- TAK, JP22H03000 ל- M.O.); (2) הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED; JP21wm0425010 ל- TAK, JP22dk0207065 ל- M.O.) ו-(3) הסוכנות היפנית למדע וטכנולוגיה CREST (JPMJCR22N5 ל-TAK). הגופים המממנים לא לקחו על עצמם כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתבי היד. ברצוננו להודות ל-Editage (www.editage.jp) על העריכה בשפה האנגלית.

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת קיושו ועמד בכל הוראות הצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים, כולל מתנדבים בריאים וחולים, לנתח את דמם ולפרסם את נתונם. החומרים והציוד מפורטים בטבלת החומרים, והרכבי הפתרונות מפורטים בטבלה 1.
1. הכנת מדיה ובופרים לניסויים
<ol><li>הכינו את מדיום הבידוד על ידי תוספת RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (56°C, 30 דקות) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>הכינו את מאגר הבידוד על ידי השלמת תמיסת החיץ הבסיסית בתמיסת אלבומין בסרום בקר 0.5% (BSA) ועיקרו אותה באמצעות סינון (0.22 מיקרומטר).</li>
</ol>2. בידוד תאים חד-גרעיניים מדם שלם
<ol><li>העבר 15 מ"ל ממדיום שיפוע הצפיפות לצינור צנטריפוגה הדרגתי בצפיפות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב- 1,000 × גרם למשך דקה אחת ב- 20 ° C. הערה: בודד 15 מ"ל דם לכל צינור צנטריפוגה הדרגתי בצפיפות של 50 מ"ל. הגדל את מספר הצינורות כאשר נפח הדם גבוה.</li>
	<li>הומוגניזציה של הדם שנאסף בצינורות הפרין על ידי היפוך ולהסיר את המכסה מצינור איסוף הדם עם פינצטה מעוקרת אש.</li>
	<li>יש לחלק נפח שווה (10-15 מ"ל) של דם למדיום שיפוע הצפיפות בצינור הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות.</li>
	<li>הגדר את רמת ההאטה של הצנטריפוגה ל- 1 מתוך 4 רמות ואת הצנטריפוגה ל- 1,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: בקצב האטה זה, מהירות סיבוב של 180 × גרם (1,000 סל"ד) נעצרת תוך 3 דקות.</li>
	<li>הכינו מספר שווה של צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל כמו צינורות הצנטריפוגות ההדרגתיות בצפיפות 50 מ"ל ומלאו כל צינור ב-10 מ"ל PBS (−).</li>
	<li>הסירו את שכבת הפלזמה העליונה עד כ-1 ס"מ מעל המעיל הנפוח לאחר הצנטריפוגה. הערה: יש להכניס פיפטה שואפת אנכית לתוך הצינור ולשאוף בזהירות ממרכז משטח הנוזל. אין לשאוף יתר על המידה כדי לא להפריע למעיל הבאפי.</li>
	<li>דקנו את כל הסופרנאטנט שנותר מצינור הצנטריפוגה בצפיפות של 50 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 10 מ"ל של PBS (−).</li>
	<li>אפס את רמת ההאטה של הצנטריפוגה ל-3 מתוך 4 רמות, ואת הצנטריפוגה ל-250 × גרם למשך 10 דקות ב-RT. במהלך שלב זה, הכינו צינור צנטריפוגה אחד של 50 מ"ל ושני צינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל ומסננת תאים של 100 מיקרומטר.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, לקבוע את הטמפרטורה של הצנטריפוגה ב 4 °C (75 °F). חפשו גלולה לבנה עם פריפריה אדומה בתחתית צינור הצנטריפוגה. מוציאים את הסופרנאטנט בשאיפה ומשחררים את הגלולה בעדינות על ידי הקשה.</li>
	<li>מקם מסננת תאים של 100 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת אש.</li>
	<li>שלבו 13 מ"ל של אמצעי בידוד באחד הצינורות הצנטריפוגיים ושטפו את הדופן הפנימית כדי לאסוף את התאים כראוי. קח את מתלה התא ושטוף את הצינורות הצנטריפוגות הנותרים באופן רציף. לאחר איסוף התאים מכל הצינורות, מסננים את תרחיף התא דרך מסננת תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. הערה: יש לקרר את אמצעי הבידוד לאורך כל תהליך הבידוד (שלבים 2.11-2.16).</li>
	<li>שטפו כל צינור שוב עם 13 מ"ל של אמצעי בידוד כמתואר בשלב 2.11. לאסוף סך של 26 מ"ל של השעיית התא.</li>
	<li>יש לחלק כמויות שוות לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל, לספור את התאים ולחשב את הריכוז המתאים של מאגר בידוד (60 מיקרוליטר חיץ לכל 107 תאים בסך הכל) לשלב 2.16. הערה: עדיף לעבוד עם הצינור החרוטי של 15 מ"ל מכיוון שנפח הנוזל קטן והנוזל מבעבע בקלות בעת פיפטציה בשלב 2.16.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>במהלך הצנטריפוגה, יש לחטא היטב את המעמד המגנטי (במיוחד את החלק הבא במגע עם העמוד) באתנול 70% ולהניח אותו על הספסל לייבוש באוויר. שמור את מאגר הבידוד על קרח.</li>
	<li>הסר את הסופרנאטנט על ידי שאיפה (בשלב זה, חפש כדורים אדומים ~ 1 מ"מ עובי בגלל נוכחות של כדוריות דם אדומות), להוסיף את הכמות המתאימה של חיץ בידוד, ולשחרר את הגלולה בעדינות על ידי pipetting ~ 20x.</li>
