Name: ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: למדו ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה ב-Nicotiana benthamiana. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת לוקליזציה של חלבונים PDLP5, TVCV MP ו-PDCB1 בתגובה לזיהומים ויראליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>חקר תפקוד פלסמודסמטה: מיקרוסקופ קונפוקלי של חלבונים ממוקדים

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מנוע ABT AC חד פאזי</td><td>BRANDTECH&</td><td>nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><<tr><td>em>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקרת זיהום&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II תערובת אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II תערובת אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>תוכנת GraphPad בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמונה J</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות והמעבדה למכשור</td><td></td><td></td>אופטי וחישובי</tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>מיני</td><td></td><td></td>צמחים</tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה</td><td>נב</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

כדי להקל על מחקרים של תפקוד פרקינסון בפיזיולוגיה של צמחים ובאינטראקציות עם פתוגנים, פותחו שלושה חלבוני ייחוס פשוטים ואמינים עבור לוקליזציה של פרקינסון. נבחרו שני חלבוני PD תאיים וחלבון MP שמקורו בפתוגן המקודד על ידי נגיף הצמח TVCV. הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים אלה הודגמה באמצעות כתב אוטופלואורסצנטי EGFP שהתמזג עם C-terminus של כל חלבון. בגישה חלופית, הודגמו פרקינסון באמצעות צביעה כחולה אנילין של משקעי קלוזה הקשורים למחלת פרקינסון. הניסויים הראו שגם PDLP5 וגם MP הפגינו לוקליזציה של PD מנוקב, כאשר MP גם ממוקם בגרעין התא (איור 1A), כפי שצוין קודם לכן25. לעומת זאת, PDCB1 נראה כמחלק בין PD ל-ER (איור 1A). עבור חוקרים פחות מנוסים בפענוח לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המתויגים ב-GFP, איור 1A גם מדגים את התבנית הנוקלאוציטופלזמית האופיינית של EGFP המתבטאת בתאי צמחים. כדי לאשר את אות ה-ER של PDCB1, ביטאנו יחד את PDCB1 עם סמן ER ומצאנו שהאות PDCB1 חופף לאות של סמן ה-ER (איור 1B). כדי להעריך את היעילות של לוקליזציה של PD של החלבונים שנבדקו, חושב אחוז התאים המבטאים את האות הפלואורסצנטי שהציג לוקליזציה של PD של אות זה (טבלה 1).
לצורך זיהוי לוקליזציה תת-תאית על ידי שימוש בחלבוני ייחוס, כדאי להבין את סקאלת הזמן של ביטוי חלבון הייחוס ואת השינויים האפשריים בלוקליזציה שלו. איור 2 מראה קינטיקה כזו עבור MP, PDLP5 ו-PDCB1 כאשר PD עצמם הודגמו על-ידי צביעה כחולה אנילין. הן MP והן PDLP5 החלו להצטבר ב- PD כבר ביום אחד לאחר החדירה (dpi), והצטברות זו הגיעה למקסימום הנראה לעין ב- 2 dpi, ונותרה יציבה במשך 5 ימים נוספים, ולאחר מכן עוצמת האות ירדה, ככל הנראה עקב פירוק חלבונים. מהלך הזמן של המיון התת-תאי PDCB1 היה מורכב יותר: עבור 3 dpi הראשונים, PDCB1 הציג אות ER חזק יחסית, אשר הסתיר כמעט לחלוטין לוקליזציה של אות ספציפי ל-PD, בעוד שב-5 dpi, האות האחרון נעשה בולט יותר (איור 2), אם כי בפחות תאים. באופן מעניין, הופעתה של תבנית הלוקליזציה הברורה של PDCB1 לאחר 5 dpi חפפה לירידה משמעותית במספר התאים המראים את אות ה-EGFP (איור משלים 1). לפיכך, PDLP5 ו-MP יכולים לתפקד כחלבוני ייחוס PD עם רקע מועט ברוב תאי התא האחרים, עם חלון זמן הדמיה אופטימלי של 2-5 dpi. PDCB1, לעומת זאת, אינו מתאים כמו סמן PD.
