מיצוי וזיהוי של גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול במים ובדגים באמצעות בדיקות מיצוי סופגות בעלות קיבולת גבוהה ו-GC-MS

[קריין] בסרטון זה נדגים את תהליך המיצוי והזיהוי של גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול מדגימות מים ודגים באמצעות בדיקות מיצוי סופגות בעלות קיבולת גבוהה וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה של גז, או GC-MS. Geosmin ו-2-methylisoborneol הן תרכובות אורגניות נדיפות ממקור מיקרוביאלי המתרחשות בנחלים, בריכות, בארות או אפילו מערכות חקלאות ימית מחזוריות. תרכובות ריח אלו עלולות להעניק ריחות וטעמים לא נעימים למים ולדגים הגדלים בהם גם בריכוזים נמוכים במיוחד. כאן אנו רואים מדען אוסף מים ממערכת חקלאות ימית מחזורית. דגימות מים של Geosmin ו-2-methylisoborneol נאספות בבקבוקוני זכוכית חומים המדורגים ל-VOCs ללא אוויר בבקבוקון. לשם כך, טבלו וכסו את הבקבוקון מתחת למים כך שלא יישארו בועות אוויר. אנו מתחילים בהכנת הכיול והתקנים הפנימיים שלנו. ראשית, הכינו תמיסת מלאי המסומנת כ-C1 על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול בריכוז של 100 מיקרוגרם לליטר לבקבוק נפח של 100 מיליליטר. מלאו את הבקבוק עד לסימן עוצמת הקול במתנול בדרגת LC/MS. התוצאה היא תמיסה המכילה כל אנליט בריכוז של 10 מיקרוגרם לליטר. לאחר מכן, מכינים תקני כיול על ידי הוספת נפחים מוגדרים של תמיסת מלאי C1 לצלוחיות הנפח של 100 מיליליטר ומילוי לנפח במים נטולי יונים. חשוב להכין תקני כיול חדשים מדי יום, מכיוון שפתרונות אלה מתכלים ביותר. עבור התקנים הפנימיים, צור פתרון מלאי I1 על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 2-איזופרופיל-3-מתוקסי פירזין, הידוע גם בשם IPMP, לבקבוק נפחי של ליטר אחד מלא במתנול בדרגת LC/MS, מה שיוצר תמיסת מלאי של 10 מיליגרם לליטר. לאחר מכן הכינו תמיסה שנייה I2 על ידי הוספת מאה מיקרוליטר מתמיסת מלאי I1 לבקבוק נפח של מאה מיליליטר ומילוי במים נטולי יונים להשגת ריכוז של 10 מיקרוגרם לליטר. התחל בהנחת דגימת מים בקבוקונית אחת של 20 מיליליטר לתוך מגש הדגימה. שקלו 2.5 גרם נתרן כלורי והוסיפו אותו לכל בקבוקון דגימה. הוספת מלח משפרת את העברת הגאוסמין וה-MIB מהמים לחלל הראש. הוסף חמישה מיליליטר מדגימת המים לכל בקבוקון והעלה אותו ב-50 מיקרוליטר של התמיסה הסטנדרטית הפנימית I2. יש לכסות ולאטום כל בקבוקון מיד לאחר ההכנה כדי למזער את אובדן האנליטים. השלב הבא הוא מיצוי האנליטים. הנח את מגש הדגימה לתוך מחזיק מגש הדגימה האוטומטית והכן את שיטת המכשיר עם הגדרות המפתח הבאות: דגימה מוקדמת זמן תסיסה ב-10 דקות. פרמטרי דגימה: דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במהירות תסיסה של 400 סל"ד. ודא שאפשרות בדיקת Wash HiSorb מופעלת כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות. ספיגת בדיקה: הגדר למשך 15 דקות בחום של 270 מעלות צלזיוס. הגדרות