</ol>3. בידוד מונוציטים באמצעות מיקרו-כדוריות CD11b
<ol><li>מערבולת מגיב חסימת FcR אנושי למשך 10 שניות לפני היישום. לשלב את הכמות הנדרשת של מגיב (20 μL של מגיב חוסם FcR לכל 107 תאים סה"כ) ולדגור בתא ב 4 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>מערבול את microbeads CD11b במשך 10 שניות לפני היישום. שלבו את הכמות הנדרשת של מגיב (20 מיקרו-כדוריות CD11b לכל 107 תאים בסך הכל), ודגרו בתא של 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות תוך כדי תסיסה ידנית כל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של חיץ בידוד, להשהות על ידי pipetting עדין, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>במהלך הצנטריפוגה, הניחו את העמוד המגנטי על המעמד המגנטי ושטפו אותו עם 3 מ"ל של מאגר בידוד. הערה: הימנע מלגעת בחלק המגנטי של העמוד ומקם את העמוד כראוי. אם בועות נכנסות לעמודה, הסר אותן עם פיפטה. חיץ הבידוד מחויב להיות מצונן לאורך כל תהליך הבידוד (שלבים 3.4-3.9).</li>
	<li>הסר את הסופרנאטנט שלאחר הצנטריפוגה על ידי שאיפה, שלב 1 מ"ל של חיץ בידוד, ערבב על ידי פיפטינג בעדינות, ולהחיל את המתלה על העמוד.</li>
	<li>שטף את העמודה 3x על-ידי הוספת 3 מ"ל של מאגר בידוד בכל פעם שמאגר העמודות ריק.</li>
	<li>מניחים את העמוד בצינור חרוטי של 15 מ"ל מבלי לגעת בחלק המגנטי; לשלב 5 מ"ל של חיץ בידוד לתוך העמוד ולאלץ את הנוזל החוצה דרך העמוד עם בוכנה מוכנס לתוך הצינור.</li>
	<li>צנטריפוגה את תרחיף התא שנאסף בצינור ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את התאים בתווך בידוד. מכיוון ש~5-10% ממספר התאים שנספרו בשלב 2.13 ישוחזרו, התאימו את נפח התרחיף בהתאם למספר התאים. הערה: יש להשתמש במדיום בידוד ב-RT ולא לחמם אותו כדי למנוע שינוי טמפרטורה מהיר מ-4°C.</li>
	<li>לספור את התאים ו aliquot 500 μL של תרחיף תאים לתוך כל באר של לוחות 24 באר בריכוז של 40 × 104 תאים / מ"ל ולדגור לילה. הערה: יש לצבוע את מתלי התאים בהתאם לנפח הזריעה המותאם הנדרש עבור לוחות שונים. לדוגמה, 1 מ"ל עבור באר אחת בצלחת 12 בארות ו 250 μL עבור באר אחת בשקופית תא 8 באר.</li>
	<li>לבסוף, יש להשליך או לחטא את הציוד המזוהם בהתאם למדיניות הטיפול בפסולת זיהומית שנקבעה על ידי המתקן.</li>
</ol>4. אינדוקציה של תאי iMG ממונוציטים
<ol><li>הכינו את מדיום האינדוקציה על ידי תוספת מדיום השראות בסיסי עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1%, 10 ננוגרם/מ"ל רקומביננטי אנושי GM-CSF ו-100 ננוגרם/מ"ל IL-34 אנושי רקומביננטי.</li>
	<li>החליפו את אמצעי הבידוד מהזריעה של היום הקודם בתווך אינדוקציה. הטו את הצלחת קדימה ושאפו מיד את התווך המדולדל מהקצה הקדמי של תחתית הבאר בעזרת פיפטה של פסטר. החלף את המדיום בקצב של מקסימום 1 צלחת (= 24 בארות) בכל פעם, ומיד לשלב 500 μL של מדיום אינדוקציה בעדינות. הערה: יש לבחור מונוציטים מודבקים בשלב זה.</li>
	<li>לדגור על התאים במשך 14 יום כדי להשלים את הזירוז.</li>
	<li>החלף את המדיום שוב עם 500 μL של מדיום אינדוקציה לאחר 14 ימים. לאחר מכן, לתחזוקה שלאחר האינדוקציה של התאים, החלף את מדיום האינדוקציה ב- 500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה טרי מדי שבוע.</li>
</ol>5. אימונוציטוכימיה
<ol><li>הסר את המדיום משקופית התא בעלת 8 הקידוחים שנזרעו עם תאים בשלב 3.10 על ידי שאיפה ושטוף עם PBS (−).</li>
	<li>תקן את התאים למשך 20 דקות ב- RT עם 4% paraformaldehyde.</li>
	<li>הסר את מגיב הקיבוע ושטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−).</li>
	<li>חדרו את התאים עם PBS (−) המכיל 0.1% Triton X-100 ב-RT.</li>
	<li>דגרו על התאים החדירים, עם תמיסת חסימה (3% BSA/PBS (−)) למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור את התאים לילה עם נוגדנים ראשוניים (טבלה של חומרים) ב 4 ° C. הערה: כל הנוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה.</li>
	<li>שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−) במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>לדגור על התאים השטופים עם הנוגדנים המשניים המתויגים באופן פלואורסצנטי המתאימים למשך שעה אחת ב- RT (טבלה של חומרים).</li>
	<li>שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−) כדי להסיר את הנוגדנים המשניים.</li>
	<li>דגרו על התאים עם תמיסת DAPI (1:10,000) מדוללת ב-PBS (−) למשך 5 דקות ב-RT.</li>
	<li>שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−).</li>
	<li>הרכיבו את הבאר באמצעות מדיום ההרכבה ודמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>