לאחר מכן אומת כי סמני PD שומרים על ספציפיות הלוקליזציה התת-תאית שלהם בנוכחות חלבוני PD אחרים. לשם כך, MP-EGFP או PDLP5-EGFP בוטאו יחד עם PD-לוקליזציה של26 MP של וירוס צמחי אחר, Tobacco mosaic virus (TMV) המתויג עם CFP. איור 3 מראה שבשני המקרים, החלבונים שקיבלו ביטוי משותף הציגו דפוס לוקליזציה ברור של פרקינסון. באופן דומה, צביעה היסטולוגית היסטולוגית ספציפית לאנילין כחול של רקמות המבטאות MP-EGFP או PDLP5-EGFP לא זיהתה הפרעה ללוקליזציה של PD של האותות הכחולים של EGFP ואנילין (איור 3).
מחקרי לוקליזציה של פרקינסון נהנים לעתים קרובות מהערכה כמותית יותר של הביטוי הכולל של חלבון הייחוס ואות הפרקינסון. גישת כימות זו מודגמת באיור 4 ובאיור 5. לצורך כימות הביטוי הכללי נמדדה עוצמת האות של PDLP5 ו-MP. שני החלבונים הראו אותות חזקים בכל נקודות הזמן של ההדמיה במהלך תקופת 10 dpi, עם עוצמת אות מקסימלית של 3 dpi עבור PDLP5 ושל 2 dpi עבור MP (איור 4). לא היו הבדלים מובהקים סטטיסטית בעוצמת האות בין PDLP5 ל-MP באף אחת מנקודות הזמן של ההדמיה החזותית. עוצמת האות PDCB1 הראתה תנודות גדולות יותר בין נקודות זמן, כאשר האות החזק ביותר נצפה ב-7 dpi (איור 4), אף על פי שהיה קשה לאסוף נתונים מובהקים סטטיסטית בנקודת זמן זו בשל המחסור בתאים מבטאים. לפיכך, 3 dpi הראשונים מייצגים את העיתוי האופטימלי לזיהוי ביטוי PDCB1. כצפוי, דגימות של צביעת כחול אנילין הציגו אות יציב יותר מאשר החלבונים המבוטאים באופן חולף (איור 4).
לאחר מכן כומתו PD puncta שנוצרו על ידי PDLP5 ו-MP. PDLP5 הראה מספר יציב של PD puncta לאורך תקופת התצפית, ללא הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שתיים מנקודות הזמן שנבדקו (איור 5). המספר הגבוה ביותר של PD puncta שנוצר על ידי MP זוהה ב 2 dpi, והם נשארו יציבים יחסית עד סוף תקופת התצפית. השוואת המספרים של PD puncta בין PDLP5 ו-MP לא גילתה הבדלים מובהקים סטטיסטית ברוב זמני הדגימה (איור 5). גם מספר PD puncta המוכתם בכחול אנילין נותר יציב, אם כי ירד מעט ועמד על 10 dpi. מספרי PD puncta המעוטרים בכחול אנילין, PDLP5 או MP היו דומים זה לזה עם מובהקות סטטיסטית (איור 5), בהתאם לספציפיות PD של סמנים אלה. המספרים של PD puncta עבור PDCB1 לא נותחו מאחר שבנקודות זמן מוקדמות יותר, אות PD הוסתר על-ידי אות המיון, ובנקודות זמן מאוחרות יותר, הוא נצפה רק בתאים מעטים יחסית (ראו איור 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> איור 1: לוקליזציה של פלסמודסמאטה (PD) של TVCV MP, PDLP5 ו-PDCB1 המתבטאת באופן ארעי בצביעת ניקוטיאנה בנטמיאנה ואנילין כחול של PD. (A) לוקליזציה של PD של MP-EGFP, PDLP5-EGFP ו-PDCB1-EGFP וצביעת אנילין. אות EGFP הוא בירוק, אות כחול אנילין הוא בכחול, ו autofluorescence plastid הוא באדום. (B) ביטוי משותף של MP-EGFP, PDLP5-EGFP ו-PDCB1-EGFP עם סמן הרשתית האנדופלסמית (ER) המתויג ב-mRFP. התמונות הוקלטו יומיים לאחר החדירה (dpi) והן מקטעים קונפוקליים בודדים המייצגים שני ניסויים עצמאיים (N = 20 תמונות משני צמחים). אות EGFP הוא בירוק, אות mRFP הוא בסגול, ו autofluorescence plastid הוא באדום. חיצים צהובים מציינים PDCB1 מקומי בחדר המיון. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> איור 2: מהלך הזמן של לוקליזציה של PD של TVCV MP, PDLP5 ו-PDCB1 המתבטא באופן ארעי ב-Nicotiana benthamiana ובצביעה כחולה אנילין של PD. התמונות הוקלטו ברזולוציה של 2 dpi והן מקטעים קונפוקליים בודדים המייצגים שני ניסויים עצמאיים (N = 20 תמונות מ-2 צמחים עבור כל המערכות, למעט 7 dpi ו-10 dpi עבור PDCB1-EGFP, שבהם פחות תאים הציגו את האות). אות ה-EGFP מסומן בירוק, והאות הכחול אנילין מופיע בכחול. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> איור 3: TVCV MP ו-PDLP5 שומרים על לוקליזציה של PD לאחר ביטוי משותף עם PD-localizing TMV MP ו-costaining עם כחול אנילין. התמונות הוקלטו ברזולוציה של 2 dpi והן מקטעים קונפוקליים בודדים המייצגים N ≥ 10 תמונות מ-4-6 צמחים. אות EGFP הוא בירוק, אות CFP ואות כחול אנילין הם בכחול, ואת autofluorescence plastid הוא באדום. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> איור 4: מהלך הזמן של עוצמת הפלואורסצנטיות של TVCV MP, PDLP5 ו-PDCB1 המתבטא באופן ארעי בצביעת PD כחול של ניקוטיאנה בנטמיאנה ואנילין. נתונים כמותיים נאספו מהניסויים המתוארים באיור 2. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע מניסויים מרובים. נקודות הנתונים הבודדות מסומנות כממוצע עבור כל מדידה. הבדלים בין ערכים ממוצעים המוערכים על ידי ANOVA דו-כיווני לבין מבחן ההשוואות המרובות של Tukey מובהקים סטטיסטית עבור ערכי P. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01 ו- ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001; NS, לא מובהק סטטיסטית. פסים כחולים, כתמי אנילין; עמודות ירוקות בהירות, MP-EGFP, עמודות ירוקות כהות, PDLP5-EGFP; פסים צהובים, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> איור 5: מהלך הזמן של היווצרות PD puncta על-ידי TVCV MP ו-PDLP5 מבוטא באופן ארעי ב-Nicotiana benthamiana ועל-ידי צביעה כחולה אנילין של PD. נתונים כמותיים נאספו מהניסויים המתוארים באיור 2. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע מניסויים מרובים. נקודות הנתונים הבודדות מסומנות כממוצע עבור כל מדידה. הבדלים בין ערכים ממוצעים המוערכים על ידי ANOVA דו-כיווני לבין מבחן ההשוואות המרובות של Tukey מובהקים סטטיסטית עבור ערכי P. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001. פסים כחולים, כתמי אנילין; פסים ירוקים בהירים, MP-EGFP, פסים ירוקים כהים, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">ניסוי א'</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>סה"כ תאים</td>
			<td>תאים עם לוקליזציה של PD</td>
			<td>תאים עם אות מעורב</td>
			<td>תאים עם לוקליזציה של PD (%)</td>
		</tr><tr><td>כחול אנילין</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">ניסוי 2</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>סה"כ תאים</td>
			<td>תאים עם לוקליזציה של PD</td>
			<td>תאים עם אות מעורב</td>
			<td>תאים עם לוקליזציה של PD (%)</td>
		</tr><tr><td>כחול אנילין</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: יעילות לוקליזציה של PD.
איור משלים 1: לוקליזציה של PD של TVCV MP, PDLP5 ו-PDCB1 המבוטאת באופן זמני ב-Nicotiana benthamiana. התמונות הוקלטו ברזולוציה של 5 dpi (A), 7 dpi (B) ו- 10 dpi (C). אות ה-EGFP הוא ירוק, והאוטופלואורסצנטיות של הפלסטיד אדומה. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

confocal-microscopy-analysis-protein-sorting-to-plasmodesmata

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

פרימורדיה של עלי תירס עטופה ומגולגלת עמוק, מה שמקשה על מחקרם. כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

למדו ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה ב-Nicotiana benthamiana. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת לוקליזציה של חלבונים PDLP5, TVCV MP ו-PDCB1 בתגובה לזיהומים ויראליים.

ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

גלה סרטונים נוספים