מלכודת: טמפרטורת עומס מלכודת של 25 מעלות צלזיוס וקצב זרימה מפוצל של שמונה מיליליטר לדקה. לאחר קביעת הגדרות אלה, הפעל את הדגימה האוטומטית בשילוב עם שיטת GC-MS לניתוח דגימות מים. לניתוח רקמות דגים, הניחו בקבוקון אחד של 20 מיליליטר לכל דגימת דג למגש. הומוגניזציה של רקמת הדג באמצעות מעבד מזון ושקלו גרם אחד של הרקמה ההומוגנית לכל בקבוקון. הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת נתרן כלורי רוויה ועלה כל דגימה ב-100 מיקרוליטר של התמיסה הסטנדרטית הפנימית I2. יש לסגור ולאטום כל בקבוקון מיד. שיטת המיצוי של דגימות דגים דומה לזו של מים, אך עם הבדלים עיקריים בשל האופי העשיר בשומנים של רקמת הדגים. הבדלים אלה כוללים זמן תסיסה לפני הדגימה: הגדר ל-20 דקות. טמפרטורת הדגירה של הדגימה: 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במהירות תסיסה של 400 סל"ד. ודא שפונקציית הבדיקה Wash HiSorb מופעלת. לאחר השלמת שלבים אלה, הפעל את הדגימה האוטומטית בשילוב עם שיטת GC-MS לניתוח דגימות דגים, אותם פרמטרים של GC-MS חלים הן על שיטות מים והן על רקמות דגים. ה-GC מצויד בחמישה עמודי MS 30 מטר על 0.25 מילימטר על 0.25 מיקרון. הליום אולטרה-טהור משמש כגז המוביל, עם קצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. תוכנית התנור מתחילה בטמפרטורה התחלתית של 60 מעלות צלזיוס המוחזקת במשך שלוש דקות, ואחריה רמפת טמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס לדקה ל-100 מעלות צלזיוס, לאחר מכן 20 מעלות צלזיוס לדקה עד 190 מעלות צלזיוס, ו-30 מעלות צלזיוס לדקה עד 280 מעלות צלזיוס עם זמן המתנה סופי של שתי דקות. זמן הריצה הכולל הוא כ-16.5 דקות. עבור קו ההעברה בין ה-GC ל-MS, הגדר את הטמפרטורה ל-280 מעלות צלזיוס כאשר מקור היונים הוא 250 מעלות צלזיוס והרביעייה ב-200 מעלות צלזיוס. במצב MS לסריקה, השתמש בטווח של 50 עד 350 יחס מסה למטען. לניטור יונים נבחרים, או SIM, השתמש ביונים הבאים לכימות ואישור: IPMP, יחס מסה למטען 152 ו-137. MIB, יחס מסה למטען של 95 עד 107. ו-geosmin, יחס מסה למטען של 112 ו-55. לבסוף, בדוק תמיד ידנית את בחירות השיא בתוכנת הכרומטוגרפיה שלך כדי למנוע שגיאות. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לזיהוי גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול בדגימות מים ודגים תוך שימוש בבדיקות מיצוי ספיגה בעלות קיבולת גבוהה ו-GC-MS. על ידי ביצוע קפדני של הוראות אלה, חוקרים יכולים להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות בניתוח נוכחותן של תרכובות אלו. איור 1 מציג את ההשפעה של טמפרטורת הספיגה של הגשושית על ההעברה. תקן מעבדה המכיל גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול ב-20 ננוגרם לליטר נותח בשלוש טמפרטורות שונות של ספיגת בדיקה. לוח A מספק את אזורי השיא הממוצעים עבור geosmin ו-MIB. לאחר מכן כל בדיקה נספגה פעמיים נוספות באותה טמפרטורה