פיתוח תאים דמויי מיקרוגליה הנגרמים על ידי דם לחקר הפרעות מוחיות בבני אדם

<ol><li>Steiner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+in+the+neurobiology+of+suicide%3A+elevated+microglial+density+in+schizophrenia+and+depression+is+associated+with+suicide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatr+Res%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide.</a> J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).</li>
<li>Setiawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+translocator+protein+total+distribution+volume+with+duration+of+untreated+major+depressive+disorder%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study.</a> Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).</li>
<li>Holmes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+translocator+protein+in+anterior+cingulate+in+major+depression+and+a+role+for+inflammation+in+suicidal+thinking%3A+a+positron+emission+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study.</a> Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).</li>
<li>Meyer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+psychiatric+disorders%3A+PET+imaging+and+promising+new+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets.</a> Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+ramified+microglia-like+cells+from+human+monocytes%3A+dynamic+microglial+dysfunction+in+Nasu-Hakola+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease.</a> Sci Rep. 4, 4957(2014).</li>
<li>Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Mattis, V. B., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+revolution+for+clinical+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology.</a> Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).</li>
<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+adult+mouse+resting+microglia+into+an+APC+is+promoted+by+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+interaction+with+Th1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells.</a> J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6 (10), e26317(2011).</li>
<li>Nandi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CSF-1+receptor+ligands+IL-34+and+CSF-1+exhibit+distinct+developmental+brain+expression+patterns+and+regulate+neural+progenitor+cell+maintenance+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation.</a> Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).</li>
<li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li>
<li>Yonemoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+mitochondrial+vulnerability+configurate+the+divergent+immunoreactivity+of+human+induced+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells.</a> Clin Immunol. 255, 109756(2023).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD206+expression+in+induced+microglia-like+cells+from+peripheral+blood+as+a+surrogate+biomarker+for+the+specific+immune+microenvironment+of+neurosurgical+diseases+including+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma.</a> Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibromyalgia+and+microglial+TNF-alpha%3A+Translational+research+using+human+blood+induced+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+CD206+gene+has+potential+as+a+state+marker+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder.</a> Front Immunol. 7, 676(2016).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+bipolar+disorder+with+AIF1+%28coding+gene+of+Iba-1%29+deletion%3A+A+pilot+in+vitro+analysis+using+blood-derived+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatry+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells.</a> Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).</li>
<li>Shirozu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+and+inflammatory+responses+in+human+induced+microglia-like+%28iMG%29+cells+from+patients+with+Moyamoya+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease.</a> Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).</li>
<li>Sellgren, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li>
<li>Sellgren, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+synapse+elimination+by+microglia+in+schizophrenia+patient-derived+models+of+synaptic+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning.</a> Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+induced+microglia-like+cells+%28iMG+Cells%29+for+future+studies+of+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases.</a> Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).</li>
<li>You, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+characterization+and+clinical+relevance+of+microglia-like+cells+derived+from+patients+with+panic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder.</a> Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).</li>
<li>Rocha, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+activation+in+basal+ganglia+is+a+late+event+in+Huntington+disease+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).</li>
<li>Sargeant, T. J., Fourrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocyte-derived+microglia-like+cell+models%3A+A+review+of+the+benefits%2C+limitations+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations.</a> Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).</li>
<li>Lannes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+microglia+cells+with+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus.</a> Virol J. 14 (1), 8(2017).</li>
<li>Ryan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+microglia-like+cellular+model+for+assessing+the+effects+of+neurodegenerative+disease+gene+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants.</a> Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).</li>
<li>Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+human+microglia+model%3A+characterization+of+human+monocyte-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia.</a> J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).</li>
<li>Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HHV-6A+infection+induces+amyloid-beta+expression+and+activation+of+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells.</a> Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).</li>
<li>Ormel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+characterization+of+the+molecular+phenotype+and+inflammatory+response+of+schizophrenia+patient-derived+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells.</a> Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+HIV-1+intron-containing+RNA+in+microglia+induces+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses.</a> J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).</li>
<li>Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+isolation+techniques+significantly+impact+the+phenotype+of+both+isolated+monocytes+and+derived+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro.</a> Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).</li>
<li>Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of human monocyte-derived macrophages.</a> Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טכניקות אנליטיות המשתמשות בתאי iMG עשויות לשמש ככלי מחקר רבי עוצמה לתרגום לאחור 5,6. כדי לייצר כמויות מספיקות של תאי iMG אנושיים, הנסיינים צריכים לתכנן את מחקריהם תוך התחשבות בנושאים מסוימים. דגימות דם שמקורן בבני אדם הן רגישות ביותר; כתוצאה מכך, הדגימות המתקבלות מצדיקות עיבוד מהיר, וטיפול קפדני כדי למנוע זיהום. באופן ספציפי, יש להפריד דגימות דם מיד לאחר לקיחת הדם ולא להשאיר ללא השגחה לפרקי זמן ממושכים. ניסויים מתחילים בדרך כלל בתוך 3 שעות מאיסוף הדם כדי לאשר את תקפותם; עם זאת, ניתן לאחסן דגימות דם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ-3 שעות ולהביא אותן לטמפרטורת החדר לפני תחילת פרוטוקולי ההפרדה.
כדי להבטיח תוצאות יציבות, מומלץ להשתמש בריאגנטים כגון מדיה תרבותית תוך חודש מרגע הסרת האיטום ולהשליך עם התפוגה. בעת הפרדת תאים חד-גרעיניים היקפיים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, ניתן לראות צבירת תאים בדגימות מסוימות. במקרים כאלה, יש לדלל את כל דגימת הדם עם PBS (−) כדי למנוע צבירה. במהלך השראת התמיינות למיקרוגליה, מדיום התרבית אינו מוחלף במשך 14 יום כדי למנוע גירוי מיותר של התאים. לאחר השלמת השראת ההתמיינות, החלפה בינונית בתווך טרי עשויה לשחזר את התאים המוחלשים ולשמור על כדאיות לזמן מה.
טכניקת iMG שנקבעה במחקר זה מציגה מגבלה; "התאים דמויי מיקרוגליה" שהושרו בניסוי דומים אך אינם זהים לחלוטין לתאי המיקרוגליאה האמיתיים במוח האנושי. בנוסף, מחקרים קודמים תיעדו מתודולוגיה להשראת תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם במונוציטים אנושיים, וקבוצות מחקר שונות הציעו פרוטוקולים ושמות נפרדים משלהם התלויים בשיטות iMG המקוריות28. לדוגמה, פרוטוקולים מסוימים משתמשים ב-M-CSF 29,30,31,32 או TGF-β 33, אשר דווח כי הם מקדמים פנוטיפ דמוי מיקרוגליה בתרביות מיקרוגליה שמקורן ב-iPSC או על ציפויים כגון Geltrex 24,34; גורמים אלה עשויים להיות יעילים לגרימת תאים דמויי מיקרוגליה.
לטכנולוגיית iMG המקורית יש יתרון הודות לפרוטוקול הפשוט והקל לשחזור שלה עם שני ציטוקינים בלבד וללא ציפויים, המאפשר מגוון ניסויים בתרגום לאחור באמצעות דם אנושי. לעומת זאת, ההתקדמות הטכנולוגית הקלה על פיתוחם של מוצרים רבים. שיטות הפרדה מגנטית כוללות ברירה חיובית מבוססת עמודות, בדומה לפרוטוקול שלנו, כמו גם ברירה שלילית ושיטות ללא עמודות. יתר על כן, במקום הפרדה מגנטית, ניתן לשקול שיטה חלופית של הפרדה באמצעות הדבקה פלסטית. ברירה חיובית מבוססת עמודות מבטיחה טוהר, אך הטכניקה גוזלת זמן, וגירוי על ידי חרוזים מגנטיים משפיע באופן משמעותי על התאים35. לעומת זאת, ברירה שלילית והיצמדות פלסטיק עשויות להזיק פחות לתאים; עם זאת, גישות אלה עשויות להיות פחות טהורות35,36. ייתכן שיהיה צורך בשינויים נוספים בהתבסס על פרוטוקולים אחרים בעתיד.
הממצאים הנ"ל מוכיחים כי היתרון העיקרי של טכנולוגיית iMG זו הוא משך הזמן הקצר שלה, מתודולוגיה חסכונית ויכולת לעבד מספר רב של דגימות למחקרים בעלי תפוקה גבוהה. לכן, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו כדי לרכוש ידע מדגימות אנושיות ולאחר מכן לבצע מחקרי אימות נוספים באמצעות מודלים שונים של בעלי חיים. יתר על כן, הממצאים המתקבלים מחקירות שנערכו על מודלים תאיים ובעלי חיים על ידי יישום טכניקת iMG עשויים להיות מועילים. בדרך זו, טכניקת iMG שלנו יכולה להיות מיושמת במחקר תרגומי דו-כיווני באופן ממיטה לספסל וספסל למיטה.

בשנים האחרונות הוצע כי דלקת במוח תופסת תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של הפרעות מוח ונוירופסיכיאטריות שונות; תאי המיקרוגליה הודגשו כתאים אימונומודולטוריים מרכזיים על ידי ניתוח מוח אנושי לאחר המוות וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) המבוססות על טכניקות הדמיה ביולוגית 1,2,3,4. ניתוחי הדמיה של המוח וה-PET לאחר המוות מגלים ממצאים משמעותיים; עם זאת, גישות אלה אינן יעילות במונחים של לכידת הפעילות המולקולרית הדינמית של תאי מיקרוגליה אנושיים במוח בשלמותם. לכן, נדרשות אסטרטגיות חדשניות כדי לאפשר הערכה מקיפה של תפקודי מיקרוגליאה אנושיים ותפקוד לקוי ברמה המולקולרית והתאית.
בשנת 2014, הנדסנו במקור טכניקה חדשנית לייצור תאים דמויי מיקרוגליה (iMG)המושרים ישירות 5,6, לפני הפרסום הראשון של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSC) שמקורם בתאי מיקרוגליה בשנת 20167. תוך שבועיים בלבד, המרנו בהצלחה מונוציטים אנושיים היקפיים בדם לתאי iMG על ידי מיטוב הציטוקינים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) ואינטרלוקין 34 (IL-34). כאשר פיתחנו טכניקה זו, שיטת התכנות מחדש החדשנית של השראת תאים עצביים מתאי iPS או פיברובלסטים רק החלה לשרור בעולם 8,9,10,11. עם זאת, באותו זמן, שיטה להשראת תאי מיקרוגליאה שמקורם ב- iPS עדיין לא דווחה, ויצירת מודל מיקרוגליאה אנושי שמקורו בתאים סומטיים היה רצוי. מאחר שציטוקינים כגון GM-CSF ו-IL-34, גורם מגרה מושבת מקרופאגים, דווחו כנחוצים להתפתחות ולתחזוקה של מיקרוגליה 12,13,14,15, שיערנו כי שילוב של ציטוקינים אלה יכול להיות מיושם ישירות כדי ליצור מודל תאי מיקרוגליאה ממונוציטים בדם. לבסוף, הצלחנו לפתח מודל של מיקרוגליה שמקורו במונוציטים על ידי שילוב GM-CSF ו- IL-345. בנוסף, חלק מהשילובים האלה של ציטוקינים משמשים גם כדי לגרום לתאי מיקרוגליה מתאי iPS 7,16 ומניחים שהם גורם חשוב ברכישת תכונות מיקרוגליה.
בניגוד לשיטות iPSC, תאי iMG אינם דורשים כל שינוי גנטי וניתן ליצור אותם בזמן קצר מאוד על ידי אינדוקציה כימית פשוטה, וכתוצאה מכך זמן נמוך יותר ועלויות כספיות. יתר על כן, תאי iMG אינם דורשים תכנות מחדש גנטי, ולכן אנו מאמינים כי תאי iMG הם תאים חלופיים חזקים להעריך לא רק את התכונות אלא גם את מצבי מיקרוגליה אנושיים. במאמר הראשוני על טכניקת iMG בשנת 2014, אישרנו כי תאי iMG מציגים פנוטיפ של מיקרוגליה אנושית, אשר יכול להיות שונה מונוציטים ומקרופאגים. לדוגמה, תאי iMG הציגו יחס ביטוי יתר של קולטן כימוקין CX3C 1 (CX3CR1) וקולטן כימוקין C-C מסוג 2 (CCR2) בהשוואה למונוציטים וסמנים אופייניים למיקרוגליה, כולל חלבון טרנסממברנה 119 (TMEM 119) וקולטן פורינרגי P2RY12 5,17. לאחרונה, אימתנו כי תאי iMG היקפיים שמקורם בדם דומים למיקרוגליה במוח בפרופיל ביטוי הגנים שלהם של סמנים מיקרוגליאליים ידועים באותו מטופל שעבר ניתוחי מוח18. תאי iMG ניתנים לניתוח עבור תפקודים דינמיים ברמה המולקולרית, כגון פגוציטוזה וייצור ציטוקינים, והם צפויים לפצות על החסרונות של חקר המוח לאחר המוות ומחקרי PET.
גילינו מנגנונים פתופיזיולוגיים דינמיים שלא היו ידועים בעבר המערבים מיקרוגליה בחולים שאובחנו עם מחלת Nasu-Hakola5, פיברומיאלגיה19, הפרעה דו קוטבית20,21, או מחלת Moyamoya22. יתר על כן, בהתבסס על המתודולוגיה המקורית שלנו, מעבדות שונות השתמשו בתאי iMG (מעבדות מסוימות ייעדו שמות חלופיים לתאים אלה) ככלי מחקר חיוני לתרגום לאחור 23,24,25,26,27. Sellgren et al. יצרו בהצלחה תאי iMG בהתאם להמלצות שלנו וערכו ניתוח microarray אשר גילה כי תאים אלה דומים מאוד מיקרוגליה המוח האנושי23. לאחרונה אישרנו את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין תאי מיקרוגליה ראשוניים במוח באמצעות ריצוף RNA18.
מחקר זה נועד לתעד את המתודולוגיה ליצירת תאי iMG מדם היקפי אנושי כדי להקל על מחקר תרגום לאחור המתמקד במחלות נוירופסיכיאטריות. טכניקה זו מציגה פוטנציאל ככלי אנליטי סביר שיכול לייצר ללא מאמץ מודלים תאיים מיקרוגליאליים בזמן קצר, אפילו במעבדות לא מצוידות שאין בהן מנגנון העברת גנים או כוח אדם מיומן.