התחלתית כדי להעריך את ההעברה. התוצאות עבור geosmin ו-MIB מוצגות בפאנלים B ו-C בהתאמה. העברה מתבטאת כאזור השיא כאחוז מאזור השיא ההתחלתי. פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן על פני שלושה שכפולים. התוצאות מצביעות על כך שטמפרטורת ספיגה גבוהה יותר ממזערת את ההעברה מבלי לפגוע ברגישות. איור 2 מייצג השוואה של שחזור נתונים מתוקנים לעומת לא מתוקנים עבור תקנים אנליטיים ב-15 ו-40 ננוגרם לליטר באמצעות בדיקות PDMS למיצוי. הדגימות תוקנו באמצעות שימוש ב-2-איזופרופיל-3-מתוקסי פיראזין, או IPMP, כתקן פנימי. ללא תיקון, ההתאוששות הייתה נמוכה משמעותית, עם תיקונים בכ-60% מהכמויות הידועות. לאחר התיקון, ההתאוששות הייתה קרובה ל-100%, מה שמדגים את החשיבות של שימוש בתקנים פנימיים לכימות מדויק. איור 3 משווה את נתוני ההתאוששות של גאוסמין משמאל ו-2-מתילאיזובורנול מימין ב-15 ננוגרם לליטר באמצעות שני סוגים של בדיקות: בדיקות PDMS בלבד ובדיקות תלת-פאזיות, הכוללות PDMS, דיווינילבנזן וטווח רחב של פחמן. שני סוגי הבדיקות מראים ביצועים טובים, אם כי לבדיקות PDMS בלבד היו שיעורי התאוששות מעט טובים יותר. בהתחשב בתוצאה זו ובחיסכון בעלויות, ניתוח עתידי נערך עם בדיקות PDMS בלבד. איור 4 מציג את הרגרסיה הליניארית של עקומות כיול עבור geosmin ו-MIB. הטווח המוצק מייצג גאוסמין עם ערך R בריבוע של 0.9999, והקו המקווקו מייצג MIB, גם הוא עם ערך R בריבוע של 0.9999. שתי העקומות מדגימות ליניאריות מצוינת עם שגיאה מינימלית, ומאמתות את הדיוק הכמותי של השיטה על פני טווח הריכוז שנבדק. איור 5 ממחיש את ריכוזי הגאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול בדגימות מים שנלקחו משבע מערכות חקלאות ימיות שונות. פאנל A מציג את ריכוזי הגאוסמין, ופאנל B מציג את ריכוזי ה-MIB. לכל מערכת היו לפחות שלושה שכפולים, וברוב המקרים, הריכוזים של תרכובות אלה היו מעל גבולות הזיהוי של השיטה. מערכת אחת, שתויגה כמערכת אחת, חרגה מסף הריח האנושי של גיאוסמין, מה שהדגיש בעיה פוטנציאלית באיכות המים במערכת זו. איור שש מספק נתונים משתי דגימות דגים, המסומנות F1 ו-F2, שהיו עם גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול. שתי התרכובות נותחו בשלוש עותקים כדי לקבוע התאוששות ודיוק. ריכוזי הגאוסמין וה-MIB ודגימות הדגים הדוקרניים משורטטים, ומדגימים את יכולתה של השיטה לזהות במדויק תרכובות אלה גם ברקמות דגים עשירות בשומנים. השיטות המתוארות היום מספקות מסגרת חזקה לזיהוי רגיש של גאוסמין ו-2-מתילאיזובורנול. באמצעות שילוב של בדיקות מיצוי סופגות בעלות קיבולת גבוהה וניתוח GC-MS מדויק, הדגמנו טכניקה המשפרת משמעותית את יכולות הזיהוי שלנו. התקדמות מתודולוגית זו לא רק משפרת את התפוקה אלא גם מפחיתה את הסיכון לטעויות אנוש ומגבירה את יכולת השחזור של התוצאות. ככל שנמשיך לחדד את הטכניקות הללו, הן ללא ספק יהפכו לכלים חיוניים בתחום הניטור הסביבתי והערכת איכות המזון.