<table><tbody><tr><td>0.1% טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>30-5140-5</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>נקלאי טסק</td><td>09154-14</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100x)</td><td>gibco</td><td>15240-062</td><td>מתואר כ"תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית"</td></tr><tr><td>, תמיסת שטיפה autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>מתואר כ"פתרון חיץ בסיסי" ומשמש ל"מאגר בידוד"</td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash; 049-601</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Sasalt Salt</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>מתואר כ-"PBS (&minus;)"</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>biowest</td><td>S1760-500</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם FCR אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash; 059-901</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227290</td><td>מתואר כ"צינור צנטריפוגה שיפוע צפיפות"עמודות</td></tr> <tr><td>MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>מתואר כ"עמודה מגנטית"</td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>מתואר כ"פתרון מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA)"MACS</td></tr> <tr><td>MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>מתואר כ"מעמד מגנטי"</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>נקלאי טסק</td><td>26253&ndash; 84</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td>מתואר כ"מדיה הרכבה"</td></tr> <tr><td>רקומביננטי אנושי GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-34</td><td>מו"פ D Systems</td><td>5265-IL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium + תוסף GlutaMAX (מדיום מוסף מראש)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>מתואר כ"מדיום אינדוקציה בסיסי"</td></tr> <tr><td>RPMI-1640</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30264-56</td><td></td></tr><tr><td><נוגדנים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים נגד P2RY12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>נוגדן ראשוני, ארנב, 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן נגד TMEM119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>נוגדן ראשוני, ארנב, 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן משני נספג IgG (H+L) עז נגד ארנב, Alexa Fluor 568</td><td>invitrogen</td><td>A-11011</td><td>נוגדן משני, ארנב, 1:1000</td></tr></tbody></table>

הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

Engineering of Human Blood-Induced Microglia-like Cells for Reverse-Translational Brain Research

מחקרים אחרונים שהשתמשו במודלים של בעלי חיים הדגישו את חשיבותם של תאי מיקרוגליה כמודולטורים אימונולוגיים חיוניים במחלות נוירופסיכיאטריות ופיזיות שונות. ניתוח מוח לאחר המוות והדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הן שיטות מחקר מייצגות המעריכות הפעלת מיקרוגליאה בחולים אנושיים; הממצאים חשפו את הפעלת תאי המיקרוגליה במוחם של חולים המציגים הפרעות נוירופסיכיאטריות שונות וכאב כרוני. עם זאת, הטכניקה הנ"ל רק מקלה על הערכה של היבטים מוגבלים של הפעלת מיקרוגליה. 
במקום ביופסיית מוח וטכניקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, פיתחנו בתחילה טכניקה ליצירת תאים דמויי מיקרוגליה המושרים ישירות (iMG) ממונוציטים אנושיים טריים בדם היקפי על ידי השלמתם עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים ואינטרלוקין 34 למשך שבועיים. תאי iMG אלה יכולים לשמש לביצוע ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים דינמיים בנוגע לקיבולת פגוציטית ושחרור ציטוקינים לאחר גירוי מתח ברמת התא. לאחרונה, ניתוח שעתוק מקיף שימש כדי לאמת את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין מיקרוגליה ראשונית במוח. 
תאי iMG שמקורם במטופל עשויים לשמש כסמנים חלופיים מרכזיים לחיזוי הפעלת מיקרוגליאה במוחות אנושיים וסייעו בחשיפת פתופיזיולוגיה דינמית שלא הייתה ידועה בעבר של מיקרוגליה בחולים עם מחלת Nasu-Hakola, פיברומיאלגיה, הפרעה דו קוטבית ומחלת Moyamoya. לכן, הטכניקה מבוססת iMG משמשת ככלי רב ערך לתרגום לאחור ומספקת תובנות חדשניות להבהרת הפתופיזיולוגיה המולקולרית של תאי מיקרוגליה במגוון מחלות נפשיות ופיזיות.

חשוב לציין, יש הטרוגניות רבה ברמת האדם וברמת התזמון בתווים של תאי iMG כולל מורפולוגיות וביטויי גנים. תאי iMG אצל אנשים מסוימים מקבלים מראה מסתעף (איור 1A), בעוד שבאחרים הם נשארים כדוריים (איור 1B). מאפייני iMG עשויים להיות שונים אפילו בתוך אדם יחיד, מה שהופך את תאי iMG ככלי מרכזי לזיהוי סמנים ביולוגיים של מצב המחלה. לעומת זאת, בחינת הבדלים בין-אישיים אלה מצדיקה צמצום טעויות טכניות. תאי iMG מוגדרים כמונוציטים המושרים עם GM-CSF ו- IL-34 למשך 14 יום לפחות. כדי למזער טעויות טכניות, מומלץ לתקנן את זמן האינדוקציה, להשתמש באותן כמויות של ריאגנטים ולהימנע משימוש בריאגנטים שפג תוקפם.
אימות של צביעה חיסונית גם מאשר שתאי iMG מבטאים סמנים מיקרוגליאליים, כולל P2RY12 ו-TMEM119 (איור 2). מחקרים קודמים הוכיחו כי המאפיינים המורפולוגיים וביטוי הגנים של תאי iMG קשורים לפתופיזיולוגיה של הפרעה דו קוטבית20,21. התאים המסועפים המוקדמים ביותר נצפו ביום 3 לאחר טיפול GM-CSF ו- IL-34, ותאי iMG במצב אופטימלי יכולים לשרוד יותר מחודש אחד כאשר שינוי בינוני נעשה פעם בשבוע. תאי iMG יכולים לשמש לניתוח ביטוי גנים. לדוגמה, תחת גירויים עם אינטרפרון גמא או IL-4, תאי iMG שינו את דפוס ביטוי הגנים, אשר יכול לשמש להערכה תפקודית של M1 ו- M2 מיקרוגליה מקוטבת 5,22. יתר על כן, חרוזי FITC מעוררים שינויים מורפולוגיים דמויי אמבואידים ומווסתים את הביטוי של TNFα וגנים אחרים5. יתר על כן, phagocytosis ניתן להעריך על ידי מדידת עוצמת פלואורסצנטיות של חרוזים 5,22. יתר על כן, מאחר שתאי iMG הם תאים בני קיימא, ניתן לצפות בתנועה הממשית שלהם ובשינויים המורפולוגיים שלהם על-ידי צילום תמונות תאים (איור 3) או באמצעות צילום בהילוך מהיר (וידאו 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig01.jpg"> איור 1: מורפולוגיה של תאי iMG. (A) iMG מסועף טיפוסי הציג גופי סומא זעירים ובטחונות מסועפים רבים. (B) דגימות מסוימות השתנו במראה כגון סוג האמבואיד. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig02.jpg"> איור 2: אימונוציטוסטאנינג של תאי iMG. תאי iMG מבטאים סמני מיקרוגליאה טיפוסיים: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig03.jpg"> איור 3: שינויים מורפולוגיים בתאי iMG. iMG משנים את המורפולוגיה שלהם במהלך תהליך האינדוקציה. בליטות התא מופיעות (A) סביב יום 3 ומתארכות בימים (B) 7 ו-(C) 14 עם התקדמות הזירוז. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: צילום קיטועי זמן של תאי iMG. נראה כי תא ה-iMG המסועף במרכז יצר קשר עם התאים הסובבים אותו תוך הארכה וכיווץ של תהליכיהם. יתר על כן, התא ביצע phagocytosis של תאים פגועים. מרווחי רכישת התמונה היו 46 שניות, וזמן הצילום היה כ -14 שעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/Mov.1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>
טבלה 1: הרכב הפתרונות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819_Table%201.zip" target="_blank">לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>

מחקר זה מתווה גישה חדשנית להקמת תאים דמויי מיקרוגליה (iMG) שמקורם במונוציטים אנושיים המאפשרים הערכה עקיפה של דלקת במוח. זה מציג מודל תאי שעשוי להועיל למחקר המתמקד בדלקת פוטנציאלית במוח ובהפרעות נוירופסיכיאטריות נלוות.

Recent investigations employing animal models have highlighted the significance of microglia as crucial immunological modulators in various ...

המעבדה שלנו באוניברסיטת קיושו נועדה להבהיר את התפקידים של תפקוד לקוי של מיקרוגליה בהפרעות נוירופסיכיאטריות שונות. אנו מאמינים כי טכנולוגיית תאי iMG שלנו תשפוך אור חדש על תפקוד דינמי של תאי מיקרוגליאה ותפקוד לקוי ברמה התאית בבני אדם מעבר למגבלות של ניתוח המוח האנושי, כגון מחקר לאחר המוות וגם מחקרי מוח לחיות מחמד. אפילו כיום, ניסויים בבעלי חיים חיוניים כדי להבהיר את הפתופיזיולוגיה המוחית של הפרעות נפשיות, אך לא ברור עד כמה ניתן ליישם נתוני מכרסמים על הפתופיזיולוגיה האנושית.טכנולוגיית תאי iMG הנגרמת על ידי דם אנושי שלנו תיצור פער בין נתוני מכרסמים, נתונים קליניים ותפקוד ו/או תפקוד לקוי של תאי מיקרוגליה. מודלים אחרים של מחלות תאיות שמקורן בבני אדם, תאי מיקרוגליה אנושיים שמקורם בתאי iPS מפותחים גם הם, אשר זקוקים לזמן רב וכסף רב כדי להתפתח ויכולים להעריך סמני תכונות אך לא סמני מצב. היתרון של שיטת iMG שלנו הוא שהיא הרבה יותר פשוטה, פחות גוזלת זמן וחסכונית.כבר חשפנו מספר גורמים מולקולריים מועמדים על ידי מחקר iMG התרגום ההפוך שלנו המתמקד בהפרעות נוירופסיכיאטריות כגון מחלת דמנציה, הפרעה דו קוטבית, פיברומיאלגיה, גליומה ומחלות. אנו מאמינים כי טכנולוגיית תאי iMG שלנו תשפוך אור חדש על תפקוד דינמי של תאי מיקרוגליאה ותפקוד לקוי ברמה התאית בהפרעות נוירופסיכיאטריות שונות.

engineering-human-blood-induced-microglia-like-cells-for-reverse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Parajuli, B., et.al. השתלת מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במוחם של עכברים בעלי יכולת חיסונית באמצעות נתיב טרנס-אף לא פולשני. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את ההשתלה הטרנס-אף של תאי מיקרוגליה אנושיים (iPSMG) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים למוח עכבר. היאלורונידאז מוחל על הנחיריים של עכבר מדולדל מיקרוגליה כדי לשפר את החדירות. תרחיף iPSMG ניתן דרך האף, והעכבר רשאי להתאושש. מדיה עשירה בגורמי גדילה ניתנת באופן קבוע כדי לתמוך בהישרדות iPSMG ברקמת המוח.

השתלה דרך האף של תאי מיקרוגליאה אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למוח העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

תאי מיקרוגליה הם תאי חיסון ייחודיים השוכנים ברשתית, וממלאים תפקידים מכריעים במחלות ניווניות שונות ברשתית. יצירת מודל תרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה יכולה להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה והתקדמות הפיתוח של מחלות רשתית.

הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד מוח אנושי עם מיקרוגליה תושבת על ידי שילוב תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) בהתפתחות אורגנואידים.

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

שיטה חדשה DC עצמאית לזירוז והרחבה של אנטיגן ספציפי לערמונית בתאי T מתואר. HLA-A2 איג תאים מלאכותיים הצגת מבוסס Antigen (aAPC) נטענים עם HLA-A2 פפטידים מוגבלת ביעילות להרחיב CTL הספציפיות אנטיגן מגוונים. טכנולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל גדול עבור חיסוני CTL מבוססי המאמצת.

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

חקור שיטה להנדסת תאים דמויי מיקרוגליה ממונוציטים אנושיים לחקר דלקת מוח והפרעות נוירופסיכיאטריות. מודל תאי זה מאפשר הערכה דינמית של תפקוד מיקרוגליה ומגשר על פערים בין נתוני חיות למחלה אנושית.

הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

גלה סרטונים